克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法
【专利摘要】将属于克鲁维酵母属的酵母进行改变以提高来自木糖的乙醇收率。减弱属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1基因、与该ADH1基因在功能上等价的基因、来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4基因、和与该ADH4基因在功能上等价的基因中的至少一种基因。
【专利说明】克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用了克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法。
【背景技术】[0002]包含木素纤维素的生物质可以作为乙醇等有用醇和/或有机酸的原料而被有效地利用。包含木素纤维素的生物质包括木质系生物质和草本系生物质。木质系生物质等包含木素纤维素的生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。为了由包含木素纤维素的生物质制造乙醇等液体燃料，将纤维素和/或半纤维素水解(糖化)至构成单糖，通过发酵而将单糖转换为乙醇。纤维素由葡萄糖构成，半纤维素主要由阿拉伯糖和木糖构成。因此，在利用包含木素纤维素的生物质制造乙醇时，期望不仅葡萄糖，连木糖也作为发酵的底物而被有效地利用。
[0003]另外，在由包含木素纤维素的生物质制造乙醇时，如果能够将上述的糖化反应和发酵反应同时(不区分各反应工序地)进行，则可以实现制造成本的减低。将该方法称为同时糖化发酵方法。同时糖化发酵中，需要具有能够在糖化酶的反应温度区域(约40°C以上)发酵的耐热性、不仅能够利用葡萄糖还能够利用5碳单糖木糖作为底物的微生物。
[0004]作为具有耐热性的酵母，已知马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)等克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母。该克鲁维酵母属酵母能够利用木糖进行乙醇发酵，但其收率不充分。例如，非专利文献I和2中关于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的醇脱氢酶基因(包含多个异构体)报告了功能分析。另外，专利文献I中公开了被赋予了将木糖异构化为木酮糖的能力的重组酵母，还记载了减少醇脱氢酶活性。但是，由这些知识不能判断通过醇脱氢酶基因的缺失和/或破坏会对乙醇发酵能力有怎样的影响。并且，不能判断作为分类学上不同的种的马克斯克鲁维酵母等克鲁维酵母属酵母中的醇脱氢酶基因的功能。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:日本特表2005-514951号公报
[0008]非专利文献
[0009]非专利文献1:FEMS Yeast Research2, (2002) ρ.481-494
[0010]非专利文献2:FEMS Yeast Research8, (2008) ρ.967-978
【发明内容】
[0011]发明要解决的课题
[0012]如上所述，克鲁维酵母属酵母具有木糖同化性且具有耐热性，因而被较大地期待作为在上述的同时糖化发酵法等中有用的微生物。但是，克鲁维酵母属酵母来自木糖的乙醇收率非常差，另外也不知晓改善该收率的手段。因此，本发明鉴于这样的事实，目的在于提供以提高来自木糖的乙醇收率的方式进行了改变而得的属于克鲁维酵母属的突变体酵母、和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法。
[0013]用于解决课题的方法
[0014]为了实现上述目的，本
【发明者】们进行了深入研究，结果发现，通过减弱克鲁维酵母属酵母中的多个醇脱氢酶基因中的特定的基因，从而该酵母中的来自木糖的乙醇收率大幅提高，从而完成了本发明。即，本发明包含以下(I)-(6)。
[0015](I)突变体酵母，减弱了属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的ADHl基因、与该ADHl基因在功能上等价的基因、来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4基因、和与该ADH4基因在功能上等价的基因中的至少一种基因。
[0016](2)根据(I)所述的突变体酵母，其特征在于，所述属于克鲁维酵母属的酵母是马克斯克鲁维酵母。
[0017](3)根据(I)所述的突变体酵母，其特征在于，所述与ADHl基因在功能上等价的基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母，并编码以下(a)-(C)的任一蛋白质，
[0018](a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质，
[0019](b)包含相对于序列号2的氨基酸序列具有90%以上的序列类似性的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质，
[0020](c)包含相对于序列号2的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了 I-多个氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
