专利名称：一种使用bhk-21贴壁细胞制备口蹄疫疫苗的方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体描述为一种用BHK-21细胞在生物反应器中经一步高密度大规模贴壁培养制备口蹄疫疫苗的方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus, FMDV)引起的偶蹄动物传播的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物多达70多种。口蹄疫疫病传染性极强，可引起动物生产性能下降，一旦爆发会给被感染地区的畜牧业造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易，被世界动物卫生组织列为必须在第一时间报告疫情的疫病之一。FMDV 属于小 RNA 病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒属(Aphthovirus),血清型众多，包括O、A、C、Asial、SATl、SAT2和SAT3型共7个血清型。其血清型间无交叉免疫保护，所以针对一种血清型的疫苗对其他血清型病毒难以产生作用，造成疫病控制难度较大。FMD疫苗经历了灭活疫苗、活疫苗、灭活疫苗这一历发展趋势，目前也有部分新型疫苗(合成肽疫苗)面市。其中，灭活疫苗最初使用舌皮组织毒经甲醛灭活制成的疫苗，经过将近20年的发展，现在主要通过细胞培养病毒经BEI灭活制成疫苗。FMD病毒抗原生产方式也主要有三种方式:1，牛舌皮组织生产培养方法；2，转瓶BHK21细胞培养法；3，BHK21细胞悬浮培养方法。其中，转瓶BHK21细胞培养方法在生产过程中需要较多的人工操作，容易散毒，较难完全控制生物安全；而悬浮培养法在生产过程中使用了大型生物反应器，能很好的保持生产过程生物安全 ，是目前疫苗的主要生产方式。1962年，Capstick等将BHK21单层贴壁细胞驯化为悬浮细胞用于悬浮培养，1965年，Telling和Elsworth使用大型发酵罐用于悬浮培养BHK21悬浮细胞。此后，这种生产方式被越来越广泛的用在口蹄疫灭活疫苗生产中。目前，世界主要口蹄疫生产企业， 如 Intervet, Merial, Indianlmmunologicals Ltd., Bayer Healthcare, WellcomeBiotechnology Limited,及国内主要口蹄疫生产企业,如金宇保灵，内蒙古必威安泰等,均采用这种大型发酵罐悬浮培养BHK21悬浮细胞制备口蹄疫灭活疫苗的生产方法。上述生产方法的典型生产工艺流程为:取细胞工作库中保存的细胞，经0.2升，2升，5升培养体积的初级放大及悬浮驯化，接种至体积由小到大的若干发酵罐进行逐级放大，最后达到在大型发酵罐中培养，例如，经过30升，100升，300升，1000升，至3000升，或者经过10升，120升，650升，至4000升。然后接入制备好的种毒毒液，感染细胞，在条件合适时收获病毒液，灭活，经抗原浓缩与纯化，然后进行乳化并分装获得口蹄疫灭活疫苗成品O现有的大规模悬浮培养BHK-21细胞制备口蹄疫灭活疫苗的方法，在细胞初级放大后，包括一个必须的逐级放大的过程。这些4步-5步的逐级放大步骤需要消耗大量培养基，增加了培养困难和受到污染的可能性，每一步放大需要培养细胞3-4天，所以逐级放大过程周期为15-20天，整个生产过程周期为30-40天。
发明内容
本发明提供了一种工艺流程简单、生产周期更短的制备口蹄疫疫苗的方法。本发明提供的工艺方法，可以使用BHK-21贴壁细胞用于制备口蹄疫疫苗，免去了将贴壁细胞驯化为悬浮细胞的过程；本发明提供的工艺方法，避免了现有的BHK-21细胞大规模悬浮培养制备口蹄疫疫苗技术中必需的逐级放大过程，显著简化工艺流程，缩短生产周期；本发明提供的工艺方法，在短时间内大规模培养得到极高密度的贴壁BHK-21细胞，为口蹄疫病毒的感染和复制提供更优的环境，从而提高抗原数量和质量，创造显著效益；本发明提供的工艺方法，结合高效率的生物反应器灌流培养方式与广泛应用的大型细胞罐一次性接毒方式，在提高生产效率的同时最大程度的减小了口蹄疫病毒的逃逸，减少污染机会。本发明方法制备的口蹄疫疫苗产量更高且质量稳定。本发明提供一种使用BHK-21贴壁细胞制备口蹄疫疫苗的方法，包括以下步骤:I)细胞复苏和初级放大；2)大规模对细胞进行放大培养；3)将大规模放大培养后得到的细胞悬液转移至病毒液制备罐中，条件成熟时，接种口蹄疫病毒种毒液及毒液收获。
