角膜上皮分化取向性iPS细胞的制作方法

角膜上皮分化取向性iPS细胞的制作方法
【专利摘要】本发明的主要目的在于提供一种分化诱导出角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的方法，其用于得到易于获得、并且在产生血管化的可能性的观点等中安全性更高的角膜上皮细胞片。一种多能干细胞向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法，其中，包括在基质细胞或来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞的工序。
【专利说明】角膜上皮分化取向性iPS细胞
【技术领域】
[0001] 本发明主要涉及多能干细胞向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法、角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的制造方法、来源于该角膜上皮干细胞的角膜上皮细胞片、以及在向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导中使用的诱导多能干细胞(iPS细胞)。
【背景技术】
[0002]保持良好的视觉功能对于QOL的维持而言极其重要。因此，对于视觉功能受损的眼病、特别是对于难治性眼病而言，开发根本性治疗的社会需求极高。作为难治性眼病的一组，已知作为角膜上皮干细胞缺损症的史-约(Stevens-Johnson)综合征、眼类天疱疮、碱腐蚀等疾病。在角膜上皮干细胞缺损症中，由于由外伤、自身免疫等造成的慢性炎症反应，存在于眼的角膜缘的角膜上皮干细胞陷入不可逆的功能不全、或者消失，从而呈现角膜混浊的症状。结果，眼的结膜上皮侵入到角膜中央部，由此角膜失去本来具有的透明性，导致显著的视力下降。作为用于恢复角膜上皮干细胞缺损症等严重的角膜疾病患者的视力的措施，一直以来施行角膜移植术。特别地，对于双眼发病的双眼性患者而言，现状是由于不存在来源于患者本人的正常角膜，因此只能施行异体角膜移植术。但是，在进行异体角膜移植术时，存在能够供给所需角膜的供体不足的问题、会对来源于供体的角膜产生排斥反应的问题，因此，希望开发使用了自体细胞源的治疗法。
[0003]对于单眼性角膜疾病患者而言，在正常眼的角膜周边(角膜缘)存在角膜上皮干细胞，因此施行在取该细胞后，由该细胞再生角膜片并移植的方法(非专利文献I)。由自身的角膜上皮干细胞再生的角膜片为来源于自身的细胞，因此具有不产生排斥反应的优点。
[0004]另一方面，对于双眼性角膜疾病患者而言，由于不存在角膜上皮干细胞，因此无法进行上述措施。需要说明的是，多数角膜上皮干细胞缺损症的患者是双眼性的。作为使用双眼性角膜疾病患者的自体细胞的再生治疗方法，已开发出使用患者自身的口腔粘膜上皮的干细胞的自体口腔粘膜上皮细胞片移植法(非专利文献2)。自体口腔粘膜上皮细胞片移植法已经进行临床应用，并留下了良好的临床成绩。具体而言，在15个病例中，在一年的观察期中的透明治愈率为93% (14/15眼)，视力改善率为80% (12/15眼)。即，已报告多数眼病患者通过自体口腔粘膜上皮细胞片移植法恢复视力。
[0005]另一方面，口腔粘膜为血管丰富的组织，因此认为，对于应用了自体口腔粘膜上皮细胞片移植法的患者而言，长期来看，有可能在移植的口腔粘膜上皮细胞片中发生血管化，进而有可能发生血管化而口腔粘膜上皮细胞片的透明性下降。因此，理想的是由来源于患者的自体细胞制作角膜上皮本身。但是现状是，由来源于患者的自体细胞分化诱导出用于制作角膜上皮、特别是角膜上皮片的角膜上皮细胞、角膜上皮干细胞的方法仍然未知。
[0006]用于分化诱导出特定细胞的方法，仅对于一部分特定细胞已知。例如作为将胚胎干细胞分化诱导为神经干细胞、神经细胞、神经嵴的细胞或神经管等的方法，已知SDIA法(专利文献2和非专利文献3) oSDIA法的特征在于在基质细胞的存在下对胚胎干细胞进行，其被认为是用于在胚胎干细胞中抑制向表皮细胞等的分化、而进行向神经细胞等的分化诱导的方法。可见，利用SDIA法分化诱导出的是神经细胞等，与在胚胎学上认为与表皮细胞近似的角膜上皮细胞、角膜上皮干细胞的分化诱导方法不同。
[0007]近年来，由山中等开发的人工诱导多能干细胞(iPS细胞)能够由可以容易地获取的患者自身的成纤维细胞等体细胞建成(专利文献I)。已知iPS细胞具有与胚胎干细胞(ES细胞)匹敌的多潜能性。将iPS细胞用于细胞源的再生医疗，被期待是能够同时解决供体不足问题和排斥反应问题的方法。另外，无需在ES细胞的情况下为必须的将早期胚胎破坏的工序，因此也不存在与早期胚胎的破坏有关的伦理问题。但是，现状是至今仍然没有由人ES细胞、人iPS细胞分化诱导出角膜上皮的报告。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:国际公开第2007/069666号
[0011]专利文献2:国际公开第2001/088100号
[0012]专利文献3:日本特开2004-261533号
[0013]专利文献4:日本特开2005-333904号`
[0014]非专利文献
[0015]非专利文献I:Nishida K.等，Transplantation2004, 77:379-385.[0016]非专利文献2 =Nishida K.等，N Engl J Med2004，351:1187-1195.[0017]非专利文献3:Kawasaki H.等，Neuron2000, 28:31-40.
