Hat半固体筛选培养基以及杂交瘤细胞的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种HAT半固体筛选培养基，每100mL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成：2mL的50×HAT贮存液、20mL的胎牛血清、1mL的100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1mL的100×B细胞刺激因子溶液、2mL的50×杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、1mL的100×异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基。本发明还公开了一种使用HAT半固体筛选培养基的杂交瘤细胞的筛选方法，融合细胞在半固体培养基上呈集落生长，彼此分离，每个克隆由单个细胞形成，避免了不分泌抗体的杂交瘤生长很快而影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长，与传统的有限稀释法相比，筛选效率较高。
【专利说明】HAT半固体筛选培养基以及杂交瘤细胞的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，特别是涉及一种HAT半固体筛选培养基以及使用HAT半固体筛选培养基的杂交瘤细胞的筛选方法。
【背景技术】
[0002]单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合时，B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏中分离出来的，骨髓瘤细胞是经过诱变和筛选得到的缺陷型，其本身不能分泌抗体；并且是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型，不能在含有次黄嘌呤(hypoxanthine H)、氨基蝶呤(aminopterin, A)、胸腺嘧唳(thymidine T)的筛选培养基(HAT)中存活。在融合后的细胞群中，未融合的脾细胞和相互融合的脾细胞，不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的骨髓瘤细胞和融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活下来，所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。
[0003]一个脾脏中，能分泌抗体的细胞占的比例很少，90%以上的细胞是不能分泌抗体的。即使进行了人工免疫，能分泌出针对人工免疫的抗原的抗体的细胞比例也是很低的，并且两个细胞的融合是随机的，因此，尽管一个成功免疫的脾脏可达到2X IO8个细胞以上，但细胞融合后能得到目 标杂交瘤的数量也是很有限的，如何筛选克隆出这些能分泌目的抗体的杂交瘤细胞是一个非常关键的问题。
[0004]杂交瘤细胞的克隆化是单克隆抗体制备过程中工作量最大的部分，实验室传统的克隆化方法为有限稀释法，该法需要多次进行有限稀释获得单克隆杂交瘤，耗时较长，在克隆化之前一些不分泌抗体的杂交瘤往往生长很快，影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长易导致阳性克隆丢失，筛选效率较低。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种筛选效率较高的HAT半固体筛选培养基以及杂交瘤细胞的筛选方法。
[0006]一种HAT半固体筛选培养基，每IOOmL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成:2mL的50\撤1'贮存液、201^的胎牛血清、11^的100X青霉素和链霉素的双抗溶液、ImL的100XB细胞刺激因子溶液、2mL的50X杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、ImL的100X异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基；
[0007]所述甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1:1的2XDMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀得到。
[0008]在一个实施例中，所述2 X DMEM培养基通过如下操作制备:将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节pH值为7.0-7.2，最后通过0.22 um滤膜过滤除菌，得到所述2 X DMEM培养基。
[0009]在一个实施例中，所述4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备:称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4%的甲基纤维溶液。
[0010]一种杂交瘤细胞的筛选方法，包括如下步骤:
[0011]步骤一、按照体积比为1:1将2XDMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀，得到甲基纤维素半固体培养基；
[0012]步骤二、配制HAT半固体筛选培养基,每IOOmL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成:2mL的50XHAT贮存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和链霉素的双抗溶液、ImL的100XB细胞刺激因子溶液、2mL的50X杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、ImL的100X异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基；
[0013]步骤三、将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后,用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液，将所述细胞悬液加入到预热至35°C~38°C的步骤二得到的HAT半固体筛选培养基中混匀，37°C静置并排除气泡后倒入平皿中，置于37°C、5%C02的孵育箱培养；
[0014]步骤四、步骤三得到的细胞在37°C、5%C02的孵育箱培养10-14天，待所述平皿中长出肉眼可见克隆集落时，在荧光显微镜下对周围具有强荧光信号的阳性细胞团分别进行标记，然后在显微镜下将已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为所述杂交瘤细胞。
[0015]在一个实施例中，步骤一中，所述2 XDMEM培养基通过如下操作制备:将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节pH值为7.0-7.2，最后通过0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到所述2 X DMEM培养基。