[0021](4)根据(I)所述的突变体酵母，其特征在于，所述与ADH4基因在功能上等价的基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母，并编码以下(a)-(C)的任一蛋白质，
[0022](a)包含序列号4的氨基酸序列的蛋白质，
[0023](b)包含相对于序列号4的氨基酸序列具有90%以上的序列类似性的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质，
[0024](c)包含相对于序列号4的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了 I-多个氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
[0025](5)乙醇的制造方法，其包括以下工序:
[0026]用含木糖的培养基来培养(I)-(4)的任一项所述的突变体酵母的培养工序，和
[0027]然后，从培养基回收乙醇的回收工序。
[0028](6)根据(5)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，将所述培养工序在包含所述突变体酵母、含木素纤维素的生物质和糖化酶的反应体系中进行。
[0029]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-076715号的说明书和/或附图所记载的内容。
[0030]发明的效果
[0031]本发明的突变体酵母来自葡萄糖的乙醇收率几乎不变，来自木糖的乙醇收率大幅提高。因此，本发明的突变体酵母可以在包含例如来源于木质系生物质等包含木素纤维素的生物质的木糖的培养基中高收率地制造乙醇。[0032]本发明的乙醇的制造方法通过利用来自木糖的乙醇收率大幅提高了的突变体酵母，从而可以大幅提高乙醇制造效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1是显示用含木糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的木糖浓度变化的特性图。
[0034]图2是显示用含木糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的乙醇浓度变化的特性图。
[0035]图3是显示用含木糖的培养基培养4种ADH破坏株时的菌体浓度变化的特性图。
[0036]图4是显示用含葡萄糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的木糖醇浓度变化的特性图。
[0037]图5是显示用含葡萄糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的乙醇浓度变化的特性图。
[0038]图6是显示用含葡萄糖的培养基培养4种ADH破坏株时的菌体浓度变化的特性图。
[0039]图7是显示来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的ADHl与来源于马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的 ADHl 之间的比对(alignment)白勺图。
[0040]图8是显示来源于酿酒酵母的ADHl与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的比对的图。
[0041]图9是显示来源于酿酒酵母的ADHl与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的比对的图。
[0042]图10是显示来源于酿酒酵母的ADHl与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的比对的图。
[0043]图11是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADHl之间的比对的图。
[0044]图12是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的比对的图。
[0045]图13是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的比对的图。
[0046]图14是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的比对的图。
[0047]图15是显示来源于酿酒酵母的ADHl与来源于酿酒酵母的ADH2之间的比对的图。【具体实施方式】