【发明内容】

[0018]发明解决的课题
[0019]本发明的目的在于提供一种分化诱导出和制造角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的方法，其用于得到与以往的自体口腔粘膜上皮细胞片同等地易于获得、并且在产生血管化的可能性的观点等中安全性更高的角膜上皮细胞片。另外，本发明的目的还在于提供来源于上述角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的角膜上皮细胞片、用于向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞分化诱导的细胞材料等。
[0020]解决课题的手段
[0021]本发明人为了解决上述课题进行了广泛深入的研究，结果惊讶地发现，通过在基质细胞的存在下培养多能干细胞，能够将诱导多能干细胞分化诱导为角膜上皮细胞和角膜上皮干细胞。另外还发现，通过使用由来源于眼表上皮的细胞制备的诱导多能干细胞进行分化诱导，可更有效地实现向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导。通过基于所述发现反复进行研究，完成了本发明。
[0022]即，本发明包含下述方式的发明。
[0023]项1.一种多能干细胞向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法，其中，包括在基质细胞或来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞的工序。
[0024]项2.根据项I所述的分化诱导方法，其中，所述培养在无血清培养基中进行。
[0025]项3.根据项2所述的分化诱导方法，其中，所述无血清培养基至少在从培养开始至培养开始后I~2周之间实质上不含有BMP4。[0026]项4.根据项I~3中任一项所述的分化诱导方法，其中，所述多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
[0027]项5.根据项4所述的方法，其中，所述诱导多能干细胞为通过在来源于眼表上皮的细胞中导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而得到的诱导多能干细胞。
[0028]项6.—种包括下述工序的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的制造方法:
[0029](I)在基质细胞或来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞的工序、和
[0030](2)从所述培养的细胞中选择角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的工序。
[0031]项7.根据项6所述的制造方法，其中，所述选择角膜上皮干细胞的工序为选择具有自我增殖能力且表达角膜上皮干细胞特异性标记的细胞的工序。
[0032]项8.—种角膜上皮细胞片，其来源于利用项6或7所述的制造方法得到的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞。
[0033]项9.一种诱导多能干细胞，其通过对来源于眼表上皮的细胞导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而得到。
[0034]项10.根据项9所述的诱导多能干细胞，其用于向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导。
[0035]项11.一种用于向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞分化诱导的细胞材料，其含有权利要求9或10所述的诱导多能干细胞。
[0036]发明效果
[0037]根据本发明，首次在世界范围提供使用患者自身的细胞，向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法、以及制造角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的方法。根据本发明得到的角膜上皮干细胞、以及来源于其的角膜上皮细胞片与口腔粘膜上皮细胞片同等程度地易于获得。另外，由患者自身的细胞分化诱导出的角膜上皮细胞、角膜上皮干细胞、和来源于其的角膜上皮细胞片，在向该患者自身移植(自体移植)时，由于为患者自身的细胞，因此不具有排斥反应。并且，根据本发明，可提供不具有口腔粘膜上皮细胞片的情况等的血管化问题的、安全性比现有技术更高的角膜上皮细胞片。