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本发明方法还可以包括制备疫苗成品的下游步骤。细胞复苏采用本领域常规方法进行，例如:(I)取出冻存于液氮中的BHK-21细胞，置于37°C水浴中复苏，并接种入含有胎牛血清或小牛血清的培养液20ml中，在37°C，通5% CO2的二氧化碳培养箱中培养1_2天。(2)将步骤(I)中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，分成若干瓶，每瓶用含有胎牛血清或小牛血清的培养液40ml，继续按(I)中的条件培养2-3天。(3)将步骤(2)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(4)进行细胞计数及活力检查。所述培养液可采用本领域常规的细胞培养基，例如CMRL1415培养基，F12(HAM)培养基，M199培养基，MEM培养基，DMEM培养基等，向选用的培养基中加入胎牛血清，或小牛血清使其浓度达到3^-15 ^步骤(4)可采用台盼蓝染色法进行。BHK-21细胞复苏后的初级放大培养可以使用各种体积的圆形培养皿，T型瓶，方瓶，圆柱形滚瓶(或称转瓶)，细胞工厂(Cell Factory, NUC公司)及其同类产品(例如，Cell Stack, Corning公司)，小型生物反应器,和各种体积的一次性生物反应器装置。在一个实施方式中，所述初级放大培养采用细胞工厂方式，步骤如下:(I)将细胞复苏得到的细胞悬液，用培养液稀释至适当的密度后接种至细胞工厂培养器装置；(2)将步骤(I)中所得到的细胞液放入二氧化碳培养箱培养；(3)将步骤(2)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(4)进行细胞计数及活力检查。所述培养液可采用本领域常规的细胞培养基，例如CMRL1415培养基，F12(HAM)培养基，M199培养基，MEM培养基，DMEM培养基等，向选用的培养基加入胎牛血清或小牛血清使其浓度达到3%-15%。步骤(I)中所用的细胞工厂培养器装置为本领域常规使用的装置，例如美国NUC公司的Cell Factory,或美国Corning (康宁)公司的Cell Stack。步骤(2)的培养条件为本领域常规的细胞培养条件，例如37°C，通5% CO2的二氧化碳培养2-3天。步骤(4)可采用台盼蓝染色法进行。在另一个实施方式中，所述初级培养采用转瓶培养方式，步骤如下:(I)将细胞复苏得到的细胞悬液，用培养液稀释至适当的密度后接种至转瓶中(2)将步骤⑴中所得到的含细胞液的转瓶置于转瓶机；(3)将步骤(2)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(4)进行细胞计数及活力检查。所述培养液可采用本领域常规的细胞培养基，例如CMRL1415培养基，F12(HAM)培养基，M199培养基，MEM培养基，DMEM培养基等，向选用的培养基加入胎牛血清或小牛血清使其浓度达到3%-15%。步骤(I)中所用转瓶为本领域常规使用的器材，体积例如为3升的，15升的。步骤(2)的培养条件为本领域常规的细胞培养条件，例如装有细胞液的转瓶被放置于转瓶机上，设定转速为20-40rpm，37°C，通5% CO2的二氧化碳，培养2_3天。步骤(4)可采用台盼蓝染色法进行。使用生物反应器和微载体大规模对细胞进行放大培养，包括如下步骤:1.调试与准备生物反应器，使其处于良好的生产状态；对微载体，进行浸泡和灭菌准备；
i1.将培养液注入生物反应器中，并将微载体加入，设定合适的培养条件、转速和温度;ii1.将所述初级放大培养得到的细胞悬液，以适当的接种密度接种至生物反应器中；iv.以灌流培养的方式培养细胞。培养期间以适当的时间间隔进行细胞计数及活力检查。所述生物反应器可使用本领域常用的内部结构支持使用载体的各类生物反应器，例如德国Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Satorious公司生物反应器,荷兰Applicon公司生物反应器,杭州安普公司生物反应器，上海日泰公司生物反应器，广州旗帜公司生物反应器。优选使用德国Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器,德国Satorious公司生物反应器,荷兰Applicon公司生物反应器，更优选使用德国Eppendorf (艾本德)公司NewBrunswickScientific生物反应器。所述载体可选自常规使用的各种材料制的载体，包括化工材料的聚丙烯，PLA,PGA,多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，胶原蛋白，琼脂，谷物蛋白等。优选使用葡聚糖材料的微载体，更优选使用美国GE公司Cytodexl球形微载体。所述微载体的浓度例如为5-50克/升，优选10-40克/升，更优选15_30克/升，最优选20-25克/升。细胞培养条件为本领域常规的细胞培养条件，例如。转速为80_120rpm。温度为37度。所述培养液可采用本领域常规的细胞培养基，例如CMRL1415培养基，F12(HAM)培养基，M199培养基，MEM培养基，DMEM培养基等，优选使用M199培养基，MEM培养基，DMEM培养基，更优选使用GIBCO公司的MEM培养基或DMEM培养基。适当的接种密度例如为0.8xl05个细胞/ml至9xl05个细胞/ml，优选IxlO5个细胞/ml至7xl05个细胞/ml，更优选3xl05个细胞/ml至6xl05个细胞/ml，最优选为5xl05个细胞/ml。以灌流培养的方式培养细胞2-10天，优选3-7天，更优选3-4天。细胞计数及活力检查可采用台盼蓝染色法。细胞计数及活力检查每隔4-24h进行一次，优选每隔6-18h进行一次，更优选每隔12小时进行一次。口蹄疫病毒接种及收获按如下步骤进行:A当细胞密度达到适当的高密度时，停止在原生物反应器上的灌流培养。