赋予过氧化氢耐性的基因及其利用的制作方法

赋予过氧化氢耐性的基因及其利用的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于对微生物赋予过氧化氢耐性的基因及其利用方法。该赋予过氧化氢耐性的基因编码选自以下的（a）～（c）中的蛋白质。（a）由序列编号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）由在（a）的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有能够赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质；（c）由具有与（a）的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有能够赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质。
【专利说明】赋予过氧化氢耐性的基因及其利用
【技术领域】
[0001]本发明涉及对微生物赋予过氧化氢耐性的基因及其利用方法。
【背景技术】
[0002]许多需氧型微生物具有负责氧代谢的呼吸链，在氧存在下能够获得能量，良好地繁殖。另外，一部分氧在其代谢过程中产生超氧阴离子或过氧化氢，而这样的微生物具有利用清除这些物质的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶等将这些物质无毒化而避免其毒性的机制。
[0003]在厌氧型微生物中作为有用菌被已知的乳酸菌属于兼性厌氧型菌，不具有呼吸链和过氧化氢酶，但是许多乳酸菌即使在氧存在下也能够繁殖，具有耐氧性。以前，关于乳酸菌耐氧性机理进行了若干研究，其中，作为代谢氧的酶，已知有NADH氧化酶和丙酮酸氧化酶等。NADH氧化酶被报告有水生成型和过氧化氢生成型的2种类型，水生成型将氧进行4电子还原形成水而无毒化。另一方面，报告了过氧化氢生成型以2电子还原产生过氧化氢，但在变异链球菌等乳酸菌中，利用烷基过氧化氢还原酶将该过氧化氢转化为水，发挥作为2成分性的过氧化物酶的功能。
[0004]另外，也报告了具有清除由氧产生的超氧阴离子或过氧化氢的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或NADH过氧化物酶等的乳酸菌。
[0005]在乳酸菌 植物乳杆菌WCFSl中，通过强化硫氧还蛋白还原酶基因的表达，对过氧化氢等的氧化应力的抵抗力更强，由此提出了硫氧还蛋白还原酶在氧化应力抗性中起着重要作用(非专利文献I)。
[0006]另外，在厌氧型革兰氏阴性细菌脆弱拟杆菌中，硫氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶系统被认为是负责硫醇/ 二硫化物的氧化还原反应的唯一系统，报告了通过硫氧还蛋白还原酶的缺失，即使在厌氧环境下，不添加半胱氨酸、二硫苏糖醇等还原剂，菌也不能繁殖(非专利文献2)。
[0007]另外，报告了在大肠杆菌中，存在为了将细胞内保持为还原状态所必须的谷胱甘肽-谷胱甘肽还原酶系统或硫氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶系统，与这些系统相关的基因破坏株对过氧化氢等的氧化应力具有敏感性。
[0008]另一方面，报告了在乳酸菌乳酸乳球菌中，通过破坏硫氧还蛋白还原酶，有氧条件下繁殖被抑制(非专利文献3)，但有氧条件下的繁殖抑制，由于以二硫苏糖醇的添加得到恢复，而且如果培养24小时就会成为与野生株同样程度的菌体量，所以有氧条件下的繁殖抑制和耐氧性的关系没有解明。
[0009]另外，报告了在变异链球菌中，由于将NADH氧化酶、烷基过氧化氢还原酶(ahpC)双敲除的变异株具有耐氧性，所以作为另一个具有铁结合性的蛋白质的基因是与耐氧性相关的基因(专利文献I)。但是，这些基因不是所有微生物具有的基因，耐氧性机理尚未明确之处较多。另外，如这里所举出的那样，与耐氧性相关的基因有多个，不是只有I个基因发挥耐氧性能力，因此难以简便进行实际应用。[0010]另外，本发明的发明人等报告了干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中存在的fnr基因是对于有氧条件下的菌繁殖特别必要的基因，是赋予耐氧性的基因(专利文献2)。
[0011]但是，在氧化应力中，对在代谢过程中产生的过氧化氢的耐性也很重要，在乳杆菌属的微生物中，报告了 NADH过氧化物酶或过氧化氢酶等的与清除过氧化氢相关的基因，但至今没有发现对过氧化氢直接显示抗性的基因。
[0012]现有技术文献
[0013]专利文献
