专利名称：石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及石墨烯材料，尤其是涉及石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用。
背景技术：
自Kary Mullis于1985年发明以来，聚合酶链反应(PCR)已经成为现代生命科学中一项DNA体外扩增的重要技术方法。PCR可以在几小时内用少量的DNA模板通过指数扩增的形式产生大量的目的DNA片段。然而，在此过程中经常会产生非特异性DNA片段，使 PCR效率降低。之前已有相关的报道，采用不同的添加剂来提高PCR的效率。但是由于不同的方法有不同的限制性条件，高效率的PCR扩增仍然是一个挑战。尽管存在争议，但是有报道称比表面积大、导热导电性能优良的材料可以显著地提高PCR的特异性。随着纳米技术的发展，纳米材料在表面和空间上的独特性能对生物大分子起到了显著的作用。因此，运用纳米材料优化PCR的条件具有十分重要的理论意义和应用前景。
石墨烯是一种二维的单原子层材料，SP2碳原子紧密排列成蜂窝状。(参见文献[9]A.K. Geim, K. S. Novoselov. The rise of graphene[J]. Nat. Mater. , 2007, 6:183-191 ；[10]C. G. Lee, X. D. Wei, J. ff. Kysar, et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergraphene[J]. Science, 2008, 321:385-388 ；[11]A.A.Balandin,S. Ghosh, ff. Z. Bao, et al.Superiorthermal conductivity of single-layer graphene[J]. Nano Lett. , 2008, 8:902-907 ； [ 12] S. V. Morozov, K.S.Novoselov, M. I.Katsnelson, et al.Giant intrinsic carrier mobilities in graphene and its bilayer [J]. Phys. Rev. Lett. , 2008, 100:016602.)石墨烯具有相当高的比表面积、良好的导电、导热性能，这些性能使其在生物技术领域有着广泛的应用。发明内容
本发明的目的在于提供石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用。
石墨烯在制备聚合酶链式反应增强剂中的应用。
所述石墨烯材料在聚合酶链式反应中的应用包括以下内容
I)石墨烯对于扩增质粒模板的聚合酶链式反应的作用。
所述石墨烯为化学氧化还原法制备的石墨烯；所述质粒是商品化的质粒；所述聚合酶链式反应是多轮聚合酶链式反应；所述作用是对聚合酶链式反应所扩增的产物的特异性增强的作用。
2)石墨烯对于扩增人的基因组模板的聚合酶链式反应的作用。
所述石墨烯为化学氧化还原法制备的石墨烯；所述基因组是从人体血液中提取的基因组DNA ;所述聚合酶链式反应是传统的聚合酶链式反应；所述作用是对聚合酶链式反应扩增产物的特异性增强作用。
3)石墨烯对于在广泛的退火温度下扩增人的基因组模板的聚合酶链式反应的作用。
所述石墨烯为化学氧化还原法制备的石墨烯；所述广泛的退火温度包括25°C到引物的退火温度之间；所述基因组是从人体血液中提取的基因组DNA ;所述聚合酶链式反应是传统的聚合酶链式反应；所述作用是对聚合酶链式反应所扩增的产物的特异性增强的作用。
本发明通过改进后的Hmnmers方法合成氧化石墨，然后利用水合肼合成石墨烯。以商品化的质粒为模板进行传统的聚合酶链式反应和多轮聚合酶链式反应，在低于的 HygmL-1浓度范围内，石墨烯均可增强聚合酶链式反应的特异性，甚至进行8轮聚合酶链式反应仍然可以得到特异性强的目的产物。以临床血样DNA为模板进行传统的聚合酶链式反应，加入石墨烯的PCR反应体系可以得到单一的特异性产物，并且加入石墨烯的反应体系在25°C到引物退火温度的范围内仍然可以得到特异性强的目的产物。加入石墨烯的扩增产物经过测序后证实并未对引物的序列和长度产生影响，因此石墨烯可以作为一种性能良好的聚合酶链式反应增强剂用于聚合酶链式反应中。
所述石墨烯增强剂与传统的PCR增强剂相比有以下优势