将罐体内全部溶液在无菌条件下转移至大型细胞罐体内，补充培养液至细胞密度为0.5xl07个细胞/ml οB设定转速为80-1 lOrpm，更优选lOOrpm，维持不超过24小时，使细胞溶液处于稳定状态。C按设定的病毒种毒液浓度接毒，超过80%细胞被感染后，收获毒液，经灭活，稀释，乳化工艺，制备得到口蹄疫病毒疫苗。步骤A中，适当的高密度例如为1.0xlO7个细胞/ml至12xl07个细胞/ml，优选为2xl07个细胞/ml至IOxlO7个细胞/ml，更优选为4xl07个细胞/ml至IOxlO7个细胞/ml，最优选为5xl07个细胞/ml至8xl07个细胞/ml。步骤B中，维持时间例如6-24小时，优选8-20小时，更优选I O-18小时，最优选12
小时，使细胞溶液处于稳定状态。步骤C的基本步骤使用本领域的常规方法:按照病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒种毒液，设定温度为例如340C _37°C，PH7.4，溶氧为30% -50%。接毒后6小时起，每小时用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查，并在显微镜下观察微载体上的细胞生长情况。当大于80%的细胞从微载体上脱落时，停止搅拌。静置4小时后,收获全部病毒上清液。收获病毒液时，病毒液与微载体经微载体截留装置分离，微载体被回收，经灭毒等生物安全步骤处理销毁。这里的“微载体截留装置”可以是内置于细胞罐中，也可以是外接在细胞罐出液口外的，可以由任何允许的经无菌处理的材料制成，可以是柱状，网状，三角形，等各种形状，只要该装置的作用是能够使病毒液顺利流过而微载体被截住不进入病毒液收获容器。采用蔗糖密度梯度法测定口蹄疫病毒含量，当大于1000yg/ml时，进行灭活，稀释，乳化工艺，制备得到口蹄疫病毒疫苗。本方法可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情，具体步骤为:BHK-21细胞复苏并初级放大后，经3-5天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度(IxlO7个细胞/ml至IOxIO7个细胞/ml)，全体细胞液被转移至大型细胞罐中进行接毒及收获等步骤。此时 ，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70%。
具体实施例方式材料与设备1，材料I) MEM培养基，DMEM培养基，GIBCO公司2)胎牛血清，GIBCO公司2，主要设备I)细胞工厂，美国NUC公司2)生物反应器:德国Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick 40L生物反应器(工作体积30L)，75L生物反应器(工作体积52L)，150L生物反应器(工作体积105L);工作体积300升的发酵罐，工作体积为550升的发酵罐，工作体积为1100升的发酵罐3) 二氧化碳培养箱，日本三洋公司4)高速离心机，Beckman公司5)超速离心机，Beckman公司6)分光光度计,德国Eppendorf公司实施例1一，细胞复苏和初级放大
(I)取出冻存于液氮中的BHK-21细胞，置于37°C水浴中复苏，并接种入含有15%胎牛血清的DMEM培养基20ml的方瓶(T型瓶)中，在37°C，通5 % CO2的二氧化碳培养箱中培养2天。(2)将步骤(I)中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，平均分配于5个T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培养基补至总体积为20ml，继续按(I)中的条件培养3天。(3)将步骤(2)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(4)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(5)将步骤(3)中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，平均分配于25个T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培养基补至总体积为20ml，继续按(I)中的条件培养3天。(6)将步骤(5)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(7)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(8)将如步骤(6)所述得到的细胞悬液，接种至20个10层的细胞工厂装置，每个用1500ml培养液稀释细胞悬液至接种密度为IxlO5个细胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培养箱中培养3天。(9)将步骤(8)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(10)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。