[0014]专利文献1:日本特开2001-327292号公报
[0015]专利文献2:国际公开第2009/150856号小册子
[0016]非专利文献
[0017]非专利文献1:L.Mariela Serrano et al.Microbial Cell Factories6:29(2007)
[0018]非专利文献2:Edson R.Rocha et al.J.Bacteriol.189:8015-8023 (2007)
[0019]非专利文献3:Karin Vido et al.J.Bacteriol.187:601-610 (2005)

【发明内容】

[0020]发明所要解决的课题
`[0021]本发明涉及提供对微生物赋予对过氧化氢的耐性的基因及其利用方法。
[0022]用于解决课题的方法
[0023]本发明的发明人等对于干酪乳杆菌?Τ9029 (FERM BP-1366)的基因组基因进行研究，发现存在即使暴露于过氧化氢下也抑制羟基自由基生成的基因，通过利用该基因，能够对微生物赋予对过氧化氢的耐性或强化微生物本来具有的对过氧化氢的耐性。
[0024]即，本发明是涉及以下发明。
[0025]I) 一种赋予过氧化氢耐性的基因，其编码选自以下的(a)~(C)中的蛋白质:
[0026](a):由序列编号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0027](b):由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质；
[0028](c):由具有与(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质。
[0029]2) 一种赋予过氧化氢耐性的基因，其包括选自以下的(d)~(f)中的多核苷酸:
[0030](d):由序列编号I所示的碱基序列组成的多核苷酸；
[0031](e):与由与(d)的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质的多核苷酸；
[0032](f):由具有与(d)的喊基序列85%以上的同一性的喊基序列组成且编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质的多核苷酸。
[0033]3) 一种对微生物赋予或强化过氧化氢耐性的方法，其特征在于，在该微生物中导入上述基因或改变该微生物具有的该基因。
[0034]4)导入或改变了上述基因得到的微生物。
[0035]5)含有上述微生物的饮料和/或食品。[0036]6)含有上述微生物的医药品。
[0037]7) 一种过氧化氢耐性微生物的筛选方法，其特征在于，测定上述基因有无和/或
其表达量。
[0038]8)包含上述多核苷酸或其一部分的重组载体。
[0039]9)包含上述重组载体的宿主微生物。
[0040]10)与上述多核苷酸特异性杂交的核酸片段。
[0041]11)包含上述多核苷酸或其一部分的DNA阵列或DNA芯片。
[0042]发明的效果
[0043]通过利用本发明的基因或多核苷酸，能够对微生物赋予过氧化氢耐性、强化微生物具有的过氧化氢耐性、筛选过氧化氢耐性的微生物。该过氧化氢耐性被赋予或强化后的微生物，即使暴露于过氧化氢下也能够控制羟基自由基的生成，抑制核酸、蛋白质、脂质等细胞构成成分的障碍。
[0044]另外，通过使用本发明的基因被导入或改变后的微生物，就能够制造所希望的对氧化应力具有抗性的饮料和/或食品、医药品。另外，由于能够在氧存在下维持较高的活菌数，所以不需要制品制造时的厌氧装置、制品的厌氧保存容器，能够实现降低成本的制造。另外，由于一般而言活菌数越高则微生物的生理效应越大，所以能够使微生物具有的生理效应有效地发挥。
【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1是表示由氧化应力造成的⑶S2657基因表达量变化的图表。
[0046]图2是表示⑶S2657基因破坏株的过氧化氢耐性(存活率)的曲线图。
[0047]图3是表示⑶S2657基因破坏株的过氧化氢清除活性的图表。
[0048]图4表示⑶S2657蛋白质的SDS-PAGE图谱。M:标记物(marker)、CL:细胞裂解液(cell lysate)、FT:流穿液(Flow through)、W:清洗液(wash)、E1&2:洗脱液(elution)
[0049]图5是表示过氧化氢对⑶S2657基因高表达株的影响的图表。
【具体实施方式】