[0038]另外，根据本发明，可提供适于在向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导中使用的诱导多能干细胞。
[0039]另外，利用本发明而人工制作的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞，能够成为以往只能通过由患者获得而得到的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的供给源，因此能够作为眼角膜领域的再生医疗中的有助于进一步的技术提高的有用的工具使用。
【专利附图】

【附图说明】
[0040]图1(a)示出由眼表上皮建成的人iPS细胞株B31(上段左)、B34(上段中)、B41(上段右)、C51(下段中)和D43(下段左)的相位差显微镜图像。作为对照，示出人iPS细胞株253G1 (下段右)的相位差显微镜图像。(b)示出B41细胞株的ES细胞标记(ESMarker)染色图像。对于E_Cadherin、Nanog、0ct3/4和Sox2分别示出相位差显微镜图像(左)、核染色(中)、免疫染色图像(右)。
[0041]图2(a)示出B34、B41、C51和D43细胞株的核型分析的结果。(b)示出由B41细胞株形成的畸胎瘤(上段)、以及在畸胎瘤中形成的外胚叶(中段左:色素上皮和表皮、中段右:神经)、中胚叶(下段左)、和内胚叶(下段右)。
[0042]图3示出分化诱导条件下的B41株、201B7株和253G1株中的、利用RT-PCR测定pax6和K12(角蛋白12)的基因表达量得到的结果。最下段为在B41株的诱导初期(2周)添加BMP4时的pax6和K12的基因表达分析结果。横轴以周示出分化诱导后的经过期间，纵轴示出相对于标准基因GAPDH的表达量的相对比。
[0043]图4a示出分化诱导条件下的B41株中的、pax6(右上和右下)以及K12(左上和左下)的表达。
[0044]图4b利用免疫染色示出该B41株中的K14和K12的表达:相位差显微镜图(左上)、K12 (右上)、K14 (左下)、K14+K12 (右下)。
[0045]图4c利用免疫染色示出分化诱导后的253G1株中的p63、K14、和K12的表达:相位差显微镜图(上段左)、p63(上段右)、K14(中段左)、K12(中段右)、p63+K12+K14(下段左)。
[0046]图4d示出对在添加有BMP4的条件下进行分化诱导后的B41株考查pax6、K12、和K14的表达的结果:相位差显微镜图(左上)、K12 (右上)、pax6 (左下)、K14 (右下)。
[0047]图4e示出对在添加有BMP4的条件下进行分化诱导后的253G1株考查pax6、K12、和K14的表达的结果:相位差显微镜图(左上)、K12 (右上)、pax6 (左下)、K14 (右下)。
[0048]图5(a)示出由B41株分化诱导的角膜上皮干细胞(或前体细胞)的位相差图像(相位(phase))、以及pax6和K14(角蛋白14)的免疫染色图像:相位差显微镜图(左上)、?&妨(右上)、1(14(左下)、1(14和？&妨(右下)。(b)示出该细胞的位相差图像(相位)、以及p63+K14(角蛋白14)的免疫染色图像:相位差显微镜图(左上)、pax6(右上)、K14(左下)、K14+pax6 (右下)。
【具体实施方式】
[0049]本发明的目的主要在于提供向多能干细胞的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法、制造方法、角膜上皮细胞片、诱导多能干细胞和细胞材料。以下，以分化诱导方法、制造方法、角膜上皮细胞片、诱导多能干细胞、细胞材料的顺序进行说明。
[0050]1.分化诱导方法
[0051]本发明的、多能干细胞向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法，为包括在基质细胞的存在下或来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞的工序的分化诱导方法。以下详述本发明的分化诱导方法，该说明对于后述的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的制造方法也共通。