I)所述石墨烯材料合成方法简单，成本低，可以宏量制备。
2)所述石墨烯材料可以室温下长期稳定分散在水溶液中，不需要进行表面修饰， 也无需用稳定剂帮助其分散。
3)所述石墨烯材料对商品化的模板和临床样品提取的模板都具有增强作用，即表明其对模板的序列无选择性。
4)所述石墨烯材料对于多轮扩增的效果更加显著，能满足大量扩增的需要。
5)所述石墨烯材料可以在低于引物退火温度几十度的范围内得到特异性强的目的产物，降低了聚合酶链式反应对引物的退火温度的要求，简化引物设计的步骤。
6)所述石墨烯材料不会对产物的序列产生干扰，保证产物序列的准确性。
图I为石墨烯对于扩增质粒模板的经典聚合酶链式反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为 μ gmL 1 ο
图2是石墨烯对于扩增质粒模板的第二轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图3是石墨烯对于扩增质粒模板的第三轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图4是石墨烯对于扩增质粒模板的第四轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图5是石墨烯对于扩增质粒模板的第五轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图6是石墨烯对于扩增质粒模板的第六轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图7是石墨烯对于扩增质粒模板的第七轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker,C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图8是石墨烯对于扩增质粒模板的第八轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'
图9是石墨烯对于扩增人体基因组DNA模板的PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为 μ gmL 1。
图10为石墨烯对于扩增人体基因组DNA模板在不同退火温度下的PCR反应的作用。M表示DNAMarker，C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR 产物，单位为μ gmL—1，Tm表示PCR过程中采用的退火温度。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。
实施例I :将2g天然石墨粉和Ig硝酸钠在冰浴中与46mL浓硫酸混合，再加入6g 高锰酸钾，将混合液在冰浴中搅拌2h，然后转移至35±5°C油浴中反应30min，此时溶液呈棕褐色粘稠状，然后向混合液中缓慢加入92mL纯水，将温度升至95±5°C继续反应3h，混合液由棕褐色变成亮黄色，最后加入6mL质量分数为30%的H2O2溶液用以中和未反应的高锰酸钾，待上述溶液冷却至室温后抽滤并用纯水反复洗涤滤饼，60°C真空干燥过夜后得到氧化石墨。称取一定质量的氧化石墨分散到纯水中，超声5h使其完全溶解,再4000rpm/min 低速离心去除未剥离的氧化石墨，得到分散均一的氧化石墨烯(GO)溶液。取IOOmLl. Omg/ ml氧化石墨烯水溶液置于250mL的圆底烧瓶中，然后加入60 μ L80%的水合肼溶液和I.0mL28wt%氨水，搅拌混合均匀后将烧瓶转移至90±95°C的油浴中加热回流lh，反应过程中溶液的颜色由亮黄色逐渐变为黑色。待溶液冷却至室温后于纯水中透析过夜后除去未反应的水合肼即可得到水溶性还原石墨烯。使用前在紫外光源下照射30min，以避免污染酶。
