一种双鸟苷酸环化酶基因、载体、工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种编码双鸟苷酸环化酶的双鸟苷酸环化酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组双鸟苷酸环化酶中的应用。该双鸟苷酸环化酶可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再分别对应转化至大肠杆菌，获得重组大肠杆菌。改重组大肠杆菌含有重组双鸟苷酸环化酶，可以重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化。重组双鸟苷酸环化酶作为转化用酶，可以5’-三磷酸鸟苷三钠(GTP)为底物，进行转化制备环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)。
【专利说明】一种双鸟苷酸环化酶基因、载体、工程菌及其应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种编码双鸟苷酸环化酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体 转化得到的重组工程菌、及在制备双鸟苷酸环化酶和生物合成c-di-GMP方面的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 环鸟苷二磷酸（c-di-GMP)作为细菌第二信号分子，普遍存在于各种微生物中，包 括对人类有害的病原菌。在这些微生物中，c-di-GMP调控着毒力因子的表达，生物膜的形 成，抗生素的耐药性（ref. in Qinghua)。在急性与慢性细菌引起的感染与疾病中，c-di-GMP 有着非常重要的作用。因此c-di-GMP具有良好的药物开发前景。
[0003] 已经有四个专利公开了 c-di-GMP的应用价值。W02005/030186发现c-di-GMP 可以减弱微生物病原菌的毒性，抑制或减少微生物病原菌的定居。US2005/0203051发现 c-di-GMP可以抑制癌细胞增殖或增加癌细胞凋亡。US2006/0040887发现c-di-GMP可 以刺激或者增强病人的免疫反应，可以作为疫苗的佐剂来增强病人对疫苗的免疫反应。 EP1782826也描述了 c-di-GMP可以作为疫苗的佐剂及其在药物组合物（如疫苗）中的用 途。
[0004] 针对c-di-GMP所进行的研究是新型药物开发中的一个热点。国内外大量的研究 机构正在努力阐明c-di-GMP信号传导机制，开发c-di-GMP新的应用价值。要使得上述的 研究顺利进行，必须要有足够量的c-di-GMP提供。因此大量合成c-di-GMP具有十分重要 的意义。
[0005] 目前已有报道的主要是化学合成方法。在整个合成反应中，要使用大量的保护基 团，增加了生产成本。同时正常存在以下问题：产率较低，反应剧烈，有环境污染。用酶法合 成，工艺简单，成本低.且无需有机试剂及环境污染问题。为此构建具有工业用途的双鸟苷 酸环化酶基因工程菌，并用这种工程菌来大规模工业化生产c-di-GMP，具有意义重大。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种双鸟苷酸环化酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及 其在制备双鸟苷酸环化酶和生物转化c-di-GMP方面的应用。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] -种双鸟苷酸环化酶基因，具有SEQ ID N0 :1所不的核苷酸序列。
[0009] 为获取目标基因片段，本发明所用菌种的生物材料来源于中国典型培养物保 藏中心，具有如下特征：保藏分类命名：野油菜黄单胞菌Xccl635RifYXanthomonas campestris Xccl635Rifr。保藏编号：CCTCC N0:M2012464。保藏日期：2012 年 11 月 20 号。 保藏单位：中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址：武汉.武汉大学.430072。
[0010] 该双鸟苷酸环化酶基因序列由如下方法获得：利用PCR技术在引物1(GACTCTAGA ACTTCACGACGAGAAGCTGGCGGTAG)、引物 2(GACTCTAGAACCCATAATGGATAGGCAC)的作用下，以来 源于野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)菌株CCTCC N0:M2012464中的总基因组 DNA为模板，克隆得到约1. lkb的双鸟苷酸环化酶的基因片段。将该片段连接到pDSK519载 体上，获得克隆载体pDSK-dgcX。对重组质粒进行测序，并利用软件对测序结果进行分析，分 析表明该序列含有一个长为l〇26bp的开放阅读框。改基因核苷酸序列为（SEQ ID N0:1):