[0048]本发明的突变体酵母具有以下特征:减弱了克鲁维酵母属酵母中的特定醇脱氢酶基因，来自木糖的乙醇收率提高了。[0049]这里，克鲁维酵母属酵母是包含K.aestuari1、K.africanus、K.bacillisporus、K.blattae、多布克鲁维酵母(K.dobzhanskii)、湖北克鲁维酵母(K.hubeiensis)、乳酸克鲁维酵母(K.1actis)、K.lodderae、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、非发酵克鲁维酵母(K.nonfermentans)、K.piceae、中国克鲁维酵母(K.sinensis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans) > K.walti1、威克海姆克鲁维酵母(K.wickerhamii)和亚罗克鲁维酵母(K.yair0Wii)等酵母的含义。即，本发明的突变体酵母可以通过对这些具体的克鲁维酵母属酵母及其突变体减弱特定的醇脱氢酶基因来制作。作为克鲁维酵母属酵母，特别优选使用作为耐热性酵母已知的马克斯克鲁维酵母。作为马克斯克鲁维酵母，不特别限定，可以使用在保藏机构能够分售地保存的公知株，另外还可以使用由公知株衍生的突变株。作为马克斯克鲁维酵母的公知株，可列举马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株。作为由公知株衍生的突变株，可例示例如，为了对马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株付与营养缺陷型而破坏ura3基因和/或leu2基因而得的株。
[0050]本发明的突变体酵母中减弱了特定的醇脱氢酶基因。这里“基因的减弱”是包含降低该基因的表达量、降低由该基因编码的酶的活性这两方面。例如，通过使特定的醇脱氢酶基因破坏或缺失的方法、使该基因的表达控制区(启动子等)破坏或缺失的方法、表达针对该基因的反义RNA的方法等，可以降低该基因的表达量。另外，应用所谓转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导的降解(Nonsense mediated decay, NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(微小 RNA, micro-RNA)法、siRNA(小干扰 RNA, small interferingRNA)法等，可以减低该基因的表达量。进而，通过使醇脱氢酶的抑制剂作用的方法等，可以降低由该基因编码的酶的活性。此外，还可以组合这些方法，来减弱特定的醇脱氢酶基因。
[0051]另外，本发明的突变体酵母具有来自木糖的乙醇收率提高了的特征。换言之，本发明的突变体酵母具有木糖代谢能力提高了的特征。这里，木糖代谢能力是指将培养基所含的木糖代谢而形成醇的发酵 反应的效率。因此，木糖代谢能力的提高，与提高该发酵反应的反应效率成为同义。酵母的木糖代谢能力可以通过用含木糖的培养基进行培养，对产生的醇进行定量来评价。另外，酵母的木糖代谢能力可以以例如培养基所含的木糖的摄入速度(消耗速度)为指标来评价。木糖的摄入速度可以通过经时地测定培养开始时已知浓度的木糖的减少量来计算。
[0052]减弱的醇脱氢酶基因是存在于克鲁维酵母属酵母中的多个醇脱氢酶基因中的特定的醇脱氢酶基因。具体地，醇脱氢酶基因在马克斯克鲁维酵母中已知4个种类(KmADHl-KmADH4)。在马克斯克鲁维酵母中减弱的醇脱氢酶基因是它们中的KmADHl基因和/或KmADH4基因。在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中减弱的醇脱氢酶基因是与KmADHl基因在功能上等价的ADH基因和/或与KmADH4基因在功能上等价的ADH基因。
[0053]在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中，与KmADHl基因在功能上等价的ADH基因和与KmADH4基因在功能上等价的ADH基因可以通过现有公知的方法来鉴定。例如，首先，在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中特定多个醇脱氢酶基因。而且，从由这些基因编码的醇脱氢酶中，特定具有与由KmADHl基因编码的醇脱氢酶的氨基酸序列序列类似性最高的氨基酸序列的醇脱氢酶。这样特定的醇脱氢酶基因，可以特定为与马克斯克鲁维酵母中的KmADHl基因在功能上等价的基因。此外，在特定与KmADH4基因在功能上等价的基因时也是同样的。这里，序列类似性的值是指使用安装了 BLAST(序列局部比对查询工具，Basic Local Alignment Search Tool)程序的计算机以默认的设定求出的值。
[0054]这里，KmADHl基因的编码区的碱基序列和由KmADHl基因编码的醇脱氢酶的氨基酸序列分别不于序列号I和2。另外，KmADH4基因的编码区的喊基序列和由KmADH4基因编码的醇脱氢酶的氨基酸序列分别示于序列号3和4。
[0055]此外，存在于马克斯克鲁维酵母中的这些KmADHl基因和KmADH4基因不限于以上的具体的碱基序列和氨基酸序列。即，KmADHl基因和KmADH4基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质，还包含编码含有分别相对于序列号2和4所示的氨基酸序列具有80%以上、优选为85%以上、更优选为90%以上、进一步优选为95%以上、最优选为98%以上的序列类似性的氨基酸序列的蛋白质的基因。这里，序列类似性的值是指使用安装了 BLAST (BasicLocal Alignment Search Tool)程序的计算机以默认的设定求出的值。
[0056]另外，KmADHl基因和KmADH4基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质，还包含编码含有分别对序列号2和4所示的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了 I个或多个(例如2-35个、优选为2-30个、更优选为2-20个、进一步优选为2-10个)氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。