[0016]在一个实施例中，步骤一中，所述4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备:称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4%的甲基纤维溶液。
[0017]在一个实施例中，步骤二中所述的抗原为可偶联异硫氰酸素的可溶性蛋白。
[0018]在一个实施例中，步骤三中所述的HAT液体培养基的由如下成分组成=IXDMEM培养基、20%的胎牛血清和1XHAT。
[0019]在一个实施例中，步骤四还包括在所述将已标记的阳性克隆挑出后，对所述阳性克隆进行确认的步骤，包括如下操作:将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，取上清对阳性克隆进行确认。
[0020]在一个实施例中，所述对阳性克隆进行确认的操作中，采用ELISA的方法对阳性克隆进行确认。
[0021]这种杂交瘤细胞的筛选方法使用HAT半固体筛选培养基，融合细胞在半固体培养基上呈集落生长，彼此分离，每个克隆由单个细胞形成，避免了不分泌抗体的杂交瘤生长很快而影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长，与传统的有限稀释法相比，筛选效率较高。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为一实施方式的杂交瘤细胞的筛选方法的流程图。【具体实施方式】
[0023]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0024]一实施方式的HAT 半固体筛选培养基，其中，每IOOmL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成:2mL的50XHAT贮存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和链霉素的双抗溶液、ImL的100XB细胞刺激因子溶液、2mL的50X杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、ImL的100X异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基。
[0025]甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1:1的2XDMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀得到。
[0026]2XDMEM培养基通过如下操作制备:将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着用盐酸或氢氧化钠调节pH值为7.0-7.2，最后通过0.22 um滤膜过滤除菌，得到所述2 XDMEM培养基。
[0027]4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备:称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4%的甲基纤维溶液。
[0028]一实施方式的杂交瘤细胞的筛选方法，如图1所示，步骤如下。
[0029]S10、按照体积比为1:1将2XDMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀，得到甲
基纤维素半固体培养基。
[0030]2XDMEM培养基通过如下操作制备:将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着用盐酸或氢氧化钠调节pH值为7.0-7.2，最后通过
0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到2 XDMEM培养基。
[0031]DMEM粉末购自Gibco公司，货号为12800-017。
[0032]4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备:称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到4%的甲基纤维溶液。
[0033]甲基纤维素购自sigma公司，货号为M0512。
[0034]4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒的操作可以为:在4°C冰箱中用磁力搅拌器上搅拌过夜至溶液粘稠均一且没有白色颗粒。
[0035]高压灭菌的操作可以为:121°C高压灭菌30min。灭菌4%的甲基纤维溶液可以在4°C下保存。
[0036]S20、配制HAT半固体筛选培养基，每IOOmL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成:2mL的50XHAT贮存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和链霉素的双抗溶液、ImL的100XB细胞刺激因子溶液、2mL的50X杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、ImL的100X异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基。
[0037]50 X HAT贮存液通过如下操作制备:将I瓶HAT粉末加入IOmL无菌的PBS溶液中，溶解后得到50XHAT贮存液。
[0038]50XHAT贮存液由如下成分组成:5mM次黄嘌呤、20 μ M氨基蝶呤和800 μ M胸腺嘧啶核苷。
[0039]HAT粉末购自Sigma公司，货号为H0262。
[0040]无菌的PBS溶液购自Gibco公司，货号为C20012500BT。
[0041]胎牛血清购自Hyclone公司，货号为SV30087。
[0042]100XB 细胞刺激因子(B cell activating factor，BAFF)购自 R&D 公司，货号为2149-BF-010/CF,其工作浓度为 200~100ng/L。
[0043]IOOX异硫氰酸素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗原溶液的工作浓度为广10μ g/mL,可以在-20°C下保存。
[0044]异硫氰酸素标记的抗原可以根据具体需要的抗原，从市场购买或自行制备。
[0045]抗原可以为可偶联异硫氰酸素的可溶性蛋白。
[0046]异硫氰酸素标记的抗原，通过抗原抗体凝集反应可直接对分泌特异抗体的细胞克隆进行筛选。
[0047]100X青霉素和链霉素的双抗溶液购自Hyclone公司，货号为SV30010。
[0048]5O X 杂交瘤细胞融合克隆因子(Hybridoma Fusion and CloningSupplement, HFCS)溶液购自 Roche 公司，货号为 11363735001。
[0049]S30、将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后,用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液，将细胞悬液加入到预热至35°C~38°C的S20得到的HAT半固体筛选培养基中混匀，37°C静置并排除气泡后倒入平皿中，置于37°C、5%C02的孵育箱培养。
[0050]HAT液体培养基的由如下成分组成:1 XDMEM培养基、20%的胎牛血清和I XHAT。