二，大规模对细胞进行放大培养1.按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用的Cytodexl微载体进行浸泡和灭菌准备。i1.以DMEM培养基为基础培养基，加入胎牛血清至使其浓度为8%，作为放大培养中使用的培养液。将培养液注入生物反应器中，并将微载体加入。以在一台40L的生物反应器中生产为例，注入20升培养基，按20克/升的浓度加入600克经预处理的Cytodexl微载体。ii1.将如步骤I所述得到的细胞悬液，接种至生物反应器中，以在一台40L的生物反应器中生产为例，按接种密度5xl05个细胞/ml接种BHK-21细胞，补充注入培养液使体积达到30升，设定氧气，氮气，空气，二氧化碳的通入比例为20%，5%，60%，15%，通气量为1.0升/分钟，设定转速为IlOrpm/分钟，温度37°C。iv.按照设备使用说明，以灌流培养的方式，培养细胞3天。V.每12小时采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。三，将大规模放大培养后得到的细胞悬液转移至病毒液制备罐中，条件成熟时，接种口蹄疫病毒毒种液及毒液收获A当细胞密度达到5xl07个细胞/ml时，停止在原生物反应器上的灌流培养。将40L生物反应器中的全部30L细胞液连同载体一起，在无菌条件下转移到一个工作体积为300L的发酵罐中，注入培养液使总体积达到300L。B设定转速为80rpm，维持12小时，使细胞溶液处于稳定状态。C接毒及毒液收获
按照病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒种毒液，设定温度为34°C，PH为7.4,溶氧为50%。接毒后6小时起,每小时用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查，并在显微镜下观察微载体上的细胞生长情况。当大于80%的细胞从微载体上脱落时，停止搅拌。静置4小时后，收获全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法测定口蹄疫病毒含量，当大于ΙΟΟΟμ g/ml时，进行灭活，稀释，乳化工艺，制备得到口蹄疫病毒疫苗。检测收获得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得结果为:三次接种的结果(μ g/ml)分别为:1895，2001，2136。按我国现行兽用生物制品质量标准进行检验和农业部对口蹄疫疫苗的相关公告进行检验，质量符合要求。实施例2一，细胞复苏和初级放大与实施例1所述相同。二,大规模对细胞进行放大培养1.按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用Cytodexl微载体进行浸泡和灭菌准备。i1.以DMEM培养基为基础培养基，加入胎牛血清至使其浓度为8%，作为放大培养中使用的培养液。将培养液注入生物反应器中，并将微载体加入。以在一台40L的生物反应器中生产为例，注入20升培养基，按25克/升的浓度加入750克经预处理的Cytodexl微载体。ii1.将如步骤I所述得到的细胞悬液，接种至生物反应器中，以在一台40L的生物反应器中生产为例，按接种密度6xl05个细胞/ml接种BHK-21细胞，补充注入培养液使体积达到30升，设定氧气，氮气，空气，二氧化碳的通入比例为25%，5%，55%，15%，通气量为1.0升/分钟，设定转速为IlOrpm/分钟，温度37°C。
iv.按照设备使用说明，以灌流培养的方式，培养细胞3天。V.每12小时采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。三，将大规模放大培养后得到的细胞悬液转移至病毒液制备罐中，条件成熟时，接种口蹄疫病毒毒种液及毒液收获A当细胞密度达到6xl07个细胞/ml时，停止在原生物反应器上的灌流培养。将40L生物反应器中的全部30升细胞液连同载体一起，在无菌条件下转移到一个工作体积为300L的发酵罐中，注入培养液使总体积达到300L。B设定转速为80rpm，维持12小时，使细胞溶液处于稳定状态。C接毒及毒液收获按照病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒种毒液，设定温度为34°C，PH为7.4,溶氧为50%。接毒后6小时起,每小时用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查，并在显微镜下观察微载体上的细胞生长情况。当大于80%的细胞从微载体上脱落时，停止搅拌。静置4小时后，收获全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法测定口蹄疫病毒含量，当大于ΙΟΟΟμ g/ml时，进行灭活，稀释，乳化工艺，制备得到口蹄疫病毒疫苗。检测收获得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得结果为:三次接种的结果(μ g/ml)分别为:1745，1608，1889。