[0057]进而，KmADHl基因和KmADH4基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质，则也包含相对于分别包含序列号 I和3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸的一部分或全部在严格条件下杂交的多核苷酸。这里，严格条件是指具有90%左右、优选为95%、进一步优选为98%的同一性的一对多核苷酸形成特异性杂交的条件(温度条件、盐浓度条件)。
[0058]<乙醇制造>
[0059]通过利用以上所说明的突变体酵母，可以进行以木糖等糖为底物的乙醇发酵。特别是，上述的本发明的突变体酵母具有优异的木糖代谢能力，即来自木糖的乙醇收率优异，因而适合利用了含木糖的培养基的乙醇发酵。含木糖的培养基是克鲁维酵母属酵母能够生长的培养基，是指至少含有木糖作为成为乙醇合成的底物的糖成分的培养基。此外，含木糖的培养基还可以含有除了木糖以外的糖成分，例如葡萄糖。
[0060]对含木糖的培养基不特别限定，可以通过在SD培养基、YPD培养基、YPAD培养基、YM培养基和含Yeast Nitrogen Base的各种合成培养基中添加木糖，或者将这些公知培养基所含的糖成分替换成木糖来制备。
[0061]另外，还可以从木质系生物质、草本系生物质这样的包含木素纤维素的生物质制备含木糖的培养基。即，将包含木素纤维素的生物质所含的纤维素、半纤维素进行糖化处理，使用所得的处理物作为含木糖的培养基。作为糖化处理不特别限定，可以毫不限制地利用现有公知的方法。作为糖化方法，可列举例如，利用稀硫酸或浓硫酸的硫酸法、利用纤维素酶、半纤维素酶的酶法等。另外，可以在糖化处理之前，对木质系生物质、草本系生物质实施现有公知的前处理。作为前处理不特别限定，可列举例如，将木质素用微生物分解的处理，木质系生物质、草本系生物质的粉碎处理，浸溃在离子液体、碱溶液中缓和结构的处理，用高温水进行蒸煮的水热处理，利用氨的处理等。
[0062]特别是，在由马克斯克鲁维酵母制作的突变体酵母中，耐热性特别优异，因而可以在例如40°C上、优选为35-48°C、更优选为40-42°C这样的比较高温度下进行乙醇发酵。这样的温度区域是纤维素酶、半纤维素酶这样的糖化酶也显示活性的温度区域。因此，该突变体酵母适合利用了糖化酶的所谓同时糖化发酵。这里，同时糖化发酵是指将利用糖化酶的木质系生物质的糖化处理、和来自木糖的乙醇发酵处理在同一反应体系中进行的处理。更具体地，将含有木质系生物质、糖化酶和突变体酵母的溶液在例如40°C这样的温度条件进行孵育。由此，可以进行木质系生物质的糖化、和来自由糖化而得的木糖、葡萄糖的乙醇发酵，从而制造乙醇。另外，此时即可以搅拌溶液，也可以振荡溶液。
[0063]另外，在回收由培养基所含的木糖等碳源发酵生产而得的乙醇时，不特别限定，可以应用现有公知的任何方法。例如，上述的乙醇发酵结束后，通过固液分离操作而分离成含乙醇的液层、和含有突变体酵母、固体成分的固层。然后，将液层所含的乙醇通过蒸馏法分离?纯化，从而可以回收纯度高的乙醇。此外，乙醇的纯化度可以根据乙醇的使用目的适宜调整。
[0064]实施例
[0065]以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于以下的实施例。
[0066]〔实施例1〕
[0067]在本实施 例中，使用马克斯克鲁维酵母作为克鲁维酵母属酵母，制作醇脱氢酶基因的破坏株，对来自木糖的乙醇收率进行比较研究。
[0068]<株的制作>
[0069]<利用接合、孢子形成的ura3-leu2_突变株的制作>
[0070]使用作为马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ura3_株的RAK3605株(Nonklang, S.et al., Appl.Environ.Microbiol.74, p.7514-7521 (2008))作为基准株。明确了来源于马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的营养缺陷型突变株以低频率成为2倍体。通过紫外线突变可以获得多重营养缺陷型突变株，其结果是在染色体DNA中引入突变的概率上升。为了制作更稳定的株，通过接合和孢子形成，从而为了由2倍体简单地制作多重营养缺陷型株而制作了以下的株。
[0071]首先，对RAK3605株照射紫外线照射，获得Iys-株(RAK3896株:ura3-lys2-)、ade-株(RAK3919 株:ura3-ade2_)和 Ieu-株(RAK3966 株:ura3_leu2_)。制作在这些株中将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3随机地向染色体转化而得的株、RAK4088 株(ura3-leu2-ScURA3)、RAK4152 株(ura3-ade2_ScURA3)、RAK4153 株(ura3-lys2-ScURA3)。将 RAK4152 和 RAK4153 株在 YPD 培养基(l%w/v 酵母提取物，2%w/V胨，2%葡萄糖，2%w/V琼脂)上以混合的方式划线，向丽培养基(0.17%w/V yeastnitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate (酵母氮源，不含氨基酸，不含硫酸铵)，0.5%w/v硫酸铵，2%w/V葡萄糖，2%w/V琼脂)复制。将在丽培养基中生长的株 RAK4154 株(ura3-/ura3-ade2-/ADE2, lys2-/LYS2ScURA3/ScURA3)接菌到在酿酒酵母(S.cerevisiae)中使用的SPO培养基(l%w/v醋酸钾，0.l%w/v酵母提取物，0.05%w/v葡萄糖)中使其形成孢子。