[0050]在本说明书中，氨基酸序列和碱基序列的同一性(相同性)，能够使用通过利用基因信息处理软件GENETYX (Genetyx公司生产)的Lipman-Person法(Lipman, D.J.and Pearson, ff.R.1985.Rapid and sensitive protein similarity searches.Science227:1435-1441)的同源性解析(Search homology)程序得到。具体而言,例如，同一性通过将干酪乳杆菌YIT9029的基因与已知的基因进行相同性比较、解析来算出，作为参数，设为 Unit Size to compare=2、Pick up Location=5,将结果以 ％ 表不来进行。
[0051]另外，所谓基因，不仅包括双链DNA，还包括构成双链DNA的正义链和反义链的各个单链DNA，另外，其长度没有任何限制。另外，作为多核苷酸，可以例示RNA、DNA，DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA。
[0052]本发明的赋予过氧化氢耐性的基因是在干酪乳杆菌?Τ9029中发现的⑶S2657基因以及从该基因得到的基因，编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质。
[0053]该CDS2657基因是由其编码的蛋白质功能未被解明(假设蛋白hypotheticalprotein)的所谓功能未知的基因。
[0054]本发明的赋予过氧化氢耐性的基因，具体而言是编码选自以下的(a)~(C)中的蛋白质的基因。
[0055](a):由序列编号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0056](b):由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质；
[0057](c):由具有与(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质
[0058]其中，由序列编号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是来自于干酪乳杆菌YIT9029的蛋白质。
[0059]序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I个或2个以上的氨基酸的氨基酸序列，包括缺失、取代或添加了 I个或数个、优选I~10个氨基酸的氨基酸序列，添加包括在两末端添加I~数个氨基酸。
[0060]氨基酸的缺失、取代、添加包括例如通过由序列编号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质发生I碱基取代等天然产生的变异、或利用位点特异性变异导入法或突变处理等在基因中人工导入的变异等而产生的缺失、取代、添加。作为人工进行这样的氨基酸缺失、取代或添加时的方法，例如，可以列举对由编码序列编号2所示的氨基酸序列的碱基序列组成的多核苷酸，实施常用的位点特异性变异导入，然后由通常方法使该多核苷酸表达的方法。
[0061]另外，作为氨基酸的取代，例如，可以列举取代为与原氨基酸在疏水性、电荷、pK、立体结构上的特征等具有类似性质的氨基酸。
[0062]另外，作为具有与(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列，是指在序列编号2所示的氨基酸序列中将相当的序列适当地比对(alignment)时，具有与该氨基酸序列85%以上、优选90%以上、更优选95%以上同一性的氨基酸序列。
[0063]在本发明中，所谓“赋予过氧化氢耐性”，是指使微生物对过氧化氢的敏感性下降，即，即使在过氧化氢存在下也能够使微生物繁殖，和/或即使在过氧化氢存在下也不会使繁殖的微生物死亡。具体而言，是指即使微生物在内部或外部被暴露于过氧化氢时，也能够控制羟基自由基的生成，抑制由该羟基自由基引起的核酸、蛋白质、脂质等细胞构成成分的障碍。
[0064]本发明的赋予过氧化氢耐性的基因，适合列举由选自以下的(d)~(f)中的多核苷酸组成的基因。
[0065](d):由序列编号I所示的碱基序列组成的多核苷酸；
[0066](e):与由与(d)的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质的多核苷酸；
[0067](f):由具有与(d)的喊基序列85%以上的同一性的喊基序列组成且编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质的多核苷酸。