实施例2 :自Novegan公司购得质粒DNA模板pET_32a，扩增目的产物长度为300bp。扩增所用引物序列为正向引物P15’ -GCC ATG GAT CAC AAG CAT CAT GAT CAC-3’，反向引物 P25’ -GCC TCG AGG CAG AAA CAG TCG CAG T。PCR 体系为 IXPCR buffer (20mMTris-HCl, pH8. 8，IOmM KCl, 16mM (NH4) 2S04, 2mM MgSO4, Γθ. 02mg mL^BSA, 0. l%TritonX-100)，0. 2mM dNTP,正向和反向引物各 0. 4 μ M，20ng μ Γ1 质粒 DNA, 0. IUμ L-1PfuDNA聚合酶，最终由氧化石墨烯或者还原石墨烯和灭菌后的双蒸水将体系体积补充到25μ1。在多轮PCR中，每一轮循环中的模板DNA由上一轮的0.4μ I PCR产物代替。PCR条件是1)94° C预变性5min，2)94° C变性30s，65° C退火30s，72° C延伸lmin，此步重复30次，3) 72° C再延伸lOmin。然后用I. 5%的EB染色的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像仪下观察到结果如图I 8所示。
图I为石墨烯对于扩增质粒模板的经典聚合酶链式反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为 μ gmL'从图中可以看出扩增产物的所有条带均为300bp，且未出现明显的非特异性条带拖尾现象，说明加入氧化石墨烯不影响引物与模板的准确结合。尽管没有明显的拖尾现象， 但是还能观察到微弱的非目的产物条带，表明在扩增的过程中还是产生了少量的非特异性产物，而这些非特异性产物会影响PCR产物的纯度，给后期的生物诊断和基因测序带来干扰，因此我们希望通过加入石墨烯减少这些非特异性条带，增强PCR产物的特异性。当加入的石墨烯浓度增加时，PCR产物的亮带的宽度变窄，表明PCR产物的产量有所降低。但是与对照相比，一些微弱的拖尾条带随着石墨烯加入量的增加逐渐消失，当石墨烯浓度达到 10 μ gmL-1时，可观察到那些非特异性条带完全消失，得到了单一的目的产物条带，当石墨烯浓度达到12 μ gmL—1时，不仅得到了单一的目的产物条带，而且产物的量高于石墨烯浓度为 10 μ gmL—1的PCR体系，当石墨烯浓度高于14 μ gmL—1时，PCR反应被抑制，得不到目的产物。 因此我们可以证明当石墨烯的浓度小于14μ gmL—1时，可以增强PCR产物的特异性。为了进一步验证石墨烯对PCR产物特异性的增强效果，在经典聚合酶链式反应的基础上开展多轮 PCR0由于在每一轮的扩增中都会产生非特异性产物，因此在多轮PCR中这些非特异性产物会和模板竞争与引物配对，进一步导致非特异性产物增多，目的产物减少，因此多轮PCR可以检验PCR增强剂对PCR反应的增强效果。
图2是石墨烯对于扩增质粒模板的第二轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL' 从图中2可以看出，没有加入石墨烯的对照组产物产生了非常明显的拖尾，而且还能看到很明显的引物二聚体条带，这是因为第二轮的DNA模板来自于第一轮PCR反应后未纯化的产物，这些产物中不但有扩增出的目的产物，而且还有未反应的基因组DNA、引物以及非特异性产物，所以在第二轮扩增中，上述这些物质会和模板发生竞争，导致引物和这些物质发生配对，形成更多的非特异性产物，此外多余的引物也会在3’端间相互错配扩增形成引物二聚体。加入2 8 μ gmL-1石墨烯后，发现拖尾现象减少，但是引物二聚体的量有所增加， 这主要是因为在第一轮扩增中随着石墨烯的加入，目的产物的产量有所降低，这也就导致了第二轮扩增的模板浓度降低，因此引物的量相对过高，即未参加扩增的引物易错配形成引物二聚体。当加入10 μ gmL—1石墨烯时，拖尾的现象已经相当微弱，引物二聚体的量也大大减少。当加入12μ gmL—1石墨烯时，拖尾现象已经观察不到，也没有观察到引物二聚体的产生，只得到了代表目的产物的单一条带。这表明石墨烯可以有效地抑制非特异性产物和引物配对，显著促进引物与模板的退火和延伸，保证PCR反应产物的特异性。