[0052]在本发明中，多能干细胞向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞进行分化诱导。本发明的分化诱导方法包含:向角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞的分化诱导方法、角膜上皮干细胞的分化诱导方法、和角膜上皮细胞的分化诱导方法。优选为向角膜上皮干细胞的分化诱导方法，但并不限定于此。
[0053]在此，角膜是存在于包括人在内的多数哺乳类的眼球的、在眼球壁的前面形成与外界接触的部分的外层的膜，是透明的具有皿状形态的膜。解剖学上已知，角膜从外侧起主要由角膜上皮、角膜实质和角膜内皮构成。
[0054]一般认为， 角膜上皮在发育中来源于外胚叶，由表皮进行分化。已知正常的角膜上皮具有再生能力，角膜上皮的再生通过角膜上皮干细胞反复进行自我增殖和分化来实现。即，角膜上皮干细胞是具备子细胞有与自身相同的特性的自我增殖能力、和最终分化为角膜上皮细胞的分化能力的细胞。一般认为，角膜上皮干细胞经过角膜上皮前体细胞和过渡放大细胞(transient amplifying cell) (TA细胞)分化为角膜上皮细胞。在正常的角膜中，角膜上皮干细胞存在于位于角膜上皮与结膜的边界的角膜缘、特别是角膜缘上皮基底部。另一方面，在发生史-约综合征、眼类天疱疮、碱腐蚀等角膜上皮干细胞缺损症的角膜中，角膜上皮干细胞陷入不可逆的功能不全、或者消失。
[0055] 在本发明中向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞进行分化诱导多能干细胞，只要为具有分化多能性、并且具有增殖能力的细胞，则能够使用所有多能干细胞。上述分化多能性包含向包括外胚叶性的细胞优选表皮系的细胞、特别优选角膜上皮细胞的细胞进行分化的能力。
[0056]根据分化诱导出的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的使用目的，上述多能干细胞可以适当选择来源于存在角膜上皮干细胞的哺乳类(例如人、小鼠、猴子、牛、狗、猫、兔子、猪、山羊等)的多能干细胞。在出于人眼病的治疗、人眼病的治疗领域中的开发工具等目的而使用的情况下，上述多能干细胞优选为来源于人的多能干细胞。来源于人的多能干细胞可以为来源于所有年龄段的人(婴儿、幼儿、少年、青年、成年、壮年、老年)的多能干细胞。另外，与人的性别无关。在出于人眼病的治疗目的使用分化诱导出的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的情况下，优选来源于从眼病患者获取的细胞。需要说明的是，在使用从眼病患者获取的细胞的情况下，期望进行所谓的知情同意。
[0057]作为上述多能干细胞的优选的具体例，可以例示胚胎干细胞和诱导多能干细胞，但不限定于此。
[0058]上述胚胎干细胞(ES细胞)是指来源于早期胚胎的内部细胞块、且具有实质上能够向所有细胞分化的分化多能性和自我增殖能力的干细胞。作为上述胚胎干细胞，能够使用来源于现在已建成的、或者今后要新建成的所有胚胎干细胞的株系的细胞。需要说明的是，一般公知，例如可以通过从母胎中摘出早期胚胎(例如从受精卵至囊胚之间的早期胚胎)，并在饲养细胞例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞、Mouse Embryonic Fibroblast)的存在下培养早期胚胎的内部细胞块来制作胚胎干细胞，但本发明中使用的胚胎干细胞的制作方法并不限定于此。
[0059]上述诱导多能干细胞(iPS细胞)是指通过在体细胞中导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而具备分化多能性和自我增殖能力的、来源于体细胞的细胞(例如参考专利文献I)。
[0060]作为制造上述诱导性多能干细胞的方法，可以广泛使用本领域技术人员公知的方法和今后会确立的方法。即，诱导多能干细胞可以通过在体细胞中导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子来制造。或者作为在本发明中使用的诱导多能干细胞，可以使用已经建成的诱导多能干细胞株。