按我国现行兽用生物制品质量标准进行检验和农业部对口蹄疫疫苗的相关公告进行检验，质量符合要求。实施例3一，细胞复苏和初级放大(I)取出冻存于液氮中的BHK-21细胞，置于37°C水浴中复苏，并接种入含有15%胎牛血清的DMEM培养基20ml的方瓶(T型瓶)中，在37°C，通5 % CO2的二氧化碳培养箱中培养2天。(2)将步骤⑴中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，平均分配于5个T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培养基补至总体积为20ml，继续按(I)中的条件培养3天。(3)将步骤(2)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(4)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(5)将步骤(3)中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，平均分配于25个T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培养基补至总体积为20ml，继续按(I)中的条件培养3天。(6)将步骤(5)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(7)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(8)将如步骤(6)所述得到的细胞悬液，接种至20个10层的细胞工厂装置，每个装置用1500ml培养液稀释细胞悬液至接种密度为IxlO5个细胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培养箱中培养3天。 (9)将步骤(8)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(10)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(11)将如步骤(9)所述得到的细胞悬液，接种至70个10层的细胞工厂装置，每个装置用1500ml培养液稀释细胞悬液至接种密度为IxlO5个细胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培养箱中培养3天。(12)将步骤(11)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(13)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。二,大规模对细胞进行放大培养1.按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用Cytodexl微载体进行浸泡和灭菌准备。i1.以DMEM培养基为基础培养基，加入胎牛血清至使其浓度为8%，作为放大培养中使用的培养液。将培养液注入生物反应器中，并将微载体加入。以在一台150L的生物反应器中生产为例，注入8 0升培养基，按20克/升的浓度加入2100克经预处理的Cytodexl微载体.
ii1.将如步骤I所述得到的细胞悬液，接种至生物反应器中，以在一台150L的生物反应器中生产为例，按接种密度5xl05个细胞/ml接种BHK-21细胞，补充注入培养液使体积达到105升，设定氧气，氮气，空气，二氧化碳的通入比例为25%，5%，55%，15%，通气量1.0升/分钟，设定转速为IlOrpm/分钟，温度37°C。iv.按照设备使用说明，以灌流培养的方式，培养细胞4天。V.每12小时采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。三，将大规模放大培养后得到的细胞悬液转移至病毒液制备罐中，条件成熟时，接种口蹄疫病毒毒种液及毒液收获A当细胞密度达到5xl07个细胞/ml时，停止在原生物反应器上的灌流培养。将150L生物反应器中的全部105L细胞液连同载体一起，在无菌条件下转移到一个工作体积为1100L的发酵罐中，注入培养液使总体积达到1050L。B设定转速为80rpm，维持12小时，使细胞溶液处于稳定状态。C接毒及毒液收获按照病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒种毒液，设定温度为34°C，PH为7.4,溶氧为50%。接毒后6小时起,每小时用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查，并在显微镜下观察微载体上的细胞生长情况。当大于80%的细胞从微载体上脱落时，停止搅拌。静置4小时后，收获全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法测定口蹄疫病毒含量，当大于ΙΟΟΟμ g/ml时，进行灭活，稀释，乳化工艺，制备得到口蹄疫病毒疫苗。检测收获得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得结果为:三次接种的结果(μ g/ml)分别为:1535，1724，1666。