图3是石墨烯对于扩增质粒模板的第三轮PCR反应的作用。M为DNA Marker, C为不加入石墨烯的对照，数字为加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL'从图3中可看出，没有加入石墨烯的对照目的产物对应的条带非常弱，表示目的产物的量已经很少， 并且有很严重的拖尾现象，说明产生大量的非特异性产物，而且这些非特异性产物的存在已经破坏引物和正确模板的结合。扩增出的主要产物的分子量明显高于300bp，说明在扩增的过程中有很多非模板的片段和引物发生退火延伸，产生错误的扩增产物。这些错误的目的产物的量已明显超过目的产物的扩增量。在分别加入2 μ gmL—1和4μ gmL—1石墨烯后，发现目的产物的量有所增加，但是仍旧存在严重的拖尾现象，说明低浓度的石墨烯已经无法抑制非特异性反应的发生。当加入6μ gmL—1石墨烯时，仅观察到微弱的拖尾现象，并且产生的引物二聚体较少，说明在第三轮PCR反应中只要加入约6 μ gmL—1石墨烯，即可有效抑制非特异性反应发生。当加入8 μ gmL-1石墨烯时，同样观察到微弱的拖尾现象和少量的引物二聚体，但是代表目的产物的条带更亮，这说明目的产物的产量较加入6 μ gmL—1石墨烯的体系增加了。这种现象在加入10 μ gmL'12 μ gmL—1的体系中也可以观察到，当加入10 μ gmL—1 石墨烯时，不但拖尾现象减弱，引物二聚体的量也减少了，产物的产量较8μ gmL·1的体系也更多。当加入12μ gmL—1石墨烯时，没有拖尾现象，只得到单一目的产物，和微弱的引物二聚体带。
图4是石墨烯对于扩增质粒模板的第四轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C 表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL—1。从图4中可看出，未加入石墨烯的对照组和加入石墨烯浓度较低(2 μ gmL-1和4μ gmL4)的体系已经得不到目的产物，这主要是因为本轮的模板中错误模板的量远远超过了正确模板， 使得扩增过程中引物无法找到正确的模板与之结合，因此得不到目的产物。当加入6 μ gmL-1 石墨烯时，仅可以得到微弱的目的产物的条带，伴随的是严重的弥散条带，说明当进行第四轮PCR反应的时候加入6 μ gmL—1的石墨烯，已经不能抑制非特异性反应的发生。当加入 8 μ gmL—1石墨烯时，虽然有较多的引物二聚体和少量的拖尾，但还是得到了较多量的目的产物片段。说明在进行第四轮PCR反应时，加入约8 μ gmL-1石墨烯，即可有效抑制非特异性反应发生。当加入10 μ gmL—1石墨烯时，虽然引物二聚体的量增加，但是目的片段的量也随之增加。当加入12 μ gmL—1石墨烯时，目的产物的量较加入10 μ gmL—1石墨烯的体系没有明显增加，但是弓I物二聚体的量却明显减少。
图5是石墨烯对于扩增质粒模板的第五轮PCR反应的作用。M为DNA Marker, C 为不加入石墨烯的对照，数字为加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL—1。从图5 中可以看出，没有加入石墨烯的对照组和石墨烯浓度分别为2 μ gmL'4 μ gmL-1和6μ gmL—1 的体系已经得不到目的产物。加入8 μ gmL-1石墨烯后，虽伴随有大量的弥散条带，但可以得到明显的目的产物，加入lOygmL—1石墨烯后，目的产物的产量明显增多，特异性增强，加入 Uygmr1石墨烯后，仍旧可以得到单一的目的产物条带，引物二聚体量非常少。这说明在在进行第五轮PCR反应时，加入约8 10 μ gmL—1石墨烯，可有效抑制非特异性反应发生。
图6是石墨烯对于扩增质粒模板的第六轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL' 从图6中可以看出，没有加入石墨烯的对照组和加入2 10 μ gmL—1的体系已经得不到目的产物，这是因为每轮PCR反应要进行34个循环，即扩增的倍数是234，在进行完六轮PCR反应后，原始模板已经扩增了 22°4倍，每一轮PCR反应都会产生非特异产物，因此在进行六轮反应时已经累积了大量的非特异性产物，所以要得到目的产物，扩增的难度非常大。但是加入12 μ gmL—1石墨烯后，仍旧得到了清晰的目的产物条带，这说明在进行第六轮PCR反应时， 加入约12 μ gmL—1石墨烯，可有效抑制非特异性反应发生。
图7是石墨烯对于扩增质粒模板的第七轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL' 从图7中可看出，没有加入石墨烯的对照组和石墨烯浓度为2 10 μ gmL—1的体系依旧得不到目的产物，加入12 μ gmL-1石墨烯后，虽然产生大量的非特异性产物，但是依旧可以得到所要扩增的目的产物。这表明加入12 μ gmL-1石墨烯，在第七轮PCR反应中仍然可以抑制非特异性反应发生，得到目的产物。