[0061]上述能够将体细胞诱导为多能干细胞的重编程因子，只要是能够将体细胞初始化的因子，则没有特别限制，可以广泛使用现在公知的因子和今后被开发的因子。
[0062]作为上述能够将体细胞诱导为多能干细胞的重编程因子的具体例，可以列举:0CT家族、SOX家族和KLF家族的组合；0CT家族、SOX家族、KLF家族和MYC家族的组合；0CT家族、SOX家族、NANOG和LIN28的组合等，但并不限定于此。
[0063]作为上述OCT家族，可以列举选自0CT3/4、OCTlA和0CT6中的至少一个，但不限定于此。作为上述SOX家族，可以列举选自S0X1、S0X2、S0X3、S0X7、S0X15、S0X17和S0X18中的至少一个，优选列举SOXl和/或S0X2，但不限定于此。作为上述KLF4，可以列举选自KLFl、KLF2、KLF4和KLF5中的至少一个，优选列举选自KLF2、KLF4和KLF5中的至少一个，但不限定于此。上述MYC家族可以列举选自C-MYC、N-MYC、和L-MYC中的至少一个，但不限定于此。
[0064]作为上述能够将体细胞诱导为多能干细胞的重编程因子，可以优选使用广泛已知的a)人中的0CT3/4、S0X2和KLF4这三个因子的组合、或者所述三个因子再加上C-MYC的四个因子的组合、以及0CT3/4、S0X2、NANOG和LIN28这四个因子的组合；b)小鼠中的0ct3/4、Sox2和Klf4这三个因子的组合、或者所述三个因子再加上c-Myc的四个因子的组合；等。需要说明的是，0CT3/4、S0X2、KLF4 和 C-MYC(0ct3/4、Sox2、Klf4 和 c_Myc)的组合也已知为“山中因子”。
[0065]上述能够将体细胞诱导为多能干细胞的重编程因子，以能够将体细胞诱导为多能干细胞为限，可以为基因(核酸分子)或基因产物(蛋白质)中的任意一种，但从提高诱导多能干细胞的建成效率的观点出发，优选为基因(核酸分子)。需要说明的是，关于上述具体的诱导因子，对于本领域技术人员而言，碱基序列(基因)和氨基酸序列(蛋白质)均是公知的。该碱基序列和氨基酸序列被例如美国国立生物工程信息中心(National Centerfor Biotechnology Information、NCBI)公布的数据库公开。
[0066]上述能够将体细胞诱导为多能干细胞的重编程因子，可以来源于与被导入重编程因子的体细胞同种的生物，也可以来源于与被导入重编程因子的体细胞异种的生物。从提高诱导多能干细胞的建成效率的观点出发，优选来源于同种的生物。
[0067]本领域技术人员可以适当选择将上述能够将体细胞诱导为多能干细胞的重编程因子导入被初始化的体细胞的方法。例如，在上述重编程因子为基因的情况下，可以利用在动物细胞的转染中通常使用的方法进行上述重编程因子向体细胞中的导入。具体而言，作为将上述重编程因子导入体细胞的方法，可以例示:使用载体的方法、磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法、显微注射法等。这些方法中，从导入效率的观点出发，优选使用载体的方法。在使用载体将上述重编程因子导入体细胞的情况下，可以使用病毒载体、非病毒载体、人工病毒等作为载体，从安全性的观点出发，优选使用慢病毒、腺病毒和逆转录病毒等病毒载体。需要说明的是，在使用载体的情况下，上述重编程因子可以是各基因各自整合到不同的载体，也可以是两种以上的基因整合到一个载体。
[0068]上述诱导多能干细胞所来源的体细胞，只要为可诱导出诱导多能干细胞的体细胞，则可以使用所有体细胞。可诱导出诱导多能干细胞的体细胞，在正常和肿瘤性中优选正常的体细胞。
[0069]为了得到上述诱导多能干细胞而使用的细胞，没有特别限制，包括迄今为止已确认可制造iPS细胞的任意细胞(例如成纤维细胞)和今后会报告的任意细胞。从向角膜上皮细胞的分化诱导效率特别高的观点出发，优选使用对来源于眼表上皮的细胞导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而得到的诱导多能干细胞。来源于眼表上皮的细胞例如可以由从角膜缘上皮、角膜上皮或结膜上皮获取的约2mm2左右的组织片得到，但不限定于此。来源于眼表上皮的细胞可以为由如上所述获取的组织片得到的细胞、或者将该细胞适当培养而得到的细胞。
[0070]上述导入有能够向多能干细胞诱导的重编程因子的体细胞，通过进行培养可被诱导为诱导多能干细胞。本领域技术人员可以从广范围适当选择所使用的培养基、培养条件、培养时间。
