用于生产萜烯的酵母细胞及其用途
【专利摘要】本发明涉及酵母细胞，其中所述细胞包含编码可溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的功能基因；所述细胞中一个或更多个编码甾醇酰基转移酶的基因缺陷或缺失；并且所述细胞对于至少组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶是原养型。另外，本发明涉及所述细胞用于生产一种或更多种萜烯的用途。此外，本发明涉及产生所述细胞以及生产一种或更多种萜烯和包含所述萜烯之药物组合物或化妆品组合物、润滑剂或变压器油的方法。
【专利说明】用于生产萜烯的酵母细胞及其用途
[0001]本发明涉及酵母细胞，其中所述细胞包含编码可溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的功能基因；所述细胞中一个或更多个编码甾醇酰基转移酶的基因缺陷或缺失；并且所述细胞对于至少组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶是原养型。另外，本发明涉及所述细胞用于生产一种或更多种萜烯的用途。此外，本发明涉及产生所述细胞以及生产一种或更多种萜烯和包含所述萜烯之药物组合物或化妆品组合物、润滑剂或变压器油的方法。
[0002]在今天的制药、化妆品和化学工业中，各种萜烯越来越重要。萜烯被用作例如药物和化妆品组合物的添加剂，用作疫苗中的佐剂，用作皮肤润湿剂，用作粘液溶解剂，用作外激素，用作激素，用于害虫防治，用作润湿剂，用作芳香剂，用作润滑剂，用作抗微生物剂，用作抗炎药，用作食品添加剂，用作电绝缘物，用作变压器油或变压器油添加剂，以及用作化学、制药和化妆品工业中有用的原料化学品。萜烯还可用作用于化学目的的天然和可持续来源。
[0003]在化学上,職烯衍来源于一个或更多个异戍二烯单位(亦称作prenyl unit)。异戊二烯具有化学式CH2=C (CH3) -CH=CH20另外，通过与杂原子如氧或氮缀合，萜烯可被修饰为萜类(其也称作类异戊二烯)。
[0004]事实上，大部分萜烯以次生代谢物发现于植物、真菌和动物中。另外，多种细菌产生萜烯。萜烯可包含不同数目的异戊二烯单位。半萜及其衍生物包含单个异戊二烯单位，包括例如异戊烯醇(prenol)和异戊酸。单萜及其衍生物包含两个异戊二烯单位，包括例如香叶醇、朽1檬烯和松油醇(terpineol)。倍半職烯及其衍生物包含三个异戍二烯单位,包括例如法呢烯(farnesene)、法尼醇(farnesol)。二職及其衍生物由四个异戍二烯单位构成,包括例如焦磷酸香叶基香叶酯(geranylgeranyl pyrophosphate)、咖啡醇(cafestol)、咖啡豆醇(kahweol)、松柏烯(cembrene)和紫衫烯(taxadiene)(紫杉醇的前体)、视黄醇、视黄醛和叶绿醇。二倍半萜及其衍生物包含五个异戊二烯单位，包括例如二倍半萜是香叶基法尼醇。三職包含六个异戍二烯单位，包括例如角S烯(squalene)、羊毛固醇(Ianosterol)和环阿屯酯(cycloartenol)。四職包括例如无环番爺红素(acyclic lycopene)、单环Y-胡萝卜素以及双环a和(6-胡萝卜素。多萜由多个异戊二烯的长链构成，包括天然橡胶和古塔波胶(gutta-percha)。
[0005]绝大部分萜烯来源于酶催化的甲羟戊酸途径。在此处，萜烯的形成始于乙酰-辅酶A(CoA)。两个乙酰-Cok分子在酶催化下反应形成一个乙酰乙酰-Cok分子。下一步，乙酰乙酰-CoA与另一乙酰-CoA分子反应形成3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA (羟甲基戊二酸-CoA (hydroxymethylglutaryl-CoA), HMG-CoA) ? 下一步，HMG-CoA 被还原成甲轻戍酸。该反应由酶HMG-CoA还原酶催化，通常是萜烯生物合成的限速步骤。因此，HMG-CoA还原酶被认为是甲羟戊酸途径的关键酶。
[0006]甲羟戊酸通常磷酸化两次并且去羧基成为异戊烯基焦磷酸(isopentenylpyrophosphate, IPP)。通过连续的异构化、缩合和脱氢步骤，IPP转化成香叶基焦磷酸，其与另一 IPP单位结合形成法呢基焦磷酸。两分子法呢基焦磷酸还原缩合成为角鲨烯，其可转化成胆固醇和任意类固醇激素。[0007]或者，香叶基焦磷酸和法呢基焦磷酸可进一步反应成为更高级萜烯，例如四萜和多萜。
[0008]较为重要的萜烯是三萜角鲨烯。全世界每年生产约2000吨角鲨烯。这产生约1.25亿美元的年贸易额。在技术上，角鲨烯优选地用作营养添加剂，用在化妆品和制药工业中。此外，萜烯也用作可生物降解的润滑剂，以及用作变压器油。角鲨烯可用作抗氧化剂，并且还通常用作疫苗中的佐剂。
[0009]传统上，角鲨烯获自生物来源，例如鱼油，特别是鲨鱼肝油。然后，角鲨烯通过费力的程序纯化自鱼油的复杂组合物。在制药领域，待批准产品的可追溯性对于卫生当局(Health Authorities)很重要。但是，在产品包含来自动物来源的产品时，很难弄清楚这种可追溯性。例如，很难精确知道鱼(例如鲨鱼)在被杀死前吃的是什么。因此，对于药用物品，重要的是使用符合GMP的原材料，这意味着从来源可正确得到其可追溯性。另外，多种鲨鱼物种是受到灭绝威胁的濒危物种。角鲨烯之外的萜烯同样地获自生物材料，并且必须借助费力且通常有危险的程序来纯化。
[0010]因此，需要生产萜烯(例如，角鲨烯)的替代性方法。用经遗传修饰酵母菌株较高产率地生产角鲨烯的用途已经得到证明(EP0486290)。但是，所描述的酵母菌株还产生大量类固醇，例如麦角固醇。类固醇的产生降低了角鲨烯和其他萜烯的产率。另外，大量类固醇杂质的存在需要复杂的方法来从原材料中纯化角鲨烯和其他萜烯。
[0011]迄今为止，本领域中已知的经遗传修饰生物(GMO)生产的萜烯的浓度对于萜烯的有效工业生产来说太低，并且具有太多杂质。
[0012]另外，一般认为经遗传修饰生物在遗传上较不稳定，在培养时通常比相应的野生型细胞具有更低的生存力和/或生长动力学。因此，在批量培养所述细胞时，所述批次的生产力通常随时间快速下降。这通常妨碍经遗传修饰生物在各种工业生产方法中的有效使用。
[0013]另外，当通过插入一个或`更多个外源基因产生经遗传修饰生物时，该生物的一个或更多个原始基因被所述外源基因代替。这可具有使细胞成为针对某些有机营养的营养缺陷型的优点，这一优点可用于选择的目的。另外，在某些细胞培养条件下，已知营养缺陷型能够具有细胞繁殖上的优点。在某些情况下，原养型细胞甚至被营养缺陷型细胞超过。例如，已经描述在氨受限的生长条件下，在培养30代后组氨酸原养型ho Λ::HIS3酵母细胞被相应的组氨酸营养缺陷型细胞HO his3超过(Pronk，2002)。因此，经遗传修饰生物通常以营养缺陷菌株培养。但是，使用营养缺陷型细胞明显限制了对培养基的自由选择。
[0014]鉴于以上内容，对于以下生物具有尚未满足的需求:即生产浓度和纯度对于工业应用来说足够高的萜烯并且遗传上足够稳定的生物。
[0015]因此，本发明的技术问题在于提供具有改进的萜烯生产力以及改进的遗传和表型稳定性的生物。
[0016]出乎意料地，发现以下酵母细胞具有高萜烯生产力并且在细胞培养时具有改进的遗传和表型稳定性，所述酵母细胞包含编码可溶性羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶的功能基因，其中一个或更个编码留醇酰基转移酶的基因缺失，并且所述酵母细胞对于组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶是原养型。预期地，编码留醇酰基转移酶的基因的缺失导致较低水平的甾醇酯。但是，出乎意料地，编码留醇酰基转移酶的基因的缺失并未导致留醇的积累，而是导致萜烯(例如角鲨烯)的积累。
[0017]产生的细胞形成稳定的细胞系，并且在培养超过30代时是遗传稳定的。在本文中，出乎意料地发现组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原养型细胞比相应的营养缺陷细胞具有更高的遗传和表型稳定性。
[0018]在第一个方面，本发明涉及酵母细胞，其中:
[0019]a)所述细胞包含编码可溶性羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶的功能基因；
[0020]b)所述细胞中一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因缺陷或缺失；和
[0021]c)所述细胞是至少组氨酸、亮氨酸或尿啼唳原养型，优选地，其中所述细胞至少是组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶原养型，特别地，所述细胞是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原养型。[0022]本文使用的术语“酵母细胞”可广义理解为任意酵母生物的细胞。优选地，酵母细胞可以是酵母属(Saccharomyces)细胞，特别是选自以下的酵母属细胞:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、德氏酵母(Saccharomyces delbrackii)、意大利酵母(Saccharomyces italicus)、捕圆酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、发酵酵母(Saccharomyces fermentati)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、克鲁斯假丝酵母(Saccharomyces krusei)、乳酸酵母(Saccharomyces Iactis)、马克酵母(Saccharomycesmarxianus)、小捕圆酵母(Saccharomyces microellipsoides)、山地酵母(Saccharomycesmontanus)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、撤揽酵母(Saccharomyces oleaceus)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、布雷多伦酵母(Saccharomyces pretoriensis)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、路德类酵母(Saccharomycodes Iudwigii)。最优选地，细胞是酿酒酵母细胞。酿酒酵母细胞可以是任意菌株的细胞，优选如在实施例中示例性使用的菌株AH22的细胞。
[0023]或者，所述细胞可以是非酵母属(non-Saccharomyces)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)、马克斯克鲁维酵母马克斯变种(Kluyveromycesmarxianus var.marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)和多变假丝酵母(Candida versatilis)、毕赤酵母属(Pichia)如树干毕赤酵母(Pichia stipidis)、巴斯德毕赤酵母(Piachia pastoris)和嗜木糖醇毕赤酵母(Pichia sorbitophila)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、复膜抱酵母属(Saccharomycecopsis)、类酵母属(Saccharomycodes)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、威克酵母属(Wickerhamia)、德巴利酵母属(Debayomyces)、有孢汉逊酵母(Hanseniaspora)、克勒克酵母属(Kloeckera)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、甲醇诱导型酵母属(Ogataea)、Kuraishia、Komagataella、梅奇酵母属(Metschnikowia)、拟威尔酵母属(Williopsis)、Nahazawaea^隐球菌属(Cryptococcus)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、孢酵母属(Bullera)、红酵母属(Rhodotorula)、Willopsis 或掷抱酵母属(Sporobolomyces)。