图8是石墨烯对于扩增质粒模板的第八轮PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为μ gmL' 从图8中可以看出，没有加入石墨烯的对照组和石墨烯浓度为2 10 μ gmL-1的体系依旧得不到目的产物，加入12 μ gmL-1石墨烯后，产生大量的非特异性产物，虽然目的产物的条带很弱，但是依旧可以得到所要扩增的目的产物。这表明加入12 μ gmL—1石墨烯后，可以在第八轮PCR反应中得到目的产物。多轮PCR反应说明当石墨烯的浓度低于12 μ gmL—1时，加入石墨烯的PCR体系在进行八轮PCR反应后仍然可以得到目的产物，石墨烯可以显著的抑制非特异反应的发生，有效促进正确模板与引物结合，得到特异性强的目的产物。
实施例3 :人类基因组模板采自志愿者血液，用于扩增线粒体位于12sRNA 和16sRNA区域内的一段794bp的DNA片段。扩增引物为正向引物5’-AAC TAC GAT AGC CCT TATGAA-3，，反向引物 5’ -GGC CTACTATGG GTG TTAAA-3，。PCR 体系为 IXP CRbuffer (20mMTri s-HCl, ρΗ8· 8，IOmM KCl, 16mM (NH4) 2S04, 2mM MgSO4,广0. 02mg mL^BSA, 0. l%TritonX-100)，0. 2mM dNTP,正向和反向引物各 0. 4 μ M，20ng μ Γ1 基因组 DNA, O. IUyr1Pfu DNA聚合酶，最终由氧化石墨烯或者还原石墨烯和灭菌后的双蒸水将体系体积补充到25yL。PCR条件是1)94° C预变性5min，2) 94° C变性45s，52° C退火 45s，72° C延伸90s，此步重复34次，3) 72° C再延伸lOmin。然后用I. 5%的EB染色的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像仪下得到观察结果如图9所示。
图9是石墨烯对于扩增人体基因组DNA模板的PCR反应的作用。M表示DNA Marker, C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR产物，单位为 μ gmL'在图I 8中证明了石墨烯可以显著增强以质粒模板为扩增对象的PCR反应，因为质粒是商品化的产品，通用性更强，但是PCR反应还经常使用一些临床样品作为实验对象， 因此选取人的基因组作为模板，扩增线粒体DNA的一段长约为794bp的片段。因为相对于需要扩增的产物，基因组模板非常大，所以引物容易与模板中非扩增区域的片段发生互补结合，所以更易于产生非特异性产物。从图9中可看出，没有加入石墨烯的对照组在得到目的片段的同时伴随有弥散的非特异性条带产生，目的产物的特异性不高。随着石墨烯的加入，弥散条带逐渐减少，产物的特异性增强，当石墨烯的浓度达到8 μ gmL—1时，非特异性的弥散条带消失，只得到对应目的产物的条带，在石墨烯的浓度为10μ gmL—1时，可观察到同 8 μ gmL—1体系一样的现象。石墨烯的浓度继续增大，PCR反应被抑制。这说明对于临床样品的PCR反应，石墨烯在低于10 μ gmL—1的浓度范围内依然可以增强产物的特异性，从另一方面说明石墨烯对PCR反应特异性增强的效果与模板的来源和序列无关，因此这种PCR增强剂的适用性更广。
实施例4 :在不同退火温度下的PCR反应中，模板为人类基因组DNA模板，片段长度794bp。扩增引物为正向引物5’-AAC TAC GAT AGC CCT TAT GAA-3’，反向引物 5，-GGCCTA CTA TGG GTG TTA AA-3，。PCR 体系为 IXPCR buffer (20mM Tris-HCl, pH8. 8，IOmMKCl, 16mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, Γθ. 02mg mL^BSA, 0. l%TritonX-100), 0. 2mM dNTP, 正向和反向引物各0.4 μ M，20ng μ L—1基因组DNA, 0. IU μ I-1Pfu DNA聚合酶，最终由还原石墨烯和灭菌后的双蒸水补充到25 μ L。PCR条件是1)94° C预变性5min，2)94° C变性 45s, T° C退火45s，72。C延伸90s，此步重复34次，3) 72° C再延伸lOmin。！1。C分别为45° C，40° C，35° C，30° C，25° C然后用I. 5%的EB染色的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，在凝胶成像仪下得到观察结果如图10所示。