[0068]其中，由序列编号I所示的碱基序列组成的多核苷酸是来自于干酪乳杆菌YIT9029的DNA (⑶S2657基因)，对该微生物赋予过氧化氢耐性，使其能够在过氧化氢存在下繁殖。[0069]在本发明中，所谓“严格条件”，例如，可以列举在Molecular cloning-aLaboratory manual 2nd edition (Sambrook 等、1989)中记载的条件等。例如，可以列举如下条件:在包含6XSSC( IXSSC的组成:0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0),0.5%SDS、5X Denhardt杂交溶液和100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，与由与该碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸一起，以65°C恒温8~16小时使之杂交。
[0070]另外，作为具有与(d)的碱基序列85%以上的同一性的碱基序列，是指在序列编号I所示的碱基序列中将相当的序列适当地比对时，具有与该碱基序列85%以上、优选90%以上、更优选95%以上同一性的碱基序列。
[0071]本发明的基因能够以序列编号I的碱基序列参考，制作引物，利用以干酪乳杆菌YIT9029的DNA作为模板的通常方法的PCR法容易地得到。
[0072]即，例如，能够通过化学合成由包含任意基因的N末端起始密码子的序列组成的多核苷酸A、和由与包含该基因的终止密码子的序列互补的序列组成的多核苷酸B，将这些多核苷酸A和B作为I组，将干酪乳杆菌?Τ9029的DNA作为模板进行PCR反应而得到。另外，为了将这样操作得到的基因片段在质粒载体等中高效地进行克隆，也可以在多核苷酸引物的5’末端侧添加用于限制酶切断的序列。在这里，作为引物，一般可以使用基于与本发明基因的碱基序列相关的信息而化学合成的核苷酸等，但也可以良好地利用已经获得的本发明基因及其片段。作为该核苷酸，可以列举作为对应于序列编号I的部分核苷酸序列的10~50个连续的碱基、优选15~35个连续的碱基等。
[0073]另外，PCR的条件，例如，在得到2000碱基对长度的DNA片段时，可以列举94°C 2分钟、(95 0C 10秒钟、52°C 10秒钟、72°C 2分钟)X 30循环、72°C 7分钟。
[0074]另外，也可以利用DNA合成仪，按照该碱基序列进行人工合成而得到。
[0075]本发明的基因是与`赋予过氧化氢耐性相关的基因，所以通过将其导入微生物或改变微生物具有的该基因，能够赋予该微生物对过氧化氢的耐性或强化微生物本来具有的对过氧化氢的耐性。
[0076]本发明的基因的导入，能够通过将该基因导入原来没有该基因的微生物中进行。作为导入基因的方法，使用利用DNA的摄取能力的感受态法、利用原生质体的原生质体PEG法和利用高电压脉冲的电穿孔法等即可，特别优选电穿孔法。另外，在微生物染色体中整合基因时，可以使用基于同源重组的方法、位点特异性整合的方法。
[0077]在本发明的基因改变中，可以列举表达增强。
[0078]在增强基因的表达中，可以通过如下方法等进行即可:将载有本发明的基因的重组质粒导入作为对象的微生物中，由位点特异性重组在染色体的其他部位整合该基因使微生物内的该基因的拷贝数增加，通过改变控制该基因表达的控制区域或改变控制基因使表达增加，特别优选使该基因的拷贝数增加的方法。具体而言，在每I个微生物细胞具有多个拷贝数的质粒中，克隆入作为对象的基因以及该基因本来的引物序列和核糖体结合位点，或者在从其他基因中分离得到或由化学合成得到的引物和核糖体结合位点的下游只连接编码该基因的多肽的区域，克隆入在每I个微生物细胞具有多个拷贝数的质粒中，制成重组质粒，由电穿孔法等将其导入微生物细胞内，由此，能够提高该基因在微生物细胞内的拷贝数。
[0079]另外，对原本具有该基因的微生物，通过对该基因进行表达阻止或表达抑制，也能够使该微生物的过氧化氢耐性下降。
[0080]在阻止基因的表达中，使本发明的基因破坏、缺失即可，作为该方法，可以使用将完全无关的DNA片段插入基因内部的插入失活法、或者通过阶段性同源重组使一部分或全部靶基因缺失的阶段性双重交叉法，特别优选阶段性双重交叉法。
[0081]具体而言，在使一部分或全部靶基因缺失时，从染色体DNA中分离出夹着缺失区域的两侧的区域、或者由PCR法扩增来分离，例如，在pYSSE3那样的在大肠杆菌中增殖但在作为对象的微生物中不能复制的质粒载体中，以与本来方向相同的方向排列的状态克隆入这两条DNA片段。接着，使用电穿孔法等在要发生缺失的微生物中导入所得到的重组质粒DNA，从产生的抗生物质耐性的克隆中，利用PCR法等筛选出在与目的缺失区域的上游或下游的克隆区域相同的区域发生重组而质粒插入染色体上的克隆。将这样操作得到的克隆，用不含抗生物质的培养基反复传代培养，由此，筛选出如下失去抗生物质耐性的克隆，其中，质粒再次因接近存在的相同区域之间的重组而从染色体上脱离，伴随菌增殖消失，从而失去抗生物质耐性。能够利用PCR法等从这样操作得到的克隆中分离出缺失靶基因区域的克隆。