[0011] TTGCCACACA TCGAGGCCTG GAGCATCAGC AGCAATGCCC CGATGCGCTT GGAGGAAAGG 60 AGCAAGGACA TGATGGTTCA GCATGAGGAC GAACTACGCA CCCCACCAAA GGCGAGCACC 120 CTGCTGCGAG TGCTGAGCGC TCTTCCGTTC GGCATCGCGT GGGCCAGCTT TCCTGATGGA 180 AAAATTCAGT ACTGCAATGC GGAGTTCGTT CGTCTATTCG GCCACGACGC CAGCCACTTC 240 CGTACAGTCG ATCAATTCGT GGACAGCCTC TATCTTCATG AACGGCAGCG CGAGATGGTA 300 CGCAAGCGCT GGCTAGACAT CGAACTGCAT CACTCGGCAC ATCCTGTTGC GACCGGTGAT 360 ATGGAGATTG ATGTCGTGAC CAGCGGAGGG TCAATCCGCA CGGTGTTGCA CTCGGGCTTG 420 ATACTTCACG ACGAGAAGCT GGCGGTAGCG ATCTTCAAAG ATTTTTCTGG TGTGCAGTCC 480 AATCGGCGGC AGCTTTTGGA GCTGATCTAT CGAGACGATC TGACTGGTGT TTCCAATCGG 540 CGTGGCCTTC GCGAGCGTTG GCATGCGGAG GTCTCCGAAG ATCCGCAGCG TCGTCTTGCA 600 TTCCTCATGC TGGATCTTGA TGACTTCAAA CCCATCAACG ATTCCTATGG GCACGCGGTA 660 GGTGACACCG TGCTTCAGAT CATCGCAGAG CGACTGAAAG GGGCTGTGCG AGAGACAGAC 720 TTGGTATGCC GCCTCGGTGG CGATGAGTTC GGTATCTTGC TTGTTGCACC AAGTGACCTG 780 TCTCATATCG AAATGGTCTG CAGCCGCATA CTGGAGTCGG TGAATACGCC GCTTCTGGTG 840 GACAACCTAA AACTTAGCAT CGGCGTCAGC ATTGGCGCCT GCCTCTATCC AGATCAAGCT 900 GCAGATAAGC ACGAACTACT GCGGCGCGCT GACCGGGCCC TGTATCAAAT CAAAAGGACC 960 GGGGGAAAAG GCTCCTGGCG CTGGTTCCAA GGAGAGCATC CGGTCGAAGG TATGGCTATT 1020 TCTTGA 1026
[0012] 利用软件对该基因序列进行分析，推知所述双鸟苷酸环化酶基因编码SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列：
[0013] MPHIEAWSIS SNAPMRLEER SKDMMVQHED ELRTPPKAST LLRVLSALPF GIAWASFPDG 60 KIQYCNAEFV RLFGHDASHF RTVDQFVDSL YLHERQREMV RKRWLDIELH HSAHPVATGD 120 MEIDVVTSGG SIRTVLHSGL ILHDEKLAVA IFKDFSGVQS NRRQLLELIY RDDLTGVSNR 180 RGLRERWHAE VSEDPQRRLA FLMLDLDDFK PINDSYGHAV GDTVLQIIAE RLKGAVRETD 240 LVCRLGGDEF GILLVAPSDL SHIEMVCSRI LESVNTPLLV DNLKLSIGVS IGACLYPDQA 300 ADKHELLRRA DRALYQIKRT GGKGSWRWFQ GEHPVEGMAI S 341
[0014] 本发明还涉及含有所述双鸟苷酸环化酶基因的重组载体，以及利用所述载体转化 得到的重组基因工程菌。
[0015] 本申请发明人根据测序结果设计表达引物3 (CACGGATCCTTGCCACACATCGAGGCCTGG AGCATCA)和引物 4(CAGCTCGAGTCAAGAAATAGCCATACC)，以重组质粒 pDSK-dgcX 为模板，通过 PCR扩增得到了用于表达的双鸟苷酸环化酶基因。本发明双鸟苷酸环化酶基因同表达载体 pGEX-6p-l连接，构建了含有双鸟苷酸环化酶基的表达重组载体pGEX-6p-dgcX。
[0016] 将表达重组质粒pGEX-6p-dgcX转化至大肠杆菌中，获得含有表达重组质粒 pGEX-6p-dgcX的重组大肠杆菌BL21菌株BL21/pGEX-6p-dgcX，以重组菌或者融合蛋白 GST-dgcX为酶源，进行生物催化与转化。