[0024]本文中使用的术语“功能基因”是指在酵母细胞中具有活性的基因。因此，在合适的条件下，基因可在酵母细胞中转录和翻译，并且可表达可溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶多肽。在整个发明中使用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换地理解。
[0025]术语“可溶性羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶”可最广义地理解为催化还原羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)成为甲羟戊酸的可溶形式的酶。本文使用的术语“羟甲基戊二酰辅酶A”、“羟甲基戊二酰-CoA”、“3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA”、“3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA”、“ P -羟基-P -甲基-戊二酰-CoA”、“ P -羟基-P -甲基戊二酰-CoA”、“beta-羟基-beta-甲基-戊二酰-CoAbeta-羟基-beta-甲基戊二酰-CoA”和“HMG-CoA”可互换地理解。
[0026]优选地，与野生型形式的HMG-CoA还原酶相比，本发明的可溶性HMG-CoA还原酶可不受野生型HMG-CoA的一种或更多种抑制剂的抑制，所述抑制剂例如甲羟戊酸、胰高血糖素、胆固醇、L-羟胆固醇、低密度脂蛋白和胆汁酸。
[0027] 最优选地,如在实施例中示例性使用的,可溶性HMG-CoA还原酶是截短的HMG-CoA还原酶(tHMGl)。该截短的tHMGl在Basson等(Basson等，1988)中进一步描述,和/或由SEQ ID NO:1的DNA序列编码。
[0028]应理解，本发明的可溶性HMG-CoA还原酶还可以是一种或更多种翻译后修饰的产物。翻译后修饰是本领域中周知的，可包括但不限于酯化、磷酸化、硫酸化、糖基化、截短、数个氨基酸部分的环化、多肽链的环化、氧化、还原、脱羧、乙酰化、酰胺化、脱氨基、二硫键形成、焦谷氨酸盐/酯形成、氨基酸添加、辅因子添加(例如，生物素化、血红素添加)和金属离子、非金属离子、肽或小分子的络合、以及铁-硫化物簇的添加。显然，辅因子例如ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、NADPH+H+、金属离子、阳离子、脂质等可与多肽结合，而不论这些辅因子的生物学影响如何。
[0029]本文使用的术语“可溶性”是指具有降低的膜结合性质的酶形式。优选地，超过50 %的本发明的可溶性HMG-CoA分子不整合进或附接到细胞膜上，更优选地，超过60 %的本发明的可溶性HMG-CoA分子不整合进或附接到细胞膜上，更优选地，超过70%的本发明的可溶性HMG-CoA分子不整合进或附接到细胞膜上，更优选地，超过80 %的本发明的可溶性HMG-CoA分子不整合进或附接到细胞膜上，更优选地，超过90 %的本发明的可溶性HMG-CoA分子不整合进或附接到细胞膜上，最优选地，超过95%的本发明的可溶性HMG-CoA分子不整合进或附接到细胞膜上。优选地，可溶性HMG-CoA还原酶存在于本发明的酵母细胞的胞浆中。
[0030]本文使用的术语“留醇酰基转移酶”是指任何催化形成留醇酰基酯的酶。留醇酰基转移酶可以是留醇0-酰基转移酶。本文使用的术语“留醇0-酰基转移酶”、“留醇酯合酶”和“酰基-CoA:留醇酰基转移酶”可互换地理解。在本发明上下文中，留醇0-酰基转移酶优选酵母留醇0-酰基转移酶(EC2.3.1.26)。更优选地，留醇0-酰基转移酶是在实施例中示例使用的一种或两种留醇0-酰基转移酶的基因产物，因此，是酵母的AREl基因和/或ARE2基因。
[0031]AREl基因也称作SAT2基因，有序基因座名称YCR048W或ORF名称YCR48W。ARE2基因也称作SATl基因，有序基因座名称YNR019W或ORF名称N3206。
[0032]在本发明的酵母细胞的情况下，编码留醇酰基转移酶的基因缺失或缺陷。本文使用的术语“缺失”是指基因或者基因的一个或更多个部分被移除。基因不转录，并且无基因产物产生，因此没有相应的多肽产生。可理解，不需要整个基因都从基因组中移除。优选地，超过基因的50%、更优选超过基因的60%、更优选超过基因的70%、更优选超过基因的80%、更优选超过基因的90%、更优选超过基因的95%、最优选基因的100%缺失。缺失可以是末端缺失或中间缺失。其可由实验者或自然造成。可通过本领域中已知的任何方法使基因缺失。例如，可通过交换(cross over)或使用ere重组酶程序使基因缺失(Guldener等，1996)。
[0033]本文使用的术语“缺陷”是指基因不转录或基因编码无功能的基因产物(因此，无功能的多肽)。在留醇酰基转移酶基因的情况下，术语“无功能”是指与相应的野生型多肽相比，该多肽具有小于50%、优选小于40%、更优选小于30%、更优选小于20%、更优选小于10%、更优选小于5%、更优选小于4%、更优选小于3%、更优选小于2%、最优选小于I%的酰基转移酶效率。
[0034]如在实施例中示例性示出的，AREl和/或ARE2基因可优选地缺失，特别地，AREl和ARE2基因缺失。可通过本领域中已知的任意方法使基因缺陷。例如，可通过实验者或自然(例如，辐射、化学剂或自发)引起的非特定诱变或通过定点诱变(例如，通过PCR)使基因缺陷。其可由移码突变或点突变(单个核苷酸改变)引起。
[0035]在整个发明中，术语“原养型”可最广义地理解为具有合成细胞生长所需的特定有机化合物的能力。在本发明的情况下，酵母细胞可以是组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶原养型。因此，细胞能够独自合成组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶，因此能够在不含组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的培养基中以及不含组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的细胞培养板上生长。可理解，酵母细胞还可以是其他营养因子原养型。
[0036]在一个优选实施方案中，本发明的酵母细胞是稳定细胞系的细胞，优选比以下相应细胞更稳定:至少是组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型，更优选组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或者亮氨酸和尿嘧啶的营养缺陷性，更优选是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型。
[0037]本文使用的术语“稳定细胞系”应理解为保持其与本发明的背景相关的表型特性的细胞群。这些相关特性主要是生存力、生长和/或萜烯生产力，最优选生存力、生长和萜烯生产力。
[0038]本领域技术人员将理解，稳定的细胞系优选地也是遗传稳定的。
[0039]与培养30代之前的酵母细胞相比，在培养了 30代时，萜烯生产力优选地降低不超过50 %、更优选降低不超过30 %、更优选不超过20 %、更优选不超过10 %、更优选不超过
8%、更优选不超过6 %、更优选不超过4 %、最优选不超过2 %。
[0040]另外，与培养30代之前的酵母细胞相比，在培养了 30代时，细胞增殖速率优选地降低不超过50 %、更优选降低不超过30 %、更优选不超过20 %、更优选不超过10 %、更优选不超过8 %、更优选不超过6 %、更优选不超过4 %、最优选不超过2 %。
[0041]此外，在培养超过10、超过20、超过30、超过40、超过50、超过60、超过70、超过80、超过90、超过100、超过150或超过200代后，本发明酵母细胞的萜烯生产力优选地未降低超过20%。
[0042]同样地，在培养超过10、超过20、超过30、超过40、超过50、超过60、超过70、超过80、超过90、超过100、超过150或超过200代后，本发明酵母细胞的细胞增殖速率优选地未降低超过20%。
[0043]在整个发明中，术语“营养缺陷型”可最广义地理解为酵母细胞无法合成其生长所需的特定有机化合物。在本发明的情况下，酵母细胞可以是组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶营养缺陷型。因此，细胞无法自己合成组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶，因此无法在不含组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的培养基和不含组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的细胞培养板中生长。营养缺陷型酵母需要在培养基中分别补充组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶。应理解，酵母细胞还可以是其他营养因子营养缺陷型，所述其他营养因子包括但不限于维生素、氨基酸、糖和脂质酸。
[0044]本文使用的术语“至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型的相应细胞”是指与本发明的细胞具有相同遗产来源的细胞。至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型的相应细胞也包括编码可溶性HMG-CoA还原酶的功能基因。另外，所述细胞中一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因缺陷或缺失。本发明的细胞与至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型的相应细胞之间唯一的遗传差异是后者至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型。优选地，细胞是酵母属细胞。更优选为酿酒酵母细胞，更优选为菌株AH22的酿酒酵母细胞，更优选地为来源于由菌株AH22得到的酵母菌株AH22tH3的细胞，更优选地来源于菌株AH22tH3ura8，更优选地来源于菌株AH22tH3ura8 A are I或AH22tH3ura8 A are2中的一种。最优选地，至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的营养缺陷型的相应细胞是实施例中示例性示出的菌株AH22tH3ura8 A are I A are2的酵母细胞。
[0045]在一个优选实施方案中，所述细胞是经遗传修饰细胞。