[0082]在抑制基因的表达中，可以使用基于合成与本发明基因的mRNA的5’末端区域互补的短的RNA的所谓RNA干涉的方法、或者将控制该基因表达的区域或控制基因破坏或者缺失等使其改变的方法，特别优选改变控制该基因表达的区域。具体地，通过改变控制基因转录的引物序列，能够增多或减少向该基因向mRNA的转录量。
[0083]其中，作为基因导入或改变的对象的微生物没有特别限定，能够使用革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母等，可以适合利用革兰氏阳性细菌，特别优选利用对机体的安全性得到确认的乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌等。在乳杆菌属细菌中，优选利用干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、玉米乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等属于干酪乳杆菌群的细菌，可以特别适合利用干酪乳杆菌。
[0084]双歧杆菌属细菌是偏性厌氧型菌，对氧、低pH和高酸度弱，在制造时的增殖和保存时的存活性等操作中困难多。由于双歧杆菌属细菌对人显示有用的生理效应，所以耗费精力利用育种改良获得对过氧化氢具有耐性的变异株或使用不透氧性容器等，其在饮料和/或食品、医药品中的应用得到发展，但存在培养困难、或在保存中活菌数下降的各种问题。双歧杆菌属细菌因为已知不具有本申请发明的赋予过氧化氢耐性的基因，所以，能够适合作为本申请发明的基因导入或改变的对象微生物利用。
[0085]这样操作得到的基因被导入或改变的微生物，因为过氧化氢耐性被赋予或增强，所以能够作为有效地发挥该微生物原来具有的各种生理效应的饮料和/或食品、医药品利用。
[0086]在将基因被导入或改变后的本发明的微生物制成饮料和/或食品、医药品时，菌体既可以是活菌或加热菌体(死菌体)的任意一种，也可以是冷冻干燥的菌体，或者还可以作为包含这些微生物的培养物、菌体处理物利用，但优选以活菌状态利用。
[0087]在作为医药品使用时，能够将本发明的微生物与固体或液体的医药用无毒性载体混合，以常用的医药品制剂的形态给药。作为这样的制剂，例如，可以列举片剂、颗粒剂、散齐?、胶囊剂等固体制剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂等液体制剂、冷冻干燥制剂等。这些制剂能够由制剂上常用手段制备。作为上述医药用无毒性载体，例如，可以列举葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水等。另外，根据需要，也可以适当添加稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂、赋形剂等常用的添加剂。
[0088]另外，基因被导入或改变后的本发明的微生物，不仅可以制成为上述那样的制剂，也可以在饮料和/或食品中配合使用。在饮料和/或食品中配合时，可以直接或使之与各种营养成分共同含有。因为该饮料和/或食品包含过氧化氢耐性被赋予或增强的微生物，所以能够作为有效地发挥该微生物原来具有的各种生理作用的保健用食品或食品材料利用。具体而言，在饮料和/或食品中配合由本发明的方法得到的微生物时，既可以适当使用能够作为饮料和/或食品使用的添加剂，使用常用手段成形为适于食用的形态，即，颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状等，另外，也可以在各种食品中添加使用，例如，在火腿、香肠等食肉加工食品，鱼糕、竹轮等水产加工食品，面包、甜点、黄油、奶粉中添加使用，或在水、果汁、牛奶、软饮料、茶饮料等饮料中添加使用。另外，饮料和/或食品也包括动物饲料。
[0089]作为饮料和/或食品，还可以列举利用本发明微生物的发酵乳、乳酸菌饮料、发酵豆乳、发酵果汁、发酵植物液等发酵饮料和/或食品的例子。这些发酵饮料和/或食品的制造按照通常方法进行即可。例如，制造发酵乳时，首先在灭菌后的乳培养基中将本发明的微生物单独或与其它微生物同时接种培养，将其进行匀浆化处理，得到发酵乳基料(base)。接着，添加混合另外制备的糖浆溶液，用匀浆器等匀浆化，再添加香味调料，加工为最终制品即可。这样操作得到的发酵乳也可以制成为不含糖浆(甜味剂)的原味类型、软质类型、水果风味类型、固体状态、液体状态等任意形态的制品。