[0017] 本发明还涉及所述的双鸟苷酸环化酶基因在制备重组双鸟苷酸环化酶中的应用， 及双鸟苷酸环化酶生物合成c-di-GMP方面的。
[0018] 具体的，所述的应用为：构建含有所述双鸟苷酸环化酶基因的重组载体，将重组载 体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组双鸟 苷酸环化酶菌体细胞。
[0019] 所述的双鸟苷酸环化酶作为转化用酶，可以5'-三磷酸鸟苷三钠（GTP)为底物，进 行转化制备环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP)。
[0020] 本发明的有效效果：
[0021] 本发明提供了一种来源于野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)菌株CCTCC NO :M2012464的双鸟苷酸环化酶基因核苷酸序列；并将该基因与表达载体转接构建重组载 体pGEX-6p-dgcX，再转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pGEX-6p-dgcX的重组 大肠杆菌BL21菌株BL21/pGEX-6p-dgcX。可应用本发明构建的重组大肠杆菌为酶源进行生 物催化与转化，将5' -三磷酸鸟苷三钠转化成环鸟苷二磷酸。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为克隆载体pDSK-dgcX的物理图谱；
[0023] 图2为重组质粒pGEX-6p_dgcX的物理图谱；
[0024] 图3为双鸟苷酸环化酶PCR扩增凝胶电泳图；1 :DNA marker ;2?5 :利用引物1 和引物2扩增得到的双鸟苷酸环化酶基因片段。
[0025] 图4为阳性重组质粒pGEX-6p-dgcX的酶切结构图：1 :DNA marker ;2 :双鸟苷酸环 化酶基因片段；3 :pGEX_6p-dgcX/BamHI and Xhol 样品；4 :pGEX_6p-dgcX/BamHI 样品；5 : pGEX_6p-dgcX/XhoI 样品。
[0026] 图5为双鸟苷酸环化酶SDS-PAGE图；1 :蛋白分子量marker ;2 :E. coli BL21 ;3 : 未诱导的E.coli BL21/pGEX-6p-dgcX;4:0.1mM ITPG诱导的E.coli BL21/pGEX-6p-dgcX; 5 :lmM ITPG诱导的E. coli BL21/pGEX-6p-dgcX，诱导产生的GST-dgcX分子量大小大约为 65. 5kDa。 (五）
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但是本发明的保护范围不仅限于 此：
[0028] 实施例1 :
[0029] 用基因组DNA提取试剂盒，提取野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)菌株 CCTCC NO :M2012464的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1 (GACTCTAGAACTTCA CGACGAGAAGCTGGCGGTAG)、引物 2 (GACTCTAGAACCCATAATGGATAGGCAC)的作用下，进行 PCR 扩 增。
[0030] PCR反应体系各组分加入量（总体积50 μ L) :10Xpfu DNA polymerase Buffer(Sigma)5y L，10mM dNTP mixturely L，浓度为 25μ L 的引物 1、引物 2 各 2μ L，基因 组 DNA1 μ L，pfu DNA polymerasel μ L，去离子水 28 μ L。
[0031] PCR 扩增条件：1)95°C，变性 5min ;2)95°C，变性 lmin，60°C 退火 45s，72°C 延伸 1. lmin，30个循环；3) 72°C，延伸10分钟，冷却至4°C。
[0032] 取5 μ LPCR反应液用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测。用PCR纯化试剂盒纯化该片 段，然后利用Xbal与EcoRI对该片段进行处理，并在T4DNA连接酶的作用下，将改片段同用 相同的双酶处理的PDSK-519进行连接。利用蓝白筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测 序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸中含有一个完整 的开放阅读框，其基因长度为l〇26bp(其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示）。