[0046]本文使用的术语“经遗传修饰细胞”可最广义地理解为基因已经通过本领域中任何已知方法修饰的细胞，也称为经遗传修饰生物(GMO)。细胞本身可以是经修饰的或可以是经遗传修饰细胞的后代。通常GMO由人实验产生，例如借助以下手段的非特异性或特异性诱变:辐射(例如，紫外线(UV)辐射、X-线辐射、放射性/核辐射(例如，a -、0 -或Y -辐射)或宇宙辐射)或一种或更多种诱变剂(例如，针对核苷碱基的烷化剂(例如，氮芥(例如，环磷酰胺、甲二氯二乙胺或双氯乙基甲 胺(mustine) (HN2)、乌拉莫司汀或尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素)、烷基磺酸盐(例如，白消安)、噻替派及其类似物、钼衍生物(例如，顺钼、卡钼、奈达钼、奥沙利钼、赛特钼、四硝酸三钼)、甲基苄肼、六甲蜜胺、黄曲霉毒素和黄曲霉毒素及其代谢产物和衍生物、亚硝酸盐、苯胺及其代谢产物和衍生物、苯及其代谢产物和衍生物、多环芳香烃及其代谢产物和衍生物))、亚硝胺、砷、石棉、铍及其络合物、环氧乙烷、六价铬(VI)化合物、氡、氯乙烯、吸烟等)。但是，突变也可以是自发的。
[0047]在一个优选实施方案中，所述细胞是酵母属细胞，更优选地，其中所述细胞是酿酒酵母，特别地，其中所述细胞来源于酿酒酵母细胞菌株AH22。
[0048]菌株AH22的酵母细胞购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection, ATCC)，ATCC 号 38626。最初，AH22 菌株具有 leu2-双突变，基因型 a’ Ieu2-31eu2-112his4-519canl 来源于野生型菌株 S288c (Hinnen 等，1978)。S288c菌株(Mortimer等，1985)也可以ATCC号26108商购得到。优选地，本发明的酵母细胞是酿酒酵母细胞，其来源于由菌株AH22的细胞得到的菌株AH22tH3，更优选地来源于 AH22tH3ura8，更优选地来源于菌株 AH22tH3ura8 A arc 1、AH22tH3ura8 A are2或 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2 中的一种，更优选地来源于 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2,更优选地来源于菌株 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H> AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2U> 或AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2L中的一种。最优选地，本发明的酵母细胞是实施例中示例性示出的菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL的酵母细胞。
[0049]在另一个优选实施方案中,可溶性HMG-CoA还原酶的特征在于:
[0050]a)它是缺少膜结合区的截短的可溶性HMG-CoA还原酶蛋白；
[0051]b)它编码在载体上处于在所述细胞中有活性的启动子的转录控制下；和/或
[0052]c)它在组成型启动子的控制下，特别是在强组成型启动子的控制下表达。
[0053]在本发明上下文中，术语“截短的可溶性HMG-CoA还原酶蛋白”是指在组成的氨基酸链的长度方面，长度比野生型HMG-CoA还原酶蛋白短的HMG-CoA还原酶蛋白。优选地，所述HMG-CoA还原酶蛋白缺少野生型蛋白的膜结合区。
[0054]本文使用的术语“膜结合区”是指多肽链中与整合到膜中或附接到膜上有关的区域。在本领域中已知HMG-CoA还原酶的氨基末端525氨基酸主要整合到膜内(Basson等，1988)。
[0055]因此，在本发明的情况下，优选地，多至位于约450至500、约500至510、约510至520、约 520 至 530、约 530 至 540、约 540 至 550、约 550 至 560、约 560 至 570、或约 570 至
600位氨基酸的氨基末端的氨基酸可被截短。例如，多至氨基酸552的氨基酸(即，因此氨基酸I至552)可被截短(Polakowski等，1998)。更优选地,如Basson等(Basson等，1988)等描述的，截短的可溶性HMG-CoA还原酶是tHMGl。tHMGl由SEQ ID NO:1的DNA序列编码。
[0056]与野生型形式的HMG-CoA还原酶相比,本发明的截短的可溶性HMG-CoA还原酶可不受野生型HMG-CoA还原酶的一种或更多种抑制剂抑制，所述抑制剂例如甲羟戊酸、胰高血糖素、胆固醇、L-羟胆固醇、低密度脂蛋白和胆汁酸。
[0057]最优选地,可溶性HMG-CoA还原酶是实施例中示例性使用的截短的HMG-CoA还原酶 tHMGl。该 tHMGl 还被 Basson 等(Basson 等，1988)描述，和 / 或由 SEQ ID NO:1 的 DNA序列编码。
[0058]如上所述，应理解本发明的可溶性HMG-CoA还原酶也可以是一种或更多种翻译后修饰的产物。翻译后修饰是本领域中周知的，可包括但不限于酯化、磷酸化、硫酸化、糖基化、截短、多个氨基酸部分的环化、多肽链的环化、氧化、还原、脱羧、乙酰化、酰胺化、脱氨基、二硫键形成、焦谷氨酸形成、氨基酸添加、辅因子添加(例如，生物素化、血红素添加)和金属离子、非金属离子、肽或小分子的络合、以及铁-硫化物簇的添加。显然，辅因子例如ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、NADPH+H+、金属离子、阳离子、脂质等可与多肽结合，而不论这些辅因子的生物学影响。
[0059]在本文上下文中使用的术语“载体”可指将遗传信息转移到酵母细胞中的任何组合物。遗传信息可被编码成脱氧核苷酸(DNA)(双链DNA (dsDNA)、单链DNA (ssDNA))，核糖核酸(RNA)(单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsDNA))，或DNA类似物如肽核酸(PNA)、吗啉基(morpholino)、甘油核酸(GNA)、苏阿糖核酸(TNA)或甲基化DNA。优选地，遗传信息被编码成DNA。载体可以是本领域中已知的任何载体，例如线性载体、环状载体、病毒载体或细菌载体。优选地，载体包含线性DNA或环状DNA，更优选环状DNA，特别是质粒。可通过本领域中已知的任何方法将载体插入到细胞中，并且其使用可联合或不联合转染剂(例如，醋酸锂、聚乙烯亚胺(PEI)、fugene、LT-1> JetPEI> transfectamine、脂质体(Iipofectamine)、UptiFectin、PromoFectin、GenePORTER、Hilymax、碳纳米纤维、碳纳米管、细胞渗透肽(CPP)、蛋白转导结构域(PTD)、脂质体、DEAE葡聚糖、树状聚合物)、联合或不联合电穿孔、联合或不联合基因枪、联合或不联合光学转染、联合或不联合基因电转移、联合或不联合穿刺转染、联合或不联合磁转染、和/或联合或不联合磁铁辅助的转染。优选地，载体是环状DNA载体，更优选地，载体是质粒。质粒可以是本领域中已知的任何质粒，例如YEpH2或PUC19质粒。载体也可以是线性表达盒，其可整合或未整合在靶细胞的基因组中。但是，应理解也可使用其他任何载体。
[0060]术语“在转录控制下”是指启动子调控基因的转录速率。转录速率是指每单位时间间隔与载体DNA的反义链区段互补的信使RNA(mRNA)的产生速率。
[0061]本文使用的术语“启动子”可最广义地理解为有助于编码可溶性HMG-CoA还原酶的基因转录的DNA区域。启动子可位于基因附近，可位于同一链上并且在上游。上游是指其定位于朝向编码可溶性HMG-CoA还原酶的有义链的5'区域。启动子可以是同源启动子或异源启动子。最优选地，使用在实施例中示例性示出的启动子。
[0062]术语“表达”可最广义地理解为将遗传信息转换成多肽链。
[0063]术语“组成型启动子”可最广义地理解为普遍未受调节的启动子，其允许连续转录其相关的基因。术语“强组成型启动子”是指具有高转录速率的启动子。
[0064]另外，在一个优选实施方案中，编码留醇酰基转移酶的一个或更多个基因是AREl和/或ARE2，优选AREl和ARE2都基因缺陷或缺失。
[0065]另外地或可替代地 ，对留醇酰基酯的形成有影响的其他基因也可缺陷或缺失。
[0066]在一个优选实施方案中，所述细胞的萜烯生产力，优选三萜生产力，特别是角鲨烯生产力与以下细胞相比至少相当，优选增加:相应的野生型细胞和/或至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶营养缺陷型，优选组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型，更优选组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的相应细胞。
[0067]术语“萜烯”可最广义地理解为由异戊二烯衍生的任何分子结构。优选地，本发明的萜烯是包含至少两个异戊二烯单位的萜烯，更优选包含三个异戊二烯单位的萜烯，更优选包含四个异戊二烯单位的萜烯，更优选包含五个异戊二烯单位的萜烯，更优选包含六个异戊二烯单位的萜烯，特别地，萜烯是三萜。
[0068]优选地，所述萜烯是来源于甲羟戊酸途径的萜烯。这些萜烯包括但不限于角鲨烯、胡萝卜素(例如，a -胡萝卜素、P -胡萝卜素、Y -胡萝卜素、S -胡萝卜素、e-胡萝卜素、胡萝卜素)、类胡萝卜素、视黄酸酯(retinoate)、视黄酸络合物、视黄酯、视黄醛(全-反-视黄醛、11-顺-视黄醛)、视黄醇(维生素A、全-反-视黄醇、11-顺-视黄醇)、法呢烯、法呢醇、香叶烯、香叶醇、异戊烯、醌醇(例如，叶绿醌醇、质体醌醇、泛醌醇、甲基萘醌醇)、植烯(phytene)、植烯醇(phytenol)、香叶基香叶烯、香叶基香叶醇、叶黄素(例如，紫黄质、玉米黄质)、异戍醇(isopentol)、朽1檬烯、朽1檬
醇(Iimonol)、菔烯、菔烯醇(pinol)、保幼激素 II1、^--异戍烯(undecaprene)、^--
异戍烯醇(undecaprenol)、^--异戍烯糖(undecaprenyl sugar)、贝壳杉烯、贝壳杉
醇(kaurenol)、植物抗毒素、甜椒醇(capsidiol)、愈创木奥(guaiaazulene)、赤霉素(giberillin)、橡胶、生育酹(tocopmerol)、叶绿素、醌(例如，叶绿醌、质体醌、泛醌、甲基萘醌)、多職醇、多職基糖(dolechyl sugar)、前植物烯(prephytoene)、八氢番爺红素、八氢番爺红素醇(phytoenol)、六氢番爺红素、六氢番爺红素醇(phytofluenol)、链孢红素、番爺红素(Iycopene)、番爺红素醇(Iycopenol)、番爺红素(Iycoprene)、和番爺红素醇(Iycopreno I)、咖啡醇、咖啡豆醇、松柏烯、松柏醇(cambreno I)、紫衫烯、紫杉醇(paclitaxel、taxol)、二倍半職、环阿屯醇、天然橡胶或古塔波胶。
[0069]萜烯可包含或不包含一个或更多个杂原子，优选氧和/或氮。应理解，包含一个或更多个羟基的萜烯也可与以下物质酯化:例如磷酸、焦磷酸、一个或更多个脂肪酸、一个或更多个氨基酸、一个或更多个多肽、和/或一个或更多个短肽。另外，包含一个或更多个氨基的萜烯可与以下物质酰胺化:例如磷酸、焦磷酸、一个或更多个脂肪酸、一个或更多个氨基酸、一个或更多个多肽、和/或一个或更多个短肽。另外，包含一个或更多个羧基的萜烯可与以下物质酰胺化:例如一个或更多个氨基酸、一个或更多个多肽、和/或一个或更多个短肽；和/或可与以下物质酯化:例如一个或更多个辅酶(例如，辅酶A (CoA))、一个或更多个糖、一个或更多个氨基酸、一个或更多个多肽、和/或一个或更多个短肽。优选地，萜烯是未缀合的或者与磷酸、焦磷酸和/或CoA酯化。更优选地，萜烯是未缀合的。最优选的，萜烯是实施例中示例性示出的角鲨烯。
[0070]术语“萜烯生产力”可理解为酵母细胞的任何萜烯的生产力。优选地，萜烯生产力是指甲羟戊酸途径的萜烯生产力，更优选角鲨烯生产力。