[0090]由本发明方法得到的微生物，由于具有高的过氧化氢耐性，所以饮料和/或食品中的菌的存活性高，因此，能够抑制保存中的活菌数下降和死亡速度的增加，制品规格的维持变得容易，能够使乳杆菌属细菌等微生物具有的调节肠道作用等一般的生理效应有效地发挥。另外，对于原来具有抗癌作用、幽门螺杆菌的除菌作用等特异的生理效应的乳杆菌属细菌和双歧杆菌属细菌，通过用本发明的方法赋予或增强过氧化氢耐性，就能够在各种饮料和/或食品中利用该菌株，并且由于该菌株的存活性改善，就能够使该菌株具有的生理效应增强。`
[0091]另外，在利用双歧杆菌属细菌的饮料和/或食品中，以提高保存时的存活性为目的，一直以来主要使用以玻璃和铝涂布纸等不透氧性包装材料构成的容器，但由本发明的方法得到的赋予或强化了过氧化氢耐性的双歧杆菌属细菌，因为具有高的存活性、不需要严格的无氧状态，所以也可以使用透氧性高的树脂(聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯)作为容器材料。使用这些树脂的容器，相比于以不透氧性包装材料构成的容器，具有成本低、成型自由度高的优点。
[0092]本发明的基因也可以用于过氧化氢耐性微生物的筛选。
[0093]即，通过测定本发明的基因有无和/或其表达量，能够筛选出过氧化氢耐性的微生物。
[0094]其中，基因的有无和/或其表达量的测定，使用能够检测出本发明的基因和来自基因的mRNA的探针和引物，能够通过Southern杂交(DNA杂交)法、DNA微阵列或RT-PCR法测定微生物中作为靶标的基因的有无、拷贝数和表达量。然后，通过靶基因或其表达的有无，选择目的微生物即可。[0095]包含(d)~(f)所示的多核苷酸或其一部分(片段)的本发明的重组载体，能够使用具有能够选择该载体在大肠杆菌和作为对象的微生物中导入那样的基因标记的任意载体(例如，pHY400、pSAl、pYSSE3等)，通过体外连接法等公知的方法得到。
[0096]另外，包含上述重组载体的宿主微生物能够通过使用如下等方法得到:通过公知的方法、即在宿主微生物中导入该重组载体时用电穿孔法等的方法，在整合入微生物染色体中时，将具有与该微生物相同的DNA区域的重组载体用电穿孔法等导入后，由PCR法等确认由同源重组整合入染色体中的重组载体。
[0097]另外，包含(d)~(f)所示的多核苷酸或其一部分(片段)的本发明的DNA阵列或DNA芯片，能够由光版印刷法等公知的方法制作。通过使用该DNA阵列或DNA芯片，能够筛选表达本发明的基因的微生物。
[0098]另外，为了更有效地进行上述微生物的基因导入或改变和微生物的筛选，优选使用包含本发明的多核苷酸或其一部分的重组载体、由本发明的一部分多核苷酸片段组成的PCR和RT-PCR用引物、能够将本发明的多核苷酸或其一部分扩增的PCR和RT-PCR用引物、由与本发明的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸或其一部分组成的杂交用核酸片段。
[0099]其中，作为所使用的引物等的核酸片段，一般能够使用基于与本发明基因的碱基序列相关的信息化学合成的核苷酸等，作为该核苷酸，优选为对应于序列编号I所示的碱基序列的部分核苷酸序列，为10~50个连续的碱基，更优选为15~35个连续的碱基。
[0100]以下，利用实施例更详细地说明本发明的内容。
[0101]实施例
[0102]实施例1由氧、过氧化氢应力引起的CDS2657基因表达量的变化
[0103]关于⑶S2657基因，使用实时PCR解析施加氧或过氧化氢应力时的表达量。
[0104](I)氧化应力的施加
[0105]氧应力如下施加:在100ml的厌氧MRS培养基中培养7小时后，分为2份，将1份加入300ml容量的三角烧瓶，使用TAITEC公司生产的恒温振荡槽，以160rpm振荡30分钟。过氧化氢应力如下施加:将100ml的MRS培养基在有氧静置培养7小时后，分为2份，在I份中，添加过氧化氢达到0.5mM，继续30分钟培养。
[0106](2) RNA 的制备
[0107]将2ml用MRS培养基培养得到的培养液添加在2倍量的RNAprotect BacteriaReagent (QIAGEN)中,搅拌后,在室温孵育(incubate) 5分钟，使RNA稳定化。以5000 Xg离心10分钟集菌后，悬浮在200 μ I包含15mg/ml溶菌酶的TE缓冲液中，加入10 μ I的Img/ml的N-乙酰胞壁酸酶SG (生化学工业)，边时常以旋涡混合器搅拌，边以室温孵育10分钟。添加 700 μ I 的 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)的 Buffer RLT 进行悬浮，以 5000X g 离心 5 分钟，采集上清液。然后，按照在 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)、RNAprotect BacteriaReagent (QIAGEN)中附带的实验程序(protocol)纯化。在纯化过程中，使用RNase-FreeDNase Set (QIAGEN)进行DNase处理，将混入的DNA分解。