图10为石墨烯对于扩增人体基因组DNA模板在不同退火温度下的PCR反应的作用。M表示DNA Marker，C表示不加入石墨烯的对照，数字表示加入相应浓度的石墨烯的PCR 产物，单位为μ gmL'Tm表示PCR过程中采用的退火温度。扩增片段所用的引物的退火温度根据Primer5. O软件算得为52°C。根据图9石墨烯对PCR产物特异性增强的效果，选取石墨烯的浓度为10μ gmL—1，在不同的退火温度下观察产物的情况。分别选取52°C、45°C、 40°C、35°C、30°C、25°C设为PCR反应的退火温度进行PCR反应。从图10中可观察到在引物的理论Tm52°C反应时，尽管产生很多非特异性产物，但对照组可得较多的目的产物，加入石墨烯后的PCR体系避免那些非特异性反应的发生，得到较纯净的目的片段。当Tm降为45°C 时，对照组目的产物的量明显减少，弥散条带和引物二聚体的量较52°C时更多，加入石墨烯后目的产物的量较对照组增多，但是由于Tm值降低的缘故，引物可以和非互补的DNA模板链轻易结合，因此非特异性反应发生的几率也增加了，随之非特异性产物的产量也就增多。 当Tm值降为40°C、35°C、30°C、25°C时，对照组已经无法得到目的产物，但是加入石墨烯的 PCR体系依旧可以得到条带清晰的目的产物。这就说明加入石墨烯的体系可以不需要严谨的引物的退火温度的条件下就能扩增得到目的产物，这个温度范围为25°C到引物的退火温度之间。
实施例5 :人类血液基因组PCR产物纯化采用的是OMEGA的E. Z. N. A. Cycle-Pure DNA纯化试剂盒。DNA纯化前先用Buffer GPS平衡硅胶柱。吸取200 μ L Buffer GPS平衡缓冲液至Hibind DNA硅胶柱中，室温下放置5min，以12000 Xg转速离心2min，倒弃收集管中滤液，将Hibind DNA硅胶柱重新装入收集管，加入700 μ L灭菌水至硅胶柱中， 按上述条件离心，倒弃滤液并将Hibind DNA硅胶柱重新装入收集管，即硅胶柱平衡好。在纯化前，先将DNAWash Buffer用80mL无水乙醇稀释。将PCR产物移取至I. 5mL离心管中，加入4-5倍体积的Buffer CP,涡旋混合均匀后移至平衡好的Hibind DNA硅胶柱中，室温下以 IOOOOXg转速离心lmin,倒弃收集管中的液体并将Hibind DNA娃胶柱放回收集管。加入 700 μ L WashBuffer,室温下以IOOOOXg转速离心lmin,倒弃收集管中的液体并将Hibind DNA硅胶柱放回收集管，此步骤重复2次，倒弃收集管中的液体，室温下以13000Xg转速离心2min,彻底去除Wash Buffer。将Hibind DNA娃胶柱放入洁净的I. 5mL离心管中，加入 20 μ L灭菌水，室温静置2min，IOOOOXg离心Imin，离心管中溶液即为纯化后的PCR产物。 于-20°C冰箱内储存备用。
实施例6 :纯化后的PCR产物采用双向测序法，准备待测序的PCR产物10 μ L，上游引物和下游引物各10 μ L。测序工作由上海生工生物工程有限公司进行，测序结果用 DNAStar软件进行分析，最终得到以下的分析结果。
对扩增后的794bp的DNA测序的结果如下
SeqlAACTACGATA-GCCCTTATGAAACTTAAGGGTCGAAGGTGGATTTAGCAGTAAACTAAGAGT
Seq2AACTAGGAAT-ACCCTTATGAAACTTAAGGGTCGAAGGTGGATTTAGCAGTAAACTAAGAGT
Seq3TATTGAGATATAACCCTTATGAAACTTAAGGGTCGAAGGTGGATTTAGCAGTAAACTAAGAGT
SeqlAGACTGCTTAGTTGAACAGGGCCCTGAAGCGCGTACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAG
Seq2AGAGTGCTTAGTTGAACAGGGCCCTGAAGCGCGTACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAG
Seq3AGAGTGCTTAGTTGAACAGGGCCCTGAAGCGCGTACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAG
SeqlTATACTTCAAAGGACATTTTAACTAAAACCCCTACGCATTTATATAGAGGAGACAAGTCGT
Seq2TATACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACCCCTACGCATTTATATAGAGGAGACAAGTCGT
Seq3TATACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACCCCTACGCATTTATATAGAGGAGACAAGTCGT
SeqlAACATGGTAAGTGTACTGGAAAGTGCACTTGGACGAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAG
Seq2AACATGGTAAGTGTACTGGAAAGTGCACTTGGACGAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAG
Seq3AACATGGTAAGTGTACTGGAAAGTGCACTTGGACGAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAG
SeqlCACCCAACTTACACTTAGGAGATTTCAACTTAACTTGACCGCTCTGAGCTAAACCTAGCC
Seq2CACCCAACTTACACTTAGGAGATTTCAACTTAACTTGACCGCTCTGAGCTAAACCTAGCC
Seq3CACCCAACTTACACTTAGGAGATTTCAACTTAACTTGACCGCTCTGAGCTAAACCTAGCC
SeqlCCAAACCCACTCCACCTTACTACCAGACAACCTTAGCCAAACCATTTACCCAAATAAAGT
Seqq2CCAAACCCACTCCACCTTACTACCAGACAACCTTAGCCAAACCATTTACCCAAATAAAGT
Seq3CCAAACCCACTCCACCTTACTACCAGACAACCTTAGCCAAACCATTTACCCAAATAAAGT
SeqlATAGGCGATAGAAATTGAAACCTGGCGCAATAGATATAGTACCGCAAGGGAAAGATGAAA
Seq2ATAGGCGATAGAAATTGAAACCTGGCGCAATAGATATAGTACCGCAAGGGAAAGATGAAA
Seq3ATAGGCGATAGAAATTGAAACCTGGCGCAATAGATATAGTACCGCCAAGGGAAAGATGAAA
SeqTlAATTATAACCAAGCATAATATAGCAAGGACTAACCCCTATACCTTCTGCATAATGAATTA
Seq2AATTATAACCAAGCATAATATAGCAAGGACTAACCCCTATACCTTCTGCATAATGAATTA
Seq3AATTATAACCAAGCATAATATGCAAGGACTAACCCCTATACCTTCTGCATAATGAATTA
SeqlACTAGAAATAACTTTGCAAGGAGAGCCAAAGCTAAGACCCCCGAAACCAGACGAGCTACC
Seq2ACTACAAATAACTTTGCAAGGAGAGCCAAAGCTAAGACCCCCGAAACCAGACGAGCTACC
Seq3ACTAGAAATAACTTTGCAAGGAGAGCCAAAGCTAAGACCCCCGAAACCAGACGAGCTACC
SeqlTAAGAACAGCTAAAAGAGCACACCCGTCTATGTAGCAAAATAGTGGGAAGATTTATAGGT
Seq2TAAGAACAGCTAAAAGAGCACACCCGTCTATGTAGCAAAATAGTGGGAAGATTTATAGGT
Seq3TAAGAACAGCTAAAAGAGCACACCCGTCTATGTAGCAAAATAGTGGGAAGATTTATAGGT
SeqlAGAGGCGACAAACCTACCGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAAGATAGAATCTTAGTTC
Seq2AGAGGCGACAAACCTACCGAGCCGGTGATAGCTGGTTGTCCAAGATAGAATCTTAGTTC
Seq3AGAGGCGACAAACCTACCGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAAGATAGAATCTTAGTTC
SeqlAACTTTAAATTTGCCCACAGAACCCTCTAAATCCCCTTGTAAATTTAACTGTTAGTCCAAAG
Seq2AACTTTAAATTTGCCCACAGAACCCTCTAAATCCCCTTGTAAATTTAACTGTTAGTCCAAAG
Seq3AACTTTAAATTTGCCCACAGAACCCTCTAAATCCCTTTGTAAATTTAACTGTTAGTCCTACA
SeqlAG—GAACAGCTCTTTGGACACTAGGAAAAAACCTTGTAGAGAGAG
Seg2AG—GAACAGCTCTT-GGACACTATAAATACGCACGCGAGCACC
Seg3AGAGTGAACAGCTCTTAGTCGACTATAACTACGCATGAGAACCGCAG
PCR产物经纯化后采用双向测序，由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，采取下游测序结果进行说明。Seql是标准序列，来源于NCBI ；Seq2是对照组的序列；Seq3是加入10 μ gmL—1石墨烯的产物序列。黄色标注区域为引物结合区域，因此出现基因的错配属于正常情况，大部分的结果与标准序列相符，这表明在PCR体系中加入石墨烯并不会影响 PCR产物的长度和碱基序列，因此表明石墨烯不但可以增强PCR产物的特异性，而且不会影响产物的序列，那么石墨烯扩增的特异性强的PCR产物也可以用来基因分析和诊断。
权利要求
1.石墨烯在制备聚合酶链式反应增强剂中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述石墨烯对于扩增质粒模板的聚合酶链式反应的作用，所述石墨烯为化学氧化还原法制备的石墨烯；所述质粒是商品化的质粒；所述聚合酶链式反应是多轮聚合酶链式反应；所述作用是对聚合酶链式反应所扩增的产物的特异性增强的作用。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述石墨烯对于扩增人的基因组模板的聚合酶链式反应的作用，所述石墨烯为化学氧化还原法制备的石墨烯；所述基因组是从人体血液中提取的基因组DNA ;所述聚合酶链式反应是传统的聚合酶链式反应；所述作用是对聚合酶链式反应扩增产物的特异性增强作用。
4.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述石墨烯对于在广泛的退火温度下扩增人的基因组模板的聚合酶链式反应的作用，所述石墨烯为化学氧化还原法制备的石墨烯；所述广泛的退火温度包括25°C到引物的退火温度之间；所述聚合酶链式反应是传统的聚合酶链式反应；所述作用是对聚合酶链式反应所扩增的产物的特异性增强的作用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述基因组是从人体血液中提取的基因组 DNA。
全文摘要
石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用，涉及石墨烯材料。通过改进后的Hummers方法合成氧化石墨，利用水合肼合成石墨烯。以质粒为模板进行聚合酶链式反应和多轮聚合酶链式反应，在低于14μgmL-1内，石墨烯均可增强聚合酶链式反应的特异性，甚至进行8轮聚合酶链式反应仍可得特异性强的目的产物。以临床血样DNA为模板进行聚合酶链式反应，加入石墨烯的PCR反应体系可得单一的特异性产物，加入石墨烯的反应体系在25℃到引物退火温度的范围内仍可得特异性强的目的产物。加入石墨烯的扩增产物经测序后证实并未对引物的序列和长度产生影响，石墨烯可作为一种性能良好的聚合酶链式反应增强剂用于聚合酶链式反应中。
文档编号C12N15/10GK102978201SQ20121057046
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者孙莉萍, 胡楠, 贾静, 翁建 申请人:厦门大学