[0071]在整个发明中，术语“生产力”可最广义地理解为本发明的细胞产生特定分子的能力。生产力可通过特定时间段内细胞产生的所述分子的量来量化。因此，生产力可理解为特定分子随时间的产生。优选地，一批细胞的生产力可如下量化:每体积培养液中特定分子的质量，每个细胞中所述分子的质量`、或每细胞干质量的重量百分比(w/w)。如果将两种菌株(例如本发明的菌株和相应的野生型菌株)彼此比较，那么相对生产力用萜烯生产的每重量百分比增加或降低来量化。
[0072]本发明上下文中使用的术语“野生型”是指同一物种未经基因修饰的酵母细胞。野生型细胞可优选地与本发明的酵母细胞来源于相同菌株。更优选地，野生型细胞不包含编码可溶性HMG-CoA还原酶的功能基因和/或所述野生型细胞包含功能AREl基因和/或功能ARE2基因。野生型细胞可以是天然存在的细胞和/或可由细胞库(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC))得到。
[0073]术语“相应的野生型细胞”是指与本发明的细胞来源于相同基因来源的野生型细胞，但是其中未发生一个或更多个基因突变。相应的野生型细胞与本发明的酵母细胞为相同物种和来源于相同菌株。另外，相应的野生型细胞可优选地不具有AREl和/或ARE2基因、特别是AREl和ARE2基因的缺失或缺陷。优选地，野生型细胞是酵母细胞，更优选酵母属细胞，更优选酿酒酵母细胞，更优选酿酒酵母细胞的商购菌株，更优选酿酒酵母细胞菌株AH22或S288c。最优选地，野生型细胞是酿酒酵母细胞菌株AH22。
[0074]术语“相当(equivalent) ”是指与上文定义的相应的野生型细胞和/或相应的营养缺陷型细胞相比萜烯生产力相同，其具有+ / -20%误差范围，更优选+ / -10%误差范围，更优选小于10%误差范围。
[0075]在一个优选实施方案中，所述细胞产生减少量的留醇酰基酯，优选地，其中所述细胞的留醇酰基酯的生产缺陷。
[0076]本文使用的术语“减少量”是指生产较少量的留醇酰基酯。减少量的生产可指甾醇酰基酯的生产力是相应野生型细胞所生产量的少于100 %、少于50 %、少于40 %、少于30%、少于20%、少于10%、少于8%、少于6%、少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、或甚至少于I %。例如，相应的野生型细胞可以是AH22菌株的酵母细胞或S288c菌株的酵母细胞，特别是AH22菌株的酵母细胞。
[0077]术语“留醇酰基酯的生产缺陷”可理解为留醇酯的形成极大减少。应理解在生物系统中，始终存在基础水平的非特异性活性。因此，本文中使用的术语“极大减少”可指浓度是相应野生型细胞中浓度的少于5%、优选少于I %、更优选少于0.5%、更优选少于0.1 %。
[0078]本发明的第二个方面涉及产生本发明的细胞的方法，所述方法包括:
[0079]a)将编码可溶性HMG-CoA还原酶的基因插入到酵母细胞中；
[0080]b)选择包含编码所述可溶性HMG-CoA还原酶的基因的细胞；
[0081]c)使所述细胞中一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因缺失或突变；
[0082] d)将所述细胞转化成至少针对以下的原养型细胞:组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶，优选组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶，更优选组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶，转化如下所述实施:
[0083](i)插入编码一种或更多种产生组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的基因盒，和/或
[0084](ii)回复诱变编码一个或更多个产生组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的缺陷基因，
[0085]特别地，通过回复诱变编码产生组氨酸的酶的缺陷基因，和通过插入编码产生亮氨酸和尿嘧啶的酶的基因盒；
[0086]e)选择组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的原养型细胞，优选至少是组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶的原养型细胞，特别是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的原养型细胞；和任选地
[0087]f)培养步骤e)的细胞；和任选地
[0088]g)分离和稳定步骤e)或f)的细胞。
[0089]以上详细说明了酵母细胞及其功能特征。应理解本文中定义的特征也适合于由本发明的方法产生的细胞。
[0090]本文中使用的术语“产生细胞”可广义理解为提供本发明的细胞。应理解母细胞可是任意酵母细胞。优选地，所述细胞是野生型菌株细胞。例如，如上文详细说明的，野生型菌株可以是AH22菌株或S288c菌株，优选AH22菌株。最优选地，如实施例中示例性示出的产生细胞。
[0091]术语“将基因插入......”是任何将基因整合到酵母细胞中的方法。基因可编
码在任意遗传信息的载体上，例如DNA(双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA))、RNA(单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA))、DNA类似物如肽核酸(PNA)、吗啉基、甘油核酸(GNA)、苏阿糖核酸(TNA)或甲基化DNA或其杂合物。优选地，基因编码在DNA上，更优选双链DNA，特别是环状双链DNA链,特别是质粒。质粒可以是本领域中已知的任何质粒。例如，质粒可以是YEpH2或pUC质粒。最优选地,可如实施例示例性示出的插入一个或更多个基因。[0092]可将遗传信息作为载体插入到细胞中。如上文详细说明的，载体可以是本领域中已知的任何载体,例如线性载体、环状载体、病毒载体或细菌载体。优选地,载体包含线性DNA或环状DNA，更优选环状DNA，特别是质粒。可通过本领域中已知的任何方法将载体插入到细胞中，并且使用时可联合或不联合转染剂(例如，聚乙烯亚胺(PEI)、Fugene、LT-1, JetPE1、transfectamine、月旨质体(Iipofectamine)、UptiFectin、PromoFcctin、GenePORTER、Hilymax、碳纳米纤维、碳纳米管、细胞渗透肽(CPP)、蛋白转导结构域(PTD)、脂质体、DEAE葡聚糖、树状聚合物)、联合或不联合电穿孔、联合或不联合基因枪、联合或不联合光学转染、联合或不联合基因电转移、联合或不联合穿刺转染、联合或不联合磁转染、和/或联合或不联合磁铁辅助的转染。优选地，所述载体是环状DNA载体，更优选地，所述载体是质粒。质粒可以是本领域中已知的任何质粒，例如YEpH2或pUC19质粒。但是，应理解也可使用所有其他载体。
[0093]插入的基因在细胞中可以是活跃的或不活跃的(passive)。优选地，插入的基因可在细胞中活跃转录和表达为核外质粒、核内质粒、核外线性载体、核内线性载体或可插入到酵母细胞的基因组中。如本文使用的，术语“基因组”是指酵母细胞的整个遗传信息。优选地，编码可溶性HMG-CoA还原酶的基因插入在所述酵母细胞的基因组中。任选地，HMG-CoA还原酶可代替其他基因，例如尿嘧啶原养型基因，例如ura3基因。然后，所得细胞是尿嘧啶营养缺陷型。
[0094]优选地，编码可溶性HMG-CoA还原酶的所述基因在酵母细胞中表达，因此，由所述细胞产生可溶性HMG-CoA还原酶。
[0095]在整个发明中，术语“选择细胞”是指使细胞群的期望部分富集。最优选地，如实施例中示例性示出地选择细胞。
[0096]在细胞包含编码所述可溶性HMG-CoA还原酶的基因的情况下，使细胞群中包含所述基因的细胞富集。可在悬浮培养物中或固体物质的培养平板(例如，琼脂平板)上选择细胞。可如下选择细胞:稀释细胞`并且用其划线以产生仅来源于单细胞的菌落。优选地，随后测试这些菌落中编码所述可溶性HMG-CoA还原酶的基因的存在。或者，可通过确定萜烯的生产力从功能上测试细胞。另外地或可替换地，也可通过使细胞面临选择压力来选择细胞。该选择压力可以是仅期望的细胞群有抗性的抗生素或可以是偏向期望的细胞群的生长条件。在选择包含编码所述可溶性HMG-CoA还原酶基因的细胞的情况下，可将细胞培养在偏向包含所述基因的细胞的培养基上或其中。例如，如果编码所述HMG-CoA还原酶的基因整合在酵母基因组中替换了尿嘧啶原养型基因，那么细胞培养基可包含5-F0A(5-氟乳清酸)(Boeke等，1987)，其促进选择尿嘧啶营养缺陷酵母。
[0097]本文使用的术语“使基因缺失”应理解为移除基因或所述基因的一个或更多个部分。然后，基因不转录并且没有基因产物，因此不产生相应的多肽。应理解，未必整个基因都从基因组中移除。优选地，使超过基因的50%、更优选超过基因的60%、更优选超过基因的70 %、更优选超过基因的80 %、更优选超过基因的90 %、更优选超过基因的95 %、最优选使基因的100%缺失。缺失可以是末端缺失或中间缺失。可由实验者或自然引起。可通过本领域中已知的任何方法使基因缺失。例如，通过交换或使用ere重组酶程序使基因缺失(Guldener等，1996)。最优选地,可如实施例中示例性示出地使一个或更多个基因缺失。
[0098]本文中使用的术语“使基因突变”可广义理解为改变所述基因的核酸序列。所得突变可以是单核苷酸替换(点突变)或可以是移码突变。优选地，以下述方式使基因突变:不产生基因产物(即，多肽)或者多肽的活性比野生型多肽的活性低。可通过本领域中已知的任何方法(辐射或化学剂)或定点诱变引起突变。突变也可因自然发生突变速率自发产生。突变可引起移码突变或点(单核苷酸)突变。例如，突变可通过实验者或自然引起的非特异诱变得到。最优选地，可如实施例中示例性示出地使一个或更多个基因突变。
[0099] 突变可由以下因素引起:例如辐射(紫外线(UV)辐射、X-线辐射、放射性/核辐射(例如，a -、P -或Y-辐射)或宇宙辐射)或一种或更多种诱变剂(例如，针对核苷碱基的烷化剂(例如，氮芥(例如，环磷酰胺、甲二氯二乙胺或双氯乙基甲胺(mustine) (HN2)、乌拉莫司汀或尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素)、烷基磺酸盐(例如，白消安)、噻替派及其类似物、钼衍生物(例如，顺钼、卡钼、奈达钼、奥沙利钼、赛特钼、四硝酸三钼)、甲基苄肼、六甲蜜胺、黄曲霉毒素及其代谢产物和衍生物、亚硝酸盐、苯胺及其代谢产物和衍生物、苯及其代谢产物和衍生物、多环芳香烃及其代谢产物和衍生物))、亚硝胺、砷、石棉、铍及其络合物、环氧乙烷、六价铬(VI)化合物、氡、氯乙烯、吸烟等)。突变也可以是自发的。
[0100]优选地，甾醇酰基转移酶是AREI和/或ARE2。优选地，AREI和/或ARE2基因缺失，更优选地，AREl和ARE2基因缺失。
[0101]术语“转化”可最广义地理解为细胞的遗传性质的改变。可将编码一种或更多种产生组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的一个或更多个基因盒插入细胞中或者回复诱变编码一个或更多个产生组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的缺陷基因。最优选地，如实施例中示例性示出地转化细胞。
[0102]本文使用的术语“基因盒”可最广义地理解为编码单一生物学功能的一个或更多个基因的模块化DNA序列。可以指DNA的可操作片段，其携带一个或更多个感兴趣的基因，能够表达一个或更多个所述基因，并且还可包括一个或更多个限制性位点组。优选地，所述一个或更多个基因位于两个或更多个限制性位点之间。任选地，基因盒可从一个DNA序列(通常在载体上)转移到基因组并且代替本发明的细胞的基因组的DNA序列。最优选地，可如实施例中示例性示出地使基因盒缺失。