按我国现行兽用生物制品质量标准进行检验和农业部对口蹄疫疫苗的相关公告进行检验，质量符合要求。实施例4一，细胞复苏和初级放大(I)取出冻存于液氮中的BHK-21细胞，置于37°C水浴中复苏，并接种入含有15%胎牛血清的DMEM培养基20ml的方瓶(T型瓶)中，在37°C，通5 % CO2的二氧化碳培养箱中培养2天。(2)将步骤(I)中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，平均分配于4个T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培养基补至总体积为20ml，继续按(I)中的条件培养2天。(3)将步骤(2)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(4)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(5)将步骤(3)中培养得到的细胞悬液，经过胰酶消化，平均分配于16个T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培养基补至总体积为20ml，继续按(I)中的条件培养2天。(6)将步骤(5)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(7)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(8)将如步骤(6)所述得到的细胞悬液，接种至10个10层的细胞工厂装置，每个装置用1500ml培养液稀释细胞悬液至接种密度为IxlO5个细胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培养箱中培养3天。(9)将步骤(8)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(10)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。(11)将如步骤(9)所述得到的细胞悬液，接种至32个10层的细胞工厂装置，每个装置用1500ml培养液稀释细胞悬液至接种密度为IxlO5个细胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培养箱中培养3天。`(12)将步骤(11)培养结束后所得的细胞全部用胰酶消化，收集。(13)采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。二,大规模对细胞进行放大培养1.按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用CytodeX3微载体进行浸泡和灭菌准备。i1.以DMEM培养基为基础培养基，加入胎牛血清至使其浓度为8%，作为放大培养中使用的培养液。将培养液注入生物反应器中，并将微载体加入。以在一台75L的生物反应器中生产为例，注入38升培养基，按21克/升的浓度加入1092克经预处理的Cytodex 3微载体。ii1.将如步骤I所述得到的细胞悬液，接种至生物反应器中，以在一台75L的生物反应器中生产为例，按接种密度3xl05个细胞/ml接种BHK-21细胞，补充注入培养基使体积达到52升，，设定氧气，氮气，空气，二氧化碳的通入比例为25%，5%，55%，15%，通气量
1.0升/分钟，设定转速为IlOrpm/分钟，温度37。。。iv.按照设备使用说明，以灌流培养的方式，培养细胞4天。V.每12小时采用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。三，将大规模放大培养后得到的细胞悬液转移至病毒液制备罐中，条件成熟时，接种口蹄疫病毒毒种液及毒液收获A当细胞密度达到5xl07个细胞/ml时，停止在原生物反应器上的灌流培养。将75L生物反应器中的全部52L细胞液连同载体一起，在无菌条件下转移到一个工作体积为550L的发酵罐中，注入培养液使总体积达到520L。B设定转速为80rpm，维持12小时，使细胞溶液处于稳定状态。C接毒及毒液收获
按照病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒种毒液，设定温度为34°C，PH为7.4,溶氧为50%。接毒后6小时起,每小时用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查，并在显微镜下观察微载体上的细胞生长情况。当大于80%的细胞从微载体上脱落时，停止搅拌。静置4小时后，收获全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法测定口蹄疫病毒含量，当大于ΙΟΟΟμ g/ml时，进行灭活，稀释，乳化工艺，制备得到口蹄疫病毒疫苗。检测收获得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得结果为:三次接种的结果(μ g/ml)分别为:1438，1587，1802。按我国现行兽用生物制品质量标准进行检验和农业部对口蹄疫疫苗的相关公告进行 检验，质量符合要求。