[0051]平皿可以选择直径为3.5cm的平皿，每个平皿分装2mL培养基。
[0052]S40、S30得到的细胞在37°C、5%C02的孵育箱培养10-?4天，待平皿中长出肉眼可见克隆集落时，在荧光显微镜下对周围具有强荧光信号的阳性细胞团分别进行标记，然后在显微镜下将已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为所述杂交瘤细胞。
[0053]将已标记的阳性克隆挑出的操作可以选择无菌的微量移液器完成。
[0054]S40还包括对阳性克隆进行确认的步骤，包括如下操作:将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，对阳性克隆进行确认。
[0055]HT液体培养基由如下成分组成:1 XDMEM培养基、20%的胎牛血清和I ΧΗΤ。
[0056]HT购自sigma公司，货号为Η0137。
[0057]可以取上清用ELISA等方法对阳性克隆进行确认，选择确认后的阳性克隆进行扩大培养，冻存和鉴定分析。
[0058]这种杂交瘤细胞的筛选方法，融合细胞在半固体培养基上呈集落生长，彼此分离，每个克隆由单个细胞形成，因此不需要反复克隆即能获得纯一的抗体。培养基中加入了荧光标记抗原，一步实现杂交瘤细胞的克隆和阳性筛选，工作量小、耗时短；可根据荧光强度判断细胞分泌抗体的能力，从而得到高分泌抗体的细胞株；半固体培养基中加入了 B细胞刺激因子和杂交瘤细胞融合克隆因子，保证了杂交瘤细胞的营养需要，避免了使用饲养细胞的繁琐操作，大大降低了污染危险。
[0059]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种HAT半固体筛选培养基,其特征在于,每IOOmL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成:2mL的50XHAT贮存液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和链霉素的双抗溶液、ImL的100XB细胞刺激因子溶液、2mL的50X杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、ImL的100X异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基； 所述甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1:1的2XDMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀得到。
2.根据权利要求1所述的HAT半固体筛选培养基，其特征在于，所述2XDMEM培养基通过如下操作制备:将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节PH值为7.0-7.2，最后通过0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到所述2 X DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的HAT半固体筛选培养基，其特征在于，所述4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备:称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4%的甲基纤维溶液。
4.一种杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、按照体积比为1:1将2XDMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀，得到甲基纤维素半固体培养基； 步骤二、配制HAT半固体筛选培养基，每IOOmL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成:2mL的50XHAT贮存 液、20mL的胎牛血清、ImL的100X青霉素和链霉素的双抗溶液、ImL的100XB细胞刺激因子溶液、2mL的50X杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、ImL的100X异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基； 步骤三、将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后，用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液，将所述细胞悬液加入到预热至35°C~38°C的步骤二得到的HAT半固体筛选培养基中混匀，37°C静置并排除气泡后倒入平皿中，置于37°C、5%C02的孵育箱培养; 步骤四、步骤三得到的细胞在37°C、5%C02的孵育箱培养10-14天，待所述平皿中长出肉眼可见克隆集落时，在荧光显微镜下对周围具有强荧光信号的阳性细胞团分别进行标记，然后在显微镜下将已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为所述杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述2X DMEM培养基通过如下操作制备:将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节PH值为7.0-7.2，最后通过0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到所述2XDMHM培养基。
6.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备:称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4°C下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4%的甲基纤维溶液。
7.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，步骤二中所述的抗原为可偶联异硫氰酸素的可溶性蛋白。
8.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，步骤三中所述的HAT液体培养基的由如下成分组成:I XDMEM培养基、20%的胎牛血清和1XHAT。
9.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，步骤四还包括在所述将已标记的阳性克隆挑出后，对所述阳性克隆进行确认的步骤，包括如下操作:将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，取上清对阳性克隆进行确认。
10.根据权利要求9所述的杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，所述对阳性克隆进行确认的操作中，采用ELIS A的方法对阳性克隆进行确认。
【文档编号】C12N5/20GK103898060SQ201210572759
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】万晓春, 王彩霞, 向军俭 申请人:深圳先进技术研究院