[0103]在本发明上下文中，术语“回复诱变”是指在恢复之前的基因型或相应野生型细胞在特定表型方面的初始表型的突变。然后，优选地，修复缺陷基因。例如，组氨酸营养缺陷型细胞中用于编码产生组氨酸的酶的缺陷基因回复突变可产生组氨酸原养型细胞。最优选地，可如实施例中示例性示出的进行回复诱变。
[0104]可通过插入基因盒或通过回复诱变来修复用于编码产生组氨酸的酶的缺陷基因。优选地，通过回复诱变，更优选地，通过HIS4基因回复突变来修复基因。
[0105]可通过插入基因盒或通过回复诱变来修复用于编码产生亮氨酸的酶的缺陷基因。优选地，通过插入包含完整形式的所述基因的基因盒，更优选地，通过插入编码LEU2基因的基因盒来修复基因。
[0106]可通过插入基因盒或通过回复诱变来修复用于编码产生尿嘧啶的酶的缺陷基因。优选地，通过插入包含完整形式的所述基因的基因盒，更优选地，通过插入编码URA3基因的基因盒来修复基因。
[0107]在组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶原养型的情况下，使群体中原养型细胞富集。可在悬浮培养物中或固体物质的培养平板(例如，琼脂平板)上选择细胞。可如下选择细胞:稀释细胞并且用其划线产生仅来源于单细胞的菌落。随后可测试这些菌落中各基因的存在或通过其表型性质进行选择。可替换地或另外地，也可通过使细胞面临选择压力来选择细胞。该选择压力可以是仅期望的细胞群有抗性的抗生素或可以是偏向期望的细胞群的生长条件。优选地，培养基缺少组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶，更优选地，所述培养基缺少组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶，特别地，所述培养基缺少组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶。本文使用的术语“缺少”是指所述化合物不存在或仅微量存在的浓度。
[0108]术语“培养细胞”可最广义地理解为保持细胞存活。可将细胞培养在适合酵母细胞的条件下。例如，可将酵母细胞培养在悬浮培养物中或平板如琼脂平板上。悬浮培养基或琼脂可包含适合酵母细胞的营养，例如，一种或更多种氨基酸、一种或更多种肽、一种或更多种脂质、一种或更多种维生素、微量元素和/或盐、一种或更多种生长因子、和一种或更多种缓冲剂。可将细胞培养在有氧或无氧条件下。温度可是本领域技术人员已知适合细胞的范围。例如对于酵母，温度通常为18°C至40°C，优选20°C至37°C，更优选20°C至30°C，更优选25°C至30°C，最优选30°C。培养基的pH可以为适合酵母细胞的范围。对于大部分酵母细胞，合适的pH可以为中性或微碱性pH。最优选地,如实施例中示例性示出地培养所述细胞。
[0109]优选地，培养细胞导致细胞增殖。增殖可由酵母细胞的细胞分裂、酵母细胞的出芽、形成孢子、形成一种或更多种配子和/或有性生殖完成。更优选地，酵母细胞的增殖是细胞分裂或出芽。
[0110]细胞的培养可包括是实验室规模的培养，即，多个培养皿的培养或数毫升至几升培养液的悬浮培养物。细胞的培养还可包括半工业规模的培养，即，数升培养液的悬浮培养物；和工业规模的培养，即，数升或甚至数立方米培养液的悬浮培养物。本文使用的术语“培养液”包括细胞和培养基。悬浮培养物可任选地搅拌或震荡。悬浮培养物可任选地充气、通气和/或脱气。可在合适的压力下培养细胞，压力可以是大气压力、超压或低压。通常，可在大气压力或轻微超压下培养细胞。
[0111]对于萜烯生产，细胞可培养任意时间，优选至少30分钟、至少2小时、至少10小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或甚至长达一周、长达一个月或长达数月。细胞可培养数代。细胞可培养超过I代、超过5代、超过10代、超过15代、超过20代、超过25代、超过30代、超过35代、超过50代、超过100代或甚至更久。
[0112]在本发明上下文中使用的，在指代细胞时，术语“分离”最广义地为浓缩本发明的细胞。所述细胞可以被收获。可通过本领域中已知的任何方法分离细胞，例如离心、过滤、错流过滤、色谱(例如，亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱)，或者摩擦或擦拭培养板的固体表面。或者，由于包含所述细胞的容器放出气体，细胞可随时间下沉(decent)或漂浮。或者，可不分离细胞，而将细胞和培养基一起进一步处理。
[0113]可进一步用合适的缓冲液或培养基洗涤分离的细胞。优选地，可通过离心、过滤、错流过滤或色谱(例如，亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱)洗涤细胞。可通过本领域中已知的任何方法分析分离的细胞。可将分离的细胞破碎、在培养板上划线、接种在悬浮培养基中或可进行稳定。最优选地，如实施例中示例性示出地分离所述细胞。
[0114]如本发明上下文中使用的，在指代细胞时，术语“稳定”是指任何保存细胞的方法。优选地，如下所述稳定细胞:将细胞储存比较长的时间，并且随后可用于形成活细胞培养物。
[0115]可通过冷冻、冷冻干燥或干燥来稳定细胞。优选地，冷冻细胞。可将细胞冷冻在-20°C、-80°C、在干冰上或液氮中。优选地，可将细胞冷冻在适合冷冻酵母细胞的培养基中。该培养基可包含甘油。优选地，可在水缓冲液或水中冷冻细胞，其补充有超过2% (v /V)、超过 5% (V / V)、超过 10% (V / V)、超过 20% (V / V)、超过 30% (v / V)、超过 40%(v / V)、或者超过50% (v / v)的甘油。例如，可在水中包含50%甘油的培养基中冷冻酵母细胞。在整个发明中使用的缩写V / V是指每体积的体积数。可将冷冻在甘油溶液中的一批冷冻细胞称作甘油保存物(glycerol stock)。或者，可干燥或冷冻干燥酵母细胞，优选地，通过添加乳化剂如柠檬酸等。可将干燥或冻干的细胞储存在任意温度下的干燥条件下，例如，室温、环境温度、-4°C、-20°C、_80°C、干冰上或液氮中。最优选地，如实施例中示例性示出的稳定细胞。
[0116]可将稳定的细胞稳定至少超过I天，优选超过5天，更优选超过I周，更优选超过I个月，更优选超过I年。如上文所述，“稳定”是指细胞在储存时间之后可用于形成活细胞培养物。
[0117]或者，不分离细胞，而是将细胞和培养基一起进一步处理。
[0118]在一个优选实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞是酵母细胞。优选地，其中所述细胞是酵母属细胞，更优选地，其中所述细胞是酿酒酵母细胞，特别地，其中所述细胞来源于酿酒酵母细胞菌株AH22。
[0119]本发明的优选细胞的特征在上文有详细表征。
[0120]在一个优选实施方 案中，将编码可溶性HMG-CoA还原酶的基因插入到酵母细胞中的步骤包括:插入编码可溶性HMG-CoA还原酶的载体，其中在所述细胞中有活性的启动子、优选组成型启动子、特别是强组成型启动子的控制下表达所述可溶性HMG-CoA还原酶。
[0121]在一个优选实施方案中，编码留醇酰基转移酶的一个或更多个基因是AREl和/或ARE2，优选地，其中AREl和ARE2基因都缺陷或缺失。
[0122]本发明的第三个方面涉及本发明的细胞的用途，其用于生产一种或更多种萜烯，优选用于生产一种或更多种三萜，特别是用于生产角鲨烯。
[0123]本文中所使用的术语“生产”可指用于获得萜烯的任何方法。生产可包括任何规模的生产。生产可包括是实验室规模的生产，即数微克、数毫克或数克萜烯的生产。生产可包括半工业规模的生产，即数克或数千克萜烯的生产。生产还可包括工业规模的生产，即数千克或数吨萜烯的生产。生产还可包括用于纯化或保存萜烯的一种或更多种其他工艺步骤。
[0124]因为大部分萜烯都是高度疏水的，所以萜烯通常在细胞中积累。第一步，可通过本领域中的任何方法，例如离心、过滤、错流过滤、色谱(例如，亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱)，或者摩擦或擦拭固体表面或培养板收获细胞。然后，可借助任何方法，优选离心、过滤或错流过滤的细胞团块。或者，细胞可因包含所述细胞的容器的放气而随时间沉淀或漂浮。任选地，可通过本领域中的任何方法洗涤细胞，例如离心、过滤、或错流过滤。可干燥或不干燥细胞团块。可通过本领域中任何方法裂解细胞。可借助机械力(例如，匀浆(例如，(Potter或Downs匀浆机)，借助细胞压力如弗氏压碎器)，借助洗涤剂、超声处理、溶解性噬菌体裂解细胞。任选地，可通过溶剂萃取来萃取(例如，利用有机溶剂)萜烯。任选地，可随后将有机溶剂蒸发。可选择地或另外地，可根据萜烯的特定化学性质、通过色谱方法(例如，相色谱、离子交换色谱、反向色谱、尺寸排阻色谱、高效液相色谱(HPLC)、超高压液相色谱(UPLC)、快速蛋白质色谱(FPLC))、通过电泳、毛细管电泳(CE)或通过蒸馏分离職烯。
[0125]本发明的另一方面涉及用于生产一种或更多种萜烯、优选三萜、更优选鲨烯的方法，所述方法包括:
[0126]a)将本发明的细胞培养在合适的培养基中；和
[0127]b)从步骤(a)的细胞或细胞培养物中分离一种或更多种萜烯，优选一种或更多种二職，更特别是角S烯。
[0128]本领域技术人员将理解，为了有效生产萜烯，细胞必须培养至少数小时，优选至少12小时，更优选至少24小时，更优选至少48小时或至少72小时或甚至更久。细胞可培养数代。细胞可培养超过5代、超过10代、超过15代、超过20代、超过25代、超过30代、超过35代、超过50代、超过100代或甚至更久。可搅拌或振摇悬浮培养物。
[0129]本文使用的术语“分离一种或更多种萜烯”可最广义地理解为从培养液中纯化萜烯。萜烯可积累在细胞中或可由细胞分泌从而存在于培养基中。
[0130]可如上文描述收获并任选地洗涤细胞。随后，可通过本领域中已知的以及上文描述的任何方法裂解细胞。任选地，可通过溶剂萃取(例如，利用有机溶剂)萃取萜烯。任选地，可随后将有机溶剂蒸发。可替换地或另外地，可根据萜烯的特定化学性质、通过色谱方法(例如，相色谱、离子交换色谱、反向色谱、尺寸排阻色谱、高效液相色谱(HPLC)、超高压液相色谱(UPLC)、快速蛋白质色谱(FPLC))、通过电泳、毛细管电泳(CE)或通过蒸馏分离萜烯。
[0131]本发明的另一个方面涉及生产药物或化妆品组合物、润滑剂或变压器油，特别是生产疫苗组合物的方法，所述方法包括:
[0132]a)根据本发明生产一种或更多种萜烯；和
[0133]b)将所述萜烯混合到所述药物或化妆品组合物、所述润滑剂或所述变压器油，特别是所述疫苗组合物。
[0134]其中任选地对所述一种或更多种萜烯进一步实施一个或更多个氢化步骤，其中所述一种或更多种萜烯优选地是氢化三萜，特别是角鲨烯。
[0135]术语“混合”可广义理解将萜烯添加到感兴趣的组合物中。
[0136]药物组合物可指包含由本发明的细胞得到的萜烯的任何药物组合物。在药物组合物中，萜烯可优选地用作佐剂，用作皮肤润湿剂，用作粘液溶解剂，用作激素，用作芳香剂，用作润滑剂，用作抗微生物剂，用作抗炎药或用作抗氧化剂。
[0137]化妆品组合物可指包含由本发明的细胞得到的萜烯的任何化妆品组合物。在化妆品组合物中，萜烯可优选地用作皮肤润湿剂，用作芳香剂，或用作抗氧化剂。萜烯也可用作食品添加剂。另外，萜烯可用作信息素(例如用于害虫防治的昆虫信息素)，用作激素(例如，例如用于害虫防治的昆虫信息素)，用作润滑剂，用作电绝缘物，用作变压器油或变压器油添加剂，以及用作化学、制药和化妆品工业的原材料。
[0138]优选地，由本发明的方法得到的萜烯是角鲨烯。角鲨烯可优选地用作药物和化妆品组合物中的添加剂、用作皮肤润湿剂、用作润滑剂、用作变压器油或变压器油添加剂以及用作化学工业中的原料化学物质。更优选地，由本发明的方法得到的角鲨烯可用在药物和化妆品组合物中，特别是制备可用作疫苗佐剂的乳剂。