权利要求
1.一种在生物反应器中大规模高密度培养BHK-21贴壁细胞制备口蹄疫疫苗的方法，该方法包括以下主要步骤:1)BHK-21细胞复苏和初级放大培养；2)BHK-21细胞在生物反应器中大规模高密度培养；3)培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒种毒，收获毒液。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于:所述BHK-21细胞为贴壁细胞株，并且不经过悬浮驯化筛选，直接使用。
3.按权利要求1所 述的方法，其特征在于:所述BHK-21细胞株为已经悬浮驯化过的BHK-21悬浮细胞株，这些细胞株在所述方法的培养过程中适应为贴壁细胞株。
4.按权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述步骤2)中，根据生产规模的大小选择使用各种体积的生物反应器(例如I升，5升，7.5升，14升，40升，75升，150升，300升，和更大规模的)和各种已知的载体；这些载体包括但不局限于以下各种材料制成的载体:聚丙烯，PLA, PGA,多孔娃，PLGA, PPF等,和天然材料的葡聚糖(Cytodex I, Cytodex2,Cytodex3),胶原蛋白，琼脂,谷物蛋白等；优选使用GE公司生产的Cytodexl和Cytodex3球形微载体。
5.按权利要求1所述的应用，其特征还在于:所述步骤2)中，使用微载体的浓度为5-50克/升，优选10-40克/升，更优选15-30克/升，最优选20-25克/升；细胞的接种密度为0.8xl05个细胞/ml至9xl05个细胞/ml，优选IxlO5个细胞/ml至7xl05个细胞/ml，更优选3xl05个细胞/ml至6xl05个细胞/ml ;培养基中加入3% -15%胎牛血清或小牛血清；生物反应器的培养条件设置为:温度36.5-37.5摄氏度，溶氧DO 30% -80%, PH值7.0-7.2，转速 80-120rpm。
6.按权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述步骤2)中，当细胞达到高密度(IxlO7个细胞/ml至IOxIO7个细胞/ml)时，结束在生物反应器中的细胞培养，在无菌条件下将全部细胞液转移至一个经灭菌处理的大型细胞罐中，用步骤2)中所用的培养液稀释10倍，或更多。
7.按权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述步骤3)中，“大型细胞罐”选自各种带有普通旋转搅拌桨的大型生物反应器，也可以是一次性生物反应器；所述反应器的罐体体积选自10升，50升，75升，150升，400升，800升，1500升，3000升，甚至更大规模的。
8.按权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述步骤3)中，设定低转速(不高于150rpm)使细胞载体悬液达到相对稳定状态(不超过24小时)；然后检查细胞密度及细胞活力，当细胞密度大于或等于目标细胞密度(例如0.5xl07个细胞/毫升)时，接种口蹄疫病毒种毒。
9.按权利要求1所述的方法，其特征还在于:所述步骤3)中接种口蹄疫病毒种毒后，当大于80%的细胞从载体上脱落时，开始收获病毒液；载体与病毒液被载体截留装置分离；所述“载体截留装置”选自内置于细胞罐中，或外接在细胞罐出液口外的各种截留装置，由任何允许的经无菌处理的材料制成，选自各种形状，条件是该截留装置是能够使病毒液顺利流过而微载体被截住不进入病毒液收获容器。
10.按权利要求1所述的方法，其特征还在于:能够在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情，具体步骤为:BHK-21细胞复苏并初级放大后，经7-10天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞达到高密度(IxlO7个细胞/ml至IOxIO7个细胞/ml)，全体细胞液被转移至大型细胞罐中进行接毒及收获等步骤；此时，原生物反应器经清洗、灭菌等步骤，重新开始新 一轮疫苗生产，使一套设备的批次生产周期为8-14天。
全文摘要
本发明公开了一种将BHK-21细胞大规模高密度贴壁培养技术应用于口蹄疫疫苗生产中的方法，该方法包括以下步骤1)细胞复苏与初级放大；2)在一个中等体积的生物反应器中大规模高密度的进行细胞培养，培养完成后，将高密度的细胞液在大型细胞培养罐中稀释；3)接种口蹄疫病毒种毒并在合适条件下收获全部病毒液，经下游步骤制备口蹄疫疫苗。本发明提供的工艺方法，免去了将贴壁细胞驯化为悬浮细胞的过程；避免了现有的BHK-21细胞大规模悬浮培养制备口蹄疫疫苗技术中必需的逐级放大过程，显著简化工艺流程，缩短生产周期，同时最大程度的减小了口蹄疫病毒的逃逸，减少污染机会。
文档编号C12N7/00GK103087995SQ20121059509
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者贾馨丹 申请人:杭州国牧生物科技有限公司