[0072]为了分离制作的孢子，获得ura-lys-ade-的3重营养缺陷型株，向-A培养基(MM+尿嘧啶，色氨酸，组氨酸盐酸盐，蛋氨酸，亮氨酸，赖氨酸盐酸盐)，-K培养基(MM+尿嘧啶，色氨酸，组氨酸盐酸盐，蛋氨酸，亮氨酸，腺嘌呤硫酸盐)，-U培养基(MM+色氨酸，组氨酸盐酸盐，蛋氨酸，亮氨酸，赖氨酸盐酸盐，腺嘌呤硫酸盐)复制，成功地从RAK4154株的孢子获得了 3株在3种培养基中不能增殖的株。将该株命名为RAK4155株(ura3-lys2-ade2-)。通过同样的方法使RAK4088株与RAK4155株接合，制作RAK4156株(ura3-/ura3-lys2-/LYS2ade2-/ADE21eu2-/LEU2ScURA3/ScURA3)。使该株形成孢子，制作RAK4174 株(Ieu2-ura3_)。
[0073]<Ku70破坏株的制作>
[0074]马克斯克鲁维酵母由于以高频率发生非同源末端结合修复，因而不能像酿酒酵母(S.cerevisiae)那样利用同源重组修复容易地进行基因破坏(Nonklang, S.etal., Appl.Environ.Microbiol.74, p.7514-7521 (2008))。因此，通过破坏非同源末端结合修复所需的KU70基因来进行高频率地发生同源重组的株的制作。由RAK4174株制作破坏 7 KU70 的 RAK4736 株(leu2-ura3-Kmku70Δ::ScLEU2)(Abdel-Banat, B.M.etal., Yeast27, 29-39(2010))。
[0075]< ADHl破坏株的制作>
[0076]马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADHl基因中的推定开放阅读框(openreading frame)用Genetyx ver.10(株式会社七 预测。马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADHl基因编码由348个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列信息设计以下的一对引物。
[0077]
【权利要求】
1.突变体酵母，减弱了属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的ADHl基因、与该ADHl基因在功能上等价的基因、来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4基因、和与该ADH4基因在功能上等价的基因中的至少一种基因。
2.根据权利要求1所述的突变体酵母，其特征在于，所述属于克鲁维酵母属的酵母是马克斯克鲁维酵母。
3.根据权利要求1所述的突变体酵母，其特征在于，所述与ADHl基因在功能上等价的基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母，并编码以下(a)-(C)的任一蛋白质， (a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质， (b)包含相对于序列号2的氨基酸序列具有90%以上的序列类似性的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质， (c)包含相对于序列号2的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了I-多个氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
4.根据权利 要求1所述的突变体酵母，其特征在于，所述与ADH4基因在功能上等价的基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母，并编码以下(a)-(c)的任一蛋白质， (a)包含序列号4的氨基酸序列的蛋白质， (b)包含相对于序列号4的氨基酸序列具有90%以上的序列类似性的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质， (c)包含相对于序列号4的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了I-多个氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
5.乙醇的制造方法，其包括以下工序: 用含木糖的培养基来培养权利要求1-4的任一项所述的突变体酵母的培养工序，和 然后，从培养基回收乙醇的回收工序。
6.根据权利要求5所述的乙醇的制造方法，其特征在于，将所述培养工序在包含所述突变体酵母、含木素纤维素的生物质和糖化酶的反应体系中进行。
【文档编号】C12N1/19GK103459588SQ201280015362
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月26日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】志佐伦子, 赤田伦治, 星田尚司, 上村毅, 牟田口梢荣, 德弘健郎, 片平悟史 申请人:丰田自动车株式会社