[0108]制备的RNA 使用 2100Bioanalyzer (Agilent)确认品质。
[0109](3)通过实时PCR的基因表达定量解析
[0110]为了对靶基因(⑶S2657基因)的表达量定量，进行了实时PCR。WlygSRNA(total RNA)为模板，使用 PrimeScriptlst strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA ΒΙΟINC.)进行逆转录反应(30°C 10分钟、42°C 50分钟、95°C 5分钟)，制备cDNA。以稀释的cDNA溶液为模板，添加SYBR Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC.)和引物，使用7500实时PCR系统(Real Time PCR System, Applied Biosystems),在 95°C维持 30 秒钟后，以 95°C 5 秒钟、60°C 34秒钟反应40个循环。另外，基因表达量以16SrRNA为内部标准，进行样品间的校正。结果用应力样品表达量相对于非应力样品表达量的相对值表示。在表1中表示使用的引物。
[0111][表1]
[0112]
【权利要求】
1.一种赋予过氧化氢耐性的基因，其特征在于: 编码选自以下的(a)~(C)中的蛋白质， (a):由序列编号2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (b):由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了I个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质； (c):由具有与(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质。
2.一种赋予过氧化氢耐性的基因，其特征在于: 包括选自以下的(d)~(f)中的多核苷酸， (d):由序列编号I所示的碱基序列组成的多核苷酸； Ce):与由与(d)的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质的多核苷酸； (f):由具有与(d)的碱基序列85%以上的同一性的碱基序列组成且编码具有赋予过氧化氢耐性能力的蛋白质的多核苷酸。
3.一种对微生物赋予或强化过氧化氢耐性的方法，其特征在于: 在该微生物中导入权利要求1或2所述的基因或改变该微生物具有的该基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于: 基因的改变为权利要求1或2所述的基因的表达增强。
5.一种微生物，其特征在于: 导入或改变了权利要求1或2所述的基因。
6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于: 微生物为革兰氏阳性细菌。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于: 革兰氏阳性细菌为乳杆菌属细菌。
8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于: 乳杆菌属细菌为干酪乳杆菌。
9.一种饮料和/或食品，其特征在于: 含有权利要求5~8中任一项所述的微生物。
10.一种医药品，其特征在于: 含有权利要求5~8中任一项所述的微生物。
11.一种过氧化氢耐性微生物的筛选方法,其特征在于: 测定权利要求1或2所述的基因的有无和/或其表达量。
12.—种重组载体，其特征在于: 包含权利要求2所述的多核苷酸或其一部分。
13.—种宿主微生物,其特征在于: 包含权利要求12所述的重组载体。
14.一种核酸片段，其特征在于: 与权利要求2所述的多核苷酸特异性杂交。
15.一种DNA阵列或DNA芯片，其特征在于:包含权利要求2所述的多核苷酸`或其一部分。
【文档编号】C12N15/09GK103732742SQ201280011277
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年3月2日 优先权日:2011年3月4日
【发明者】世良田雅纪, 木胁真祐美, 饭野透 申请人:株式会社益力多本社