[0139]萜烯可用于生产一种或更多种氢化萜烯，优选一种或更多种氢化三萜。特别地，角鲨烯可用于生产角鲨烯。对于该目的，将对角鲨烯进行本领域中已知的一个或更多个氢化步骤。
[0140] 本文使用的术语“氢化步骤”是指通过添加氢使一个或更多个双键或三键，优选一个或更多个双键，特别是萜烯的碳原子之间的一个或更多个双键氢化。例如，可如下使萜烯氢化:催化转化器(例如，钼基、钯基、铑基、镍基、铱基和/或钉基催化剂)，用氢吹气或含氢气体混合物的吹气，与还原剂如硼氢化钠反应，酶促处理(例如，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)转化酶)或其两种或更多种的组合。NADH和/或NADPH转化酶也可克隆在本发明的细胞的基因组中。优选地，在氢化萜烯中，萜烯分子的大部分或甚至全部双键和/或三键都被氢化，更优选地，萜烯分子的全部双键和/或三键都被氢化。优选地，氢化萜烯是氢化三萜，更优选氢化角鲨烯。最优选地，氢化萜烯是角鲨烯。角鲨烯可优选地用在化妆品或药物组合物中，特别是化妆品中。
[0141]附图简述
[0142]图1示出了载体pPTHTL的克隆策略。用EcoRl和BamHl从pUC19_tHMGl切下HMGl片段，并且将其整合到用EcoRl和BamHl切割的质粒pT2b中。将LEU2基因作为平末端片段进行克隆。因此，用XhoI和Sail切割YEpl3，将粘性末端平端化。用NruI打开pPT2b-tHMGl0
[0143]图2示出了载体YEpH2的示意图。pPT2b_tHMGl的表达盒作为EcoRV / NruI片段连接到用SphI打开并平端化的Y印13中。
[0144]图3示出了整合载体YDpUHK3的克隆策略。表达盒作为YEpH2的EcoRV / NruI片段连接在用StuI切割的YDpU中。将pUCTK23的HindII片段与用SmaI切割的YDpUH2 /12连接。
[0145]图4示出了整合在基因座URA3中的tHMGl表达盒的示意图(阴影部分)。被EcoRV(A)线性化的载体YDpUHK3整合在染色体URA3基因(B)中。质粒整合成单个整体(C)或作为串联重复。经过同源重组，全部载体丢失(虚线箭头)或质粒的一部分丢失(连续线箭头)。如果表达盒保留，在URA3基因座中实现D下表示的情况。
[0146]图5示出了用于使菌株AH22tH3ura8中的基因ARE1、ARE2缺失之程序的示意性描述。
[0147]图6示出了质粒pUG6 (图6A)和pSH47 (图6B)的示意性描述。
[0148]图7示出了菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HUL在实验室规模发酵罐(5升)中培养的结果。图7A示出了酵母随时间的生长。描述了发酵过程中的细胞干重(CDW)g / L和光密度(OD6cicimiAiL)。图7B示出了 66小时和72小时后的角鲨烯生产力。角鲨烯生产力描述成发酵过程中发酵液的每细胞干重的百分比和体积生产力g / L。
[0149]图8示出了从构建的酿酒酵母的突变菌株中萃取全部脂质的薄层色谱法。
实施例
[0150]以下实施例以及附图旨在说明本发明描述实施方案和本文的要求。这些实施例并未意图限制本发明主题的范围。
[0151]实施例1
[0152]菌株AH22tH3ura8 A are I A are2 的构建
[0153]1.1 基础菌株 AH22tH3ura8(Polakowski 等，1998)。
[0154]AH22tH3ura8 以菌株 AH22 (Hinnen 等，1978)为基础，其来源于 S288c (Mortimerand Johnston，1986)。菌株S288c和菌株AH22可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。菌株 S288c 以 ATCC 号 26108 获自 ATCC。菌株 AH22 以 ATCC 号 38626 获自 ATCC。
[0155]AH22的特征如下:
[0156]基因型:MATaleu2-31eu2-112his4-519canl
[0157]表型:leu2,his4
[0158]酿酒酵母的菌株AH22属于公认为安全(生物安全级别I)的微生物组。制备菌株AH22的甘油保存物。
[0159]通过将tHMGl表达盒整合到URA3基因座来构建菌株AH22tH3ura8 (Polakowski等，1998)。该表达盒包括截短的组成型版本的ADHl启动子、截短版本的HMGl基因和TRPl终止子(见下文构建详情)
[0160]AH22tH3ura8菌株的特征如下:
[0161]基因型:MATaIeu2-31eu2-112his4-519canlura3::tHMGl`[0162]表型:ura3,leu2, his4
[0163]1.2将tHMGl表达盒整合到基因座URA3中(克隆策略和整合)
[0164]载体pPTHTL的克隆策略
[0165]使用标准方法，由酿酒酵母菌株S288c的基因组DNA(Mortimer and Johnston,1986)通过PCR扩增tHMGl (Basson等，1988)的DNA序列。用于该目的的引物是DNA寡聚物tHMG-5'和tHMG-3'(表1)。将得到的DNA片段(SEQ ID NO:2)引入到用Klenow处理后的克隆载体pUC19 (Yanisch-Perron等，1985)的SmaI位点，得到载体pUC19_tHMGl (见图1)。
[0166]在分离质粒并且用限制酶EcoRl和BamHl限制pUC19_tHMGl后，将得到的片段引入到同样用EcoRl和BamHl处理了的酵母表达载体pPT2b (Lang and Looman, 1995)中。所得质粒pPT2b-tHMGl在tHMGl编码区之间包含截短的ADHl启动子(Bennetzen and Hall,1982)和 TRPl 终止子(Tschumper and Carbon，1980)。用 XhoI 和 Sail 将LEU2基因从酵母载体YEpl3 (Parent等，1985)切下，将平末端连接到用NruI限制处理的载体pPT2b_tHMGl (包含所谓的中等长度ADHl启动子、tHMGl基因和TRPl终止子)，得到载体pPTHTL(见图1)。
[0167]载体YEpH2的克隆策略
[0168]通过将线性化(SphI)的载体YEpl3与用EcoRV和NruI从载体pPT2b_tHMGl (图1)切下的tHMGl表达盒(短形式的ADHl启动子,在EcoRV位点的下游,Bennetzen and Hall,1982)平末端连接来构建载体YEpH2 (见图2)。
[0169]整合载体YDPUHK3的克隆策略
[0170]将用EcoRV和NruI切自载体YEpH2(见图2)的tHMGl表达盒引入(连接)到用Stul处理的载体YDpU(Berben等，1991)中。将所得载体YDpUH2 / 12(见图3)用核酸内切酶Smal处理并且与载体pUCTK23的编码卡那霉素抗性(Webster and Dickson, 1983)的HindII片段连接。将产生的构建物(YDpUHK3，见图3)用EcoRV处理，之后进行酵母转化。借助Gietz等(Gietz, D.,等，1992)描述的醋酸锂方法用该构建物转化酵母菌株酿酒酵母AH22 (Hinnen等，1978)。用该线性化载体转化酵母导致全部载体在URA3基因的基因座上整合(见图4)。为了去除来自整合载体非表达盒部分的区域(大肠杆菌复制起点、大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因、TEF启动子和卡那霉素抗性基因)，向转化细胞施加促进尿嘧啶营养缺陷型酵母的5-FOA(Boeke等，1987)选择压力。在含有5-FOA(AH22tH3ura8)的平板上选择的尿嘧啶-营养缺陷型菌株显示在URA3基因座中染色体整合的tHMGl表达盒(见图4)。
[0171]SEQ ID N0:3代表整合在菌株AH22tH3ura8中的URA3基因座中的tHMGl表达盒的序列(包括URA3编码区(见图4))。
[0172]1.3 使菌株 AH22tH3ura8 中的基因 ARE1、ARE2 缺失。
[0173]用引入与靶基因座AREl和ARE2同源的短侧翼序列的引物(分别为arelcrelox正向(fw),arel crelox 反向(rev)以及 are2crelox fw, are2crelox rev;表 1)(见图 5)从质粒pUG6 (Guldener等，1996)(见图6)中扩增具有kanMX标记基因(编码庆大霉素抗性)的缺失盒(deletion cassette)。将缺失盒(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的序列)通过Gietz等(Gietz, D.,等，1992)中描述的醋酸锂方法转化到酵母细胞中。
[0174]在该盒整合到靶基因座中以后(导致相应基因丢失)，通过ere-重组酶程序(Guldener等，1996)恢复标记基因kanMX,以便能够再利用该标记分别进行进一步的染色体缺失或整合。
[0175]ere-重组酶程序需要用携带ere-重组酶基因的质粒pSH47 (见图6)转化酵母菌株。该酶能够重组kanMX抗性基因侧翼的两个1xP位点。该重组事件甚至导致失去该标记基因，在靶基因座留下一个1xP位点。
`[0176]通过在具有5-氟乳清酸(Guldener等，1996)的平板上反向选择来鉴别失去质粒PSH47的菌落，并且挑取用于进一步构建目的或作为最终的菌株。
[0177]表1:用于构建菌株AH22tH3ura8AarelAare2的寡核苷酸(引物)
[0178]
Jti T 名称厂— 序列_1_tHMG-51_ACTA TG GACCAATTGGTGAAAACTG____
2_tHMG-3!__AGTCACATGGTGCTGTTGTGCTT_
3arelcrelox fw ATGACGGAGACTAAGGATTTGTTGCAAGACG___AAGAGTTTCccagctgaagcttcgtacgc__
4arelcrelox rev TCATAAGGTCAGGTACAACGTCATAATGATAC___TGGGCCCTgcataggccactagtggatctg_
5are2crelox fw ATGGACAAGAAGAAGGATCTACTGGAGAACG___A AC A A’ I I 'TC ccagctgaagcttcgtacgc_
6are2crelox rev TTAGAATGTCAAGTACAACGTACACATGACAC___TTGGTCCCgcataggccactagtggatctg_
[0179]制备菌株AH22tH3ura8AarelAare2的10份甘油保存物。表1中的大写字母表示靶基因座的同源区域，其中整合有或已整合有各整合基因盒。这些区域可负责基因盒在靶基因座中的染色体整合(通过同源重组，例如分别为AREl和ARE2)。因此，这些区域可位于整合盒的开始或末端。
[0180]实施例2
[0181]通过薄层色谱(TLC)评估所构建菌株的中性脂质组合物和游离留醇。根据以下方案进行全脂质萃取和薄层色谱。
[0182]TLC (薄层色谱)分析
[0183]培养稈序:
[0184]用于TLC分析的酿酒酵母菌株的培养程序为:
[0185] 预培养:用50 ill相应的甘油保存物接种100ml摇瓶中的20mlWMVIII培养基，并且在30°C 150rpm培养48小时。
[0186]主培养:用1%预培养物接种250ml具有挡板的摇瓶中的50mlWMVIII培养基，并且在300C 150rpm培养72小时。
[0187]样品制各
[0188]将3 X 0.5mL培养液收集在Eppendorf管(一式三份)中并且通过在4000rpm下离心5分钟来沉淀。弃去上清液。将酵母沉淀重悬在200 u LTE缓冲液(pH=8.0)中。加入200 u L玻璃珠和200 u L氯仿/甲醇(80:20 (体积％ ))。