[0033] 实施例2 :
[0034] 根据实施方1分析结果设计表达引物3 (CACGGATCCTTGCCACACATCGAGGCCTGGAGCAT CA)和引物4 (CAGCTCGAGTCAAGAAATAGCCATACC)，并分别在引物3和引物4中引入了 BamHI 和Xhol限制性内切酶切位点。在引物3和引物4中引发下，利用pfu DNA polymerase进 行扩增，获得了长为l〇34bp的双鸟苷酸环化酶片段，测序后利用BamHI和Xhol限制性内切 酶对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的双酶处理的pGEX-6p-l 进行连接，构建表达载体pGEX-6p-dgcX。将构建的表达载体pGEX-6p-dgcX电转化至大肠杆 菌BL21中，涂平板37 °C下培养过夜，随机挑取克隆提取质粒，并用引物3与引物4进行PCR 扩增，能够扩增出目标条带的模板质粒即为含有双鸟苷酸环化酶的质粒。
[0035] 提取质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图4。
[0036] 实施例3 :
[0037] 将实施例2验证后的含有表达重组质粒pGEX-6p-dgcX的重组大肠杆菌BL21菌株 BL21/pGEX-6p-dgcX，用含有100 μ g/ml卡那霉素的LB培养液，培养到菌体浓度0D600约为 1. 0左右，再向LB培养液加入终浓度ImM的ITPG，诱导培养8h后，4°C、8000rpm离心5min， 收集含有重组双鸟苷酸环化酶的菌体细胞。
[0038] 实施例4 :
[0039] 以实施例3中获得的含有表达重组质粒pGEX-6p-dgcX的重组大肠杆菌BL21菌株 BL21/pGEX-6p-dgcX菌体超声波破碎（300W，破碎10s，间隔30s，破碎20分钟）。超声波破 碎后离心4°C、8000rpm离心10min。取上清液作为转化用酶，以5' -三磷酸鸟苷三钠为底 物，进行转化反应制备环鸟苷二磷酸。转化体系及操作如下：在l〇ml反应试管中加入超声 破碎上清液和底物为ImM的反应液体，30°C，200rpm转化30分钟，离心去除不溶物，上清液 中即含有环鸟苷二磷酸。
[0040] 在光密度253nm处测定双鸟苷酸环化酶生成环鸟苷二磷酸所用的酶量，酶活定 义：30°C、每分钟A253处吸光度值增加0. 001为1个活力单位（U)。
[0041] 表1 :以重组大肠杆菌BL21菌株BL21/pGEX-6p-dgCX以酶源测定的双鸟苷酸环化 酶活力测定结果
[0042]
【权利要求】
1. 一种双鸟苷酸环化酶基因，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的双鸟苷酸环化酶基因，其特征在于所述双鸟苷酸环化酶基因编 码SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列。
3. 在保持由上述权利要求2编码的双鸟苷酸环化酶催化活性的前提下，由插入，缺失 或替换上述权利要求2碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。
4. 如权利要求1所述的双鸟苷酸环化酶基因，其特征在于所述双鸟苷酸环化酶基因来 源于野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)CCTCC NO :M 2012464。
5. 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址：中国武汉武汉大学，430072,保藏日期：2012年11月20日，保藏编号：CCTCC NO :M 2012464。
6. -种含有权利要求1所述双鸟苷酸环化酶基因的重组载体。
7. 如权利1所述的双鸟苷酸环化酶基因在制备重组双鸟苷酸环化酶和生物合成 c-di-GMP方面的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述双鸟苷酸环化 酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导 培养，培养液分离得到含有重组双鸟苷酸环化酶的菌体细胞。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述重组双鸟苷酸环化酶作为转化用酶，可 以5' -三磷酸鸟苷三钠（GTP)为底物，进行转化制备环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP)。
【文档编号】C12N15/60GK104152472SQ201210579844
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】陶飞, 刘小杰, 陈礼明 申请人:陶飞