专利名称：用于鼻咽癌易感基因snp位点检测的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒。
背景技术：
鼻咽癌是鼻咽上皮来源的恶性肿瘤，多发于鼻咽顶部和咽隐窝，是一种多因素影响的复杂性疾病，其发生及发展与遗传因素、环境因素及EBV病毒感染密切相关。中国是世界鼻咽癌高发区，据世界卫生组织统计，2008年，中国新发病例占全球39. 2%(33101人)，因鼻咽癌死亡病例占全球40. 5% (20899人)；并且，鼻咽癌好发于壮年，严重影响人民健康和经济发展。近几年，巴德年院士提出的现代“3P”医学理念正不断得到推广。“3P”医学模式，即预测(Prediction)、预防(Prevention)和个体化诊疗(Personalization),强调利用个体基因组等信息，进行疾病的预测和防治，对于疾病的态度由“重治”转变为“重防”。同样，鼻咽癌的防治关键将是进行患病高危人群的筛查，提高早诊率。临床研究发现，鼻咽癌早期治疗效果远高于晚期。临床分期是影响治疗效果的重要因素，早期无局部淋巴结转移鼻咽癌的5年生存率(75. 7%)远高于淋巴结转移鼻咽癌(58. 2%)和晚期远处转移鼻咽癌(34. 9%)。然而，目前仍然缺乏有效的用于高危人群筛查、早期诊断方法策略，加上鼻咽癌的早期症状无特异性和原发部位较隐蔽，不易被发现，80%鼻咽癌患者就诊时已处于中晚期，治疗效果不理想，导致临床上鼻咽癌的5年生存率一直徘徊于60%左右。进行鼻咽癌高发区人群筛选，能够筛选患病高危人群，提高鼻咽癌早诊率，是提高治疗效果的关键。因而，开发鼻咽癌发病风险预测、用于鼻咽癌高危人群筛查 的新型手段具有重要的意义。目前临床上提高鼻咽癌早期诊断率主要是通过提高个人健康意识，结合鼻咽腔检查，并利用EB病毒抗体检测技术以评估EB病毒感染情况(详见专利CN92114135 “一种检测EB病毒抗体的显色试剂及其制造方法”;CN200710027841 “检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法” ；CN201010255146 “EB病毒IgA抗体检测试剂盒(胶体金法)及制备方法”;CN200710029366.1 “检测EB病毒gp78抗体的CBA试剂盒及其制备方法”等)。但是，这种策略难以应用于大规模人群的高危人群筛查，难以应用于鼻咽癌的早期预防、预警，也未能够有效地提高早诊率。因此，根据个体携带鼻咽癌易感基因情况，进行鼻咽癌发病风险预测，对于确定鼻咽癌高危人群，提高鼻咽癌早诊率，显得非常重要。在其它相关的恶性肿瘤研究当中，研究者能够利用个体携带易感基因的情况，对其发病风险进行预测。例如，分别携带BRCAl和BRCA2基因突变的女性，罹患乳腺癌的相对风险分别是正常群体的5 - 45倍和9 一 21倍；并且，Antoniou等人通过7个风险相关位点联合分析发现，在BRCA2突变携带者中，5%高危组到80岁时发生乳腺癌的可能性为80 96%，而低危组仅为42 50%，指出这些患病风险差异可以用于指导临床方案。然而，目前缺乏有效的鼻咽癌发病风险预测产品。虽然已有个别申请专利根据鼻咽癌相关基因PLUNC的C-2128T位点、C-1888T位点或由此两位点组成的单倍型来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法(详见专利CN200510008650. 1“一种检测与鼻咽癌相关的易感基因PLUNC基因型的方法及PLUNC易感基因”)，然而，该方法仅针对极少数的指标检测，准确率较低；并且，该方法可靠性有待于大规模人群样本进行验证。另外，有大量研究证实恶性肿瘤家族史及一些环境暴露因素(如食用腌制食品的历史、既往吸烟饮酒史、摄取新鲜水果蔬菜及其他食品量、食用中草药的历史等)与鼻咽癌的发生有关系，综合考虑遗传因素和环境因素对鼻咽癌发病风险进行预测是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，该试剂盒可用于同时检测多个鼻咽癌易感基因的SNP位点，可以为个体罹患鼻咽癌风险程度、鼻咽癌高发区人群普查，筛查鼻 咽癌发病高危人群以及进行相应预防措施提供参考。本发明所述的一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rsl572072和rs9510787的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因MDSl-EVII的SNP位点rs6774494的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID N0:3。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rsl572072的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID N0:6。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO:9。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQID NO: 10和SEQ ID NO: 11，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO: 12。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2894207的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO: 15。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO: 18。根据本发明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒的进一步特征，所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位点rs9510787的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO:21。本发明所述的试剂盒以是以本发明人的基于大规模样本量的鼻咽癌人群和正常人对照人群及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，结合其它已知的鼻咽癌相关易感基因，选择7个单核苷酸多态性位点(SNP)进行制备的。采取受检者外周血、唾液或漱口水来源的基因组DNA，在本发明所述的试剂盒上进行基因分型检测，再利用多重PCR扩增及桑格(Sanger)测序方法，检测这7个单核苷酸位点，综合分析环境因素(腌制食品食用史、既往吸烟史、新鲜水果蔬菜食用量)、肿瘤家族史及鼻咽癌易感基因位点单核苷酸多态性(SNP)信息，利用遗传风险计分模型，推测受检者罹患鼻咽癌的风险程度，克服了现有的仅仅通过检测EB病毒感染情况、或者依靠极少数的易感基因指标的等结果来进行鼻咽癌发病风险判断的不足。本发明所述的试剂盒能够在受检者任何一个年龄阶段进行检测，结合受检者环境暴露因素，提示受检者不同时期罹患鼻咽癌的风险程度，能够进行大规模人群普查、筛选鼻咽癌发病高危人群，实现鼻咽癌发病风险预测、预警，提高早诊率。