[0189]使样品涡流5X I分钟(之间在冰上冷却)。用针在Eppendorf管底部刺孔。将反应管放在另一 1.5ml Eppendorf管中并且离心(1000g，2分钟)。丢弃具有玻璃珠的上Eppendorf管。封闭下Eppendorf管并且离心(13，OOOg, 15分钟)。在离心的过程中，在沉淀的上面和下面形成相。将下层有机物转移到1.5ml Eppendorf管中并且用薄层色谱法分析。
[0190]TLC (薄层色谱)
[0191]固定相:硅胶60卩254,10\20011,硅胶层厚度0.21111]1。
[0192]流动相:石油醚:乙醚:醋酸(90:10:1(体积％ ))。
[0193]样品量:IOiiL
[0194]运行时间:直至平板表面下方Icm
[0195]检测:用碘蒸气染色(检测角鲨烯、三酰基甘油、留醇和留醇酯)
[0196]结果:
[0197]图8示出野生型菌株AH22ura3、具有下调的HMG-CoA还原酶的菌株AH22tH3ura8和双缺失菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2的全部/中性脂质组合物。图8表明，与表达下调的HMG-CoA还原酶并且产生大量角鲨烯的泳道3至6中的菌株相比，野生型菌株(AH22ura3，泳道I和2)产生极少量的角鲨烯。编码负责形成甾醇酯的酶的基因(ARE1、ARE2)的缺失导致在相应菌株中完全缺乏这些组分(泳道5和6中上部黑框表示)。编码负责形成留醇酯的酶的基因(ARE1、ARE2)的缺失不导致游离留醇积累(泳道3和4与泳道5和6相比，下部黑框表示)。这是出乎意料的，因为预期在缺乏以留醇酯形式储存留醇之能力的菌株中，游离留醇的含量增加。
[0198]通过标准角鲨烯、甾醇-油酸、三油酸甘油酯、油酸和麦角固醇(未示出)鉴别脂质组分。[0199]实施例3
[0200]菌株AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2原养型(最终菌株I)的构建以及细胞库生产和储存
[0201]3.1菌株构建详情、引物和测序
[0202]菌株 AH22tH3ura8 A are I A are2H(中间菌株 I)的构建:
[0203]用接种环将AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2的液体培养物在缺少组氨酸的平板上划线，之后选择菌株AH22tH3ura8AarelAare2的HIS4原养型克隆(回复)(见下文)
[0204]菌株 AH22tH3ura8 A are I A are2HL (中间菌株 2)的构建:
[0205]用引物I和引物2 (引物序列见表2)从菌株S288c的基因组DNA中扩增基因LEU2的编码区。将所得基因盒转化到菌株AH22tH3ura8AarelAare2H中。通过引物3和引物
2(在LEU2基因座的5' UTR区和LEU2编码区中退火；引物序列见表2)的PCR分析检查借助同源重组的靶基因座LEU2(YCL018W)中的正确整合。
[0206]菌株 AH22tH3ura8 A are I A are2HUL (最终菌株 I)的构建:
[0207]用引入了与靶整合基因座同源的5’ -和3’ -突出序列(长40bp)的引物4和引物5从菌株S288c的基因组DNA中扩增基因URA3的完整天然表达盒(包括天然启动子和终止子)。不使用基因URA3的天然基因座作为靶基因座，因为tHMG表达盒整合到了菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL的该基因座中。作为可供选择的染色体表达基因座，选择HO基因座。将天然URA3表达盒(包括天然启动子和终止子)转化到菌株AH22tH3ura8AarelAare2HL中。 通过引物6和引物7(在HO基因座的5' UTR区和3' UTR区中退火，引物序列见表2)的PCR分析检查通过同源重组的靶基因座HO(YDL227C)中的正确整合。
[0208]:
[0209]通过对PCR扩增产物测序来证明突变his4_519的回复(移码突变、包括碱基插入，导致Y -GGGG-3' mRNA序列代替野生型Y -CCC-3 ;甘氨酸密码子(Gaber andCulbertson, 1982))，所述PCR扩增产物通过用引物8和引物9(在HIS4编码区中间和在HIS4基因座的:V UTR区退火，引物序列见表2)从菌株AH22tH3ura8AarelAare2HUL的基因组DNA中扩增相应的HIS3编码序列来产生。
[0210]结果:序列是正确的(对应于S288c的序列，其存于http: / / www.yeastgenome.0rg)。发生了突变his4-519的回复。在his4_519突变的情况下,也可通过甘氨酸tRNA中的基因外抑制性突变进行组氨酸营养缺陷型表型的回复(Gaber and Culbertson, 1982)。
[0211]通过对PCR扩增产物测序来证明菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HUL中LEU2基因座(YCL018W)处LEU2编码区的正确序列，所述PCR扩增产物通过用引物3和引物2 (引物序列见表2)在菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL的基因组DNA中扩增包括LEU2基因座51 UTR之一部分的整个LEU2编码序列来产生。
[0212]结果:序列是正确的(对应于S288c的序列,其存于http: / / www.yeastgenome.0rg)。
[0213]通过对PCR扩增产物测序来证明整合在菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL中HO基因座(YDL227C)的基因URA3(包括天然启动子和终止子)的天然表达盒的正确序列，所述PCR扩增产物通过用引物6和引物7(在HO基因座的Y UTR区和:V UTR区中退火，弓丨物序列见表2)在菌株AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HUL的基因组DNA中扩增基因URA3的表
达盒来产生。
[0214]结果:序列是正确的(对应于S288c的序列，其存储在http: / / www.yeastgenome.0rg)。
[0215]表2:用于构建菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HUL的寡核苷酸(引物)
[0216]
编号 J_HIS4 fw.中间 TCTGAATATGAAGCATCTGAAG_
9\r H1S4 rev.ATGGCGCTAATGTCTTCAATAC
[0217]3.2中间菌株lAH22tH3ura8 Λ are I Λ are2H的甘油保存物的制备
[0218]如Lang 和 Looman (Lang and Loomann, 1995)所不制备 WMV-1I 培养基。
[0219]用50 μ I甘油保存物将菌株AH22tH3ura8AarelAare2接种到IOOmL无挡板摇瓶中补充有尿嘧啶(IOOmg / L)和亮氨酸(400mg / L)的20mL培养基中，并且在30°C 150rpm孵育72小时(接种物O)。
[0220]用接种环将接种物O划线于补充有尿嘧啶(IOOmg L)和亮氨酸(400mg / L)(无组氨酸)的WMVIII琼脂平板上，将其在30°C下孵育72小时(平板I)。未确定菌落数(回复体数)。
[0221]接种物1:将从平板I中挑出的菌落接种在IOOmL无挡板摇瓶中的补充有尿嘧啶(IOOmg L)和亮氨酸(400mg / L)的2OmL WMVIII培养基中，并且在30°C 150rpm孵育72小时(接种物I)。
[0222]接种物2:将350 μ L接种物I接种在IOOmL无挡板摇瓶中的补充有尿嘧啶(IOOmgU和亮氨酸(400mg / L)的35mL WMVIII培养基中，并且在30°C 150rpm孵育48小时(接种物2)。
[0223]使用接种物2制备中间菌株I (AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2H)的甘油保存物。通过将0.5mL接种物2与0.5mL甘油溶液(水中50% (v / V)的甘油)混合来制备甘油保存物。可将中间物l(AH22tH3ura8AarelAare2H)的10份甘油保存物转移在干冰上。
[0224]接种物2的测试
[0225]a)接种物2的光密度:
[0226]0D600 / mL:39.44[0227]b)接种物2的细胞生存力(在制备甘油保存物之前):
[0228]通过用菌落形成单位除以细胞数(X100)计算接种物2的细胞生存力％。细胞数通过在Thoma计数室中的计数来确定。菌落形成单位通过将适当稀释的接种物2在补充有尿嘧啶(IOOmg L)和亮氨酸(400mg / L)的WMVIII琼脂平板上划线来确定。
[0229]c) Thoma计数室:1:10稀释接种物2
[0230]1.计数:34 ；31 ；38 ；32 ；39
[0231]2.计数:31 ;37 ;31 ;33 ;31
[0232]33.7 细胞 X 1.25 X IO6X 10=4.2 X IO8 细胞 / mL 接种物 2
[0233]d)平板上的菌落:
[0234]将50 μ 110-5倍稀释的接种物2布板在WMVIII平板上
[0235]计数:207菌落 X IO5 X 20=4.14 X IO8 菌落 / mL 接种物 2
[0236]生存力:4.1XlO8X 100 / 4.2X IO8 — 98.6%
[0237]接种物2的细胞生存力:98.6%
[0238]e)钝度和表型
[0239]表3:用50 μ I接种物2 (如所示用水稀释至10_5或不稀释)在指定平板上划线并且在指定温度下孵育48小时以 确定纯度和表型(营养缺陷型)
[0240]
菌株(接种物2)平板孵育温度观察结果
AH22tH3ura8AareUare2H YE30 °C单酵母菌落(将接种
物I稀释10'之后
在平板上划线)
WMVIIi30 0C单酵母菌落(将接种
+Ura +Leu物I稀释IO 5,之后
在平板上划线)
LB37°C未生长(未稀释)
WMVIii30"O未生长(未稀释)
(无氨基酸)
WMVIIi300C未生长(未稀释)
+Ura +His
WMVIIi300C未生长(未稀释)
+Leu +His
[0241]在显微镜下检查接种物2的细菌感染一没有检测到细菌污染
[0242]3.3中间菌株2的构建和中间菌株2AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL的甘油保存物的制备
[0243]构建(工艺流程)[0244]通过本领域中周知的以及下文描述的方法进行转化和用PCR证明LEU2表达盒在基因座LEU2中的正确整合。
[0245]酵母转化的结果
[0246]如Gietz等(Gietz，D.，等，1992)的描述进行转化。转化效率(整体转化)为每μ gDNA102-103 转化子。
[0247]培养在对照平板上的样品I (AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H,无DNA)结果是无菌落生长。培养插入了 AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H+LEU2盒的样品2的结果是可检测的不同菌落。
[0248]挑出15个菌落在新WMVlll平板上并且在30°C下孵育72小时。用PCR检查5个菌落。选择最大的菌落制备甘油保存物。5个菌落的实验评估表明全部5个菌落都是可用的。全部5个菌落表明所分析的DNA包含LEU2基因。
[0249]PCR:
[0250]从接种在新琼脂平板上的两种的酵母转化的菌落中获得模板。使用PuRe TaqReady To Go-Bead(GE Healthcare:Lot:384777)作为 Taq 聚合酶，体积 25 μ I。
[0251]这导致珠溶解在23 μ I无菌HPLC-H2O中并且添加各I μ I的引物fw./ rev.(见表)。所使用的 P (R 仪获自 Flex Cycle Analytik, Jena。
[0252]PCR 稈序:
[0253]步骤1:94°C 3 分钟
[0254]步骤2:94°C 30 秒
[0255]步骤3:53 °C 30 秒
[0256]步骤4:72°C 2分钟至步骤2，40次循环
[0257]步骤5:72 °C 3 分钟
[0258]步骤6 A0C
[0259]用AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL 的菌落 1、2、3、4 和 5 和引物 5’ LEU2fw 和 LEU2rev的各I μ L引物进行PCR。扩增产物为约1185bp长。
[0260]I %琼脂糖凝胶上凝胶电泳
[0261]将IOOmL 摇瓶中的来自 Biozym 的 0.5Seakem LE Agarose+50mLl XTAE-缓冲液6uL Iadder(NEB) (500ng /泳道)加样于一个泳道中。将各扩增物的另外10 μ L样品与2UL6X上样缓冲液混合并且将混合物加样于琼脂糖凝胶上。凝胶在IXTAE缓冲液中于120ν运行45分钟。随后，将凝胶在溴化乙锭(EtBr)液中孵育20分钟(EtBr浓度，保存^:10mg / mL，浴(bath):30yL / 300mL IXTAE-缓冲液)。最后，用摄像文件分析凝胶(Alpha 凝胶成像系统:0rgBal48 ;任选设置:exp.0.12s, binlxl, b:0, w:66, g:0.95)。
[0262]结果:
[0263]装载有样品的全部5个泳道表明菌株是AH22tH3ura8 Λ are I Λ are2HL菌株。5个菌落表现出约1200bp的扩增产物。根据凝胶电泳，全部5个分析的结果是菌落包括了正确插入。 因此，LEU2基因的扩增导致菌株AH22tH3ura8Aarel Aare2HL的全部5个菌落中的阳性结果。
[0264]菌株AH22tH3ura8 Aarel A are2HL的甘油保存物的制各
[0265]用从补充有尿嘧啶(IOOmg / L)的WMVIII琼脂平板中挑出的菌落(平板1，见下文，不等于转化平板)将菌株AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2HL接种在IOOmL无挡板摇瓶中的补充有尿嘧啶(IOOmg / L)的20mLWMVIII培养基中，并且在30°C、150rpm下孵育72小时(接种物I)。
[0266]通过从转化平板中(见图1)挑取单菌落产生平板1，所述转化平板通过用包含LEU2编码序列的DNA片段转化菌株AH22tH3ura8 Δ are I Δ are2H产生。使用平板I (非转化平板)进行下一步的程序。
[0267]接种物2:将350μ I接种物I接种在IOOmL无挡板摇瓶中的补充有尿嘧啶(IOOmg / L)的35mL WMVIII培养基中，并且在30°C、150rpm下孵育48小时(接种物2)。
[0268]使用接种物2制备中间菌落2 (AH22tH3ura8 AarelA are2HL)的甘油保存物。通过将0.5mL接种物2与0.5mL甘油溶液(水中50% (v / V)的甘油)混合来制备甘油保存物。可将10份甘油保存物转移到干冰上。
[0269]接种物2的测试
[0270]a)接种物2的光密度:
[0271]0D600 / mL:37.04
[0272]b)接种物2的细胞生存力(在制备甘油保存物之前):
[0273]通过用菌落形成单位除以细胞数(X100)计算接种物2的细胞生存力％。细胞数通过在Thoma计数室中的计数来确定。菌落形成单位通过将适当稀释的接种物2在补充有尿嘧啶(IOOmg / L)的WMVIII琼脂平板上划线来确定。
[0274]c) Thoma计数室:1:10稀释的接种物2
[0275]1.计数:33 ；36 ；32 ；37 ；39
[0276]2.计数:28 ；37 ；41 ；33 ；31
[0277]34.7 细胞 X 1.25 X IO6X 10=4.3 X IO8 细胞 / mL 接种物 2
[0278]d)平板上的菌落:
[0279]将50 μ 110-5倍稀释的接种物2布板在WMVIII平板上，结果:
[0280]计数:142菌落 X IO5 X 20=2.8 X IO8 菌落 / mL 接种物 2
[0281]生存力:2.8X IO8X 100 / 4.3X 108，结果 65.1 %
[0282]接种物2的细胞生存力:65.I %
[0283]e)纯度和表型
[0284]表4:将50 μ I接种物2 (如所示用水稀释至10_5或不稀释)在指定平板上划线并且在指定温度下孵育48小时以确定纯度和表型(营养缺陷型)
[0285]
【权利要求】
1.酵母细胞，其中 a)所述细胞包含编码可溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的功能基因； b)所述细胞中一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因缺陷或缺失；和 c)所述细胞是至少组氨酸、亮氨酸或尿喃唳原养型的，优选地其中所述细胞至少是组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶原养型的，特别地其中所述细胞是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原养型的。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是稳定细胞系的细胞，优选地，比下述相应细胞更稳定:至少是组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶营养缺陷型的相应细胞，更优选是组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的相应细胞，更优选是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型的相应细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞是经遗传修饰的细胞。
4.根据权利要求1至3中至少一项所述的细胞，其中所述细胞是酵母属(Sacchromyces)细胞，更优选地，其中所述细胞是酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)细胞，特别地，其中所述细胞来源于酿酒酵母细胞菌株AH22。
5.根据权利要求1至4中至少一项所述的细胞，其中所述可溶性HMG-CoA还原酶的特征在于: a)它是缺少膜结合区的截短的可溶性HMG-CoA还原酶蛋白； b)它编码在载体上处于在所述细胞中有活性的启动子的转录控制下；和/或 c)它在组成型启动子的控制下表达，特别是在强组成型启动子的控制下。
6.根据权利要求1至5中至少一项所述的细胞，其中所述一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因是AREl和/或ARE2，优选地，其中AREl和ARE2基因都缺陷或缺失。
7.根据权利要求1至6中至少一项所述的细胞，其中所述细胞的萜烯生产力，优选三萜生产力，特别是角鲨烯生产力与以下细胞相比至少相当，优选增加:相应的野生型细胞和/或至少为组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶营养缺陷型，优选组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，更优选组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的相应细胞。
8.根据权利要求1至7中至少一项所述的细胞，其中所述细胞产生减少量的留醇酰基酯，优选地，其中所述细胞的留醇酰基酯的生产不足。
9.用于产生根据权利要求1至8中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括: a)将编码可溶性HMG-CoA还原酶的基因插入到酵母细胞中； b)选择包含编码所述可溶性HMG-CoA还原酶的基因的细胞； c)使所述细胞中一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因缺失或突变； d)将所述细胞转化成至少针对以下的原养型细胞:组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶，优选组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶，更优选组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶，转化如下所述实施: (i)插入编码一个或更多个产生组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的基因盒，和/或 (ii)回复诱变编码一个或更多个产生组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶的酶的缺陷基因， 特别地，通过回复诱变编码产生组氨酸的酶的缺陷基因，和通过插入编码产生亮氨酸和尿嘧啶的酶的基因盒； e)选择组氨酸、亮氨酸和/或尿嘧啶原养型的细胞，优选至少是组氨酸和亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶、或亮氨酸和尿嘧啶原养型的细胞，特别是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶原养型的细胞；和任选地 f)培养步骤e)的细胞；和任选地 g)分离和稳定步骤e)或f)的细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞是酵母属细胞，优选地，其中所述细胞是酿酒酵母细胞，特别地，其中所述细胞来源于酿酒酵母细胞菌株AH22。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中步骤a)包括插入编码可溶性HMG-CoA还原酶的载体，其中所述可溶性HMG-CoA还原酶的表达处于在所述细胞中有活性的启动子控制下，所述启动子优选组成型启动子，特别是强组成型启动子。
12.根据权利要求9至11中至少一项所述的方法，其中所述一个或更多个编码留醇酰基转移酶的基因是AREl和/或ARE2，优选地，其中AREl和ARE2基因都缺陷或缺失。
13.根据权利要求1至8中至少一项所述的细胞或由根据权利要求9至12中至少一项所述的方法产生的细胞的用途，其用于生产一种或更多种萜烯，优选用于生产一种或更多种三萜，特别是用于生产角鲨烯。
14.用于生产一种或更多种萜烯，优选用于生产一种或更多种三萜，特别是用于生产角鲨烯的方法，所述方法包括: a)将根据权利要求1至8中至少一项所述的细胞或由根据权利要求9至12中至少一项所述的方法产生的细胞培养在合适的培养基中；和 b)从步骤(a)的细胞或细胞培养物中分离一种或更多种萜烯，优选一种或更多种三職，更特别是角S烯。
15.用于生产药物或化妆品组合物、润滑剂或变压器油，特别是用于生产疫苗组合物的方法，所述方法包括: a)根据权利要求14生产一种或更多种萜烯；和 b)将所述萜烯混合到所述药物或化妆品组合物、 所述润滑剂或所述变压器油，特别是所述疫苗组合物； 其中任选地对所述一种或更多种萜烯进一步实施一个或更多个氢化步骤，其中所述一种或更多种萜烯优选地是氢化三萜，特别是角鲨烯。
【文档编号】C12N9/04GK103492558SQ201280010656
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月15日 优先权日:2011年2月28日
【发明者】安德烈亚斯·拉布, 克里斯蒂娜·兰 申请人:器官平衡有限责任公司