具体实施例方式1、本发明所述的试剂盒所检测的受检者基因组SNP位点(7个)通过本发明人大规模样本量的鼻咽癌全基因组关联分析，得到与鼻咽癌发病显著相关的SNP，另外结合HapMap，dbSNP等数据库挑选出SNP位点，并进行位点实验成功率评分，确定要进行研究的7个SNP位点。其中，rsl412829位于基因⑶KN2A-⑶KN2B区域，rsl572072 和 rs9510787 位于基因 TNFRSF19 区域，rs2860580、rs2894207 和 r s28421666位于基因HLA区域，rs6774494位于基因MDSl-EVII区域。表1、与鼻咽癌发病显著相关的7个SNP位点
位点名称序列rs!412829TTAG 丁AGTACTACACATATCATGCTTTGGCfAAACTCTACCCATGA GATTCATATTCAAGCIA/G |TGAGGA ATGGCAAAAG AAAATAC AG AAATAGTGATAGTAACCATAGCAATGGTAATAAGArs!572072GGTGAGGTmGGGAAAGCTTCCAGATCAGTCTTTTTTTTTCGGTT GTTAAGCATCCTTCT[T/G]TCCTACTTCTCTCCATATATATACAAAT ACATAATAAATATTCCTATAGAGTTTTTAATGrs28421666ACTACAAAGACTAATATTACAATTCTGTAAATGTATCTATACTGTG
ATATTTATATTTAT[A/G]AAAACAGGAAGGATCTTAATGACACTCA GAAGACTAGAATTAGATGATAGAAGAACGACTrs2860580TGATGGTTTTATAAGGGGCTTTTCCCTGCTTCATTGTGCATTTCTC TCTCCTGTCACCAC|A/G|TGAAGAAGCfACGGGTTTGCTTCCACTT CTGCCATGACTGTAAGTTTCCTGGGGCAGCCTCrs2894207TACTTCACACCACAi ATAAAAATTACCTCAGTGTATCAAAGACCT AAATGTGAGACTTAAj TC |ATTAGAGAACTCTTAG AAGAAAACAT AAGCATAAATCTTCATGACTTTGGATTAGGTAAArs6774494CAAACAGATCTATCTTACTTACATTTACCAAATCAATTTAATTTTT ACAGGCCATGGCTTI AG IGTGACATATTGACTGTTrTCCTTAATGG C ATCTACCGTATTTAATGCAAGG ATGTC ATCTrs9510787AGCTGGGCTGACCTGCAACTCTTAGGAATTGTATGTGGCTTCATA GTCTTAGAAGACAGC|A/G]AGCAGTTGTTTGCACCAATAAGTAAT AAATCACATTATTAAAAG 丁丁 TATTATTTTCCAAA
2.设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物并合成。表2、待测SNP位点的PCR扩增引物(PCRP )及单碱基延伸引物(UEP )
权利要求
1.一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rsl572072和rs9510787的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666、rs2860580和 rs2894207的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
2.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO :3。
3.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rsl572072的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO :6。
4.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666的两个PCR扩增引物，其序列分别为 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO :9。
5.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2860580的两个PCR扩增引物，其序列分别为 SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO :12。
6.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs2894207的两个PCR扩增引物，其序列分别为 SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 14，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ ID NO :15。
7.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID N0:16和SEQ ID NO : 17，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQID NO 180
8.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于 所述检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位点rs9510787的两个PCR扩增引物，其序列分别为SEQ ID NO 19和SEQ ID NO :20，以及单碱基延伸引物，其序列为SEQ IDNO :21。
全文摘要
本发明涉及一种用于鼻咽癌易感基因SNP位点检测的试剂盒。本发明所述的试剂盒包括检测鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位点rs2860580的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因TNFRSF19区域的SNP位点rs1572072和rs9510787的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因HLA的SNP位点rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；检测鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位点rs6774494的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。本发明所述的试剂盒可用于同时检测多个鼻咽癌易感基因的SNP位点，可以为个体罹患鼻咽癌风险程度、鼻咽癌高发区人群普查，筛查鼻咽癌发病高危人群以及进行相应预防措施提供参考。
文档编号C12Q1/68GK103045743SQ20121058427
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者曾益新, 贾卫华, 崔倩, 贝锦新, 阮红莲 申请人:中山大学肿瘤防治中心