[0071]在要制造诱导多能干细胞的情况下，本领域技术人员可以利用公知的方法确认已制造出诱导多能干细胞。例如，出于简便的目的，可以利用表达出SSEA3、SSEA4、E-Cadherin、Nanog、0ct3/4、Sox2等胚胎干细胞标记来确认已制造出诱导多能干细胞。
[0072]在上述培养工序中，在基质细胞的存在下或在来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞。
[0073]在基质细胞的存在下进行上述培养的情况下，本领域技术人员可以适当选择其具体的手段。例如在基质细胞存在下的培养，可以为使用基质细胞作为饲养细胞的方法。具体而言，在基质细胞存在下的培养，可以利用在基质细胞于培养容器中达到铺满(confluent)状态的状况下培养多能干细胞的手段来进行。在此，“铺满状态”是指本领域技术人员所公知的、细胞增殖到大致在前表面将培养容器表面覆盖的细胞数的状态。在使用基质细胞作为饲养细胞的情况下，可以根据需要利用丝裂霉素C(MMC)处理、X射线照射等手段对基质细胞进行细胞分裂的失活处理 。
[0074]在能够实现本发明的目的的范围内，本领域技术人员可以适当选择上述基质细胞。在此，基质细胞是指一般包围组织(例如上皮和内皮)或器官的支持细胞。作为上述基质细胞，对于本领域技术人员而言，可以优选利用通过作为SDIA法(专利文献2和非专利文献3)的公知方法而使用的基质细胞，但并不限定于此。
[0075]作为该基质细胞的具体例，可以例示来源于小鼠颅盖的MC3T3-G2/PA6细胞、来源于M-CSF缺陷小鼠颅盖的0P9细胞、和来源于小鼠胎儿的NIH/3T3细胞，但并不限定于此。上述基质细胞可以使用一种或者组合使用两种以上。上述基质细胞优选为来源于小鼠颅盖的MC3T3-G2/PA6细胞。需要说明的是，对于本领域技术人员而言，上述细胞均为公知，并且本领域技术人员可以容易地得到。
[0076]在此，SDIA法是指将胚胎干细胞分化诱导为外胚叶细胞(神经干细胞、神经细胞、神经嵴的细胞或神经管)的方法，是由专利文献2和非专利文献3公开的方法。SDIA法的特征在于在基质细胞的存在下对胚胎干细胞进行，其被认为是用于在胚胎干细胞中抑制向表皮细胞等的分化、而进行向神经细胞等的分化诱导的方法。
[0077]上述在来源于羊膜的因子的存在下的培养，可以按照专利文献4中公开的方法进行。上述在来源于羊膜的因子的存在下的培养，可以通过在羊膜或来源于羊膜的加工物的存在下进行培养来实现，但并不限定于此。上述羊膜或来源于羊膜的加工物与要进行共培养的多能干细胞所来源的生物，可以为相同的生物来源，也为不同的生物来源。本领域技术人员可以基于公知的方法适当获得上述羊膜或来源于羊膜的加工物。
[0078]上述培养可以在基质细胞的存在下或者在来源于羊膜的因子的存在下进行。“存在下的培养”是指只要基质细胞或来源于羊膜的因子与多能干细胞在能够进行物质往来的状态下进行培养，则没有特别制限。即，在基质细胞的存在下进行培养时，可以为基质细胞与多能干细胞能够接触的状态、或者基质细胞与多能干细胞无法接触的状态中的任意一种情况。
[0079]上述培养只要在基质细胞的存在下或者在来源于羊膜的因子的存在下进行，则多能干细胞的状态没有特别限定，可以为凝集状态(团块)或非凝集状态中的任意一种。在多能干细胞为诱导多能干细胞、胚胎干细胞的情况下，优选在凝集状态下进行诱导多能干细胞的培养，但并不限定于此。
[0080]在此，“凝集状态”并不是指利用酶处理等使要被培养的多能干细胞完全形成分散状态，而是在存在细胞之间的粘附的状态(团块状态)下开始培养，并在存在细胞之间的粘附的状态下继续培养。使细胞形成凝集状态的手段对于本领域技术人员而言是公知的，本领域技术人员可以从该公知的手段中进行适当选择。一般而言，多能干细胞的团块状态包含约50~10000左右的多能干细胞，但并不限定于此。需要说明的是，“凝集状态”中包含“胚状体(embryoid bodies) ”。
[0081]在上述培养中，多能干细胞与基质细胞或来源于羊膜的因子的丰度比没有特别限定，本领域技术人员可以适当设定。在基质细胞的存在下进行上述培养的情况下，相对于达到铺满的3.Scm2的基质细胞的层，多能干细胞与基质细胞的丰度比可以优选设定为约I~150团块左右、更优选约15~40团块左右。需要说明的是，3.Scm2是指通常作为培养容器使用的12孔培养容器(十二孔板(12well plate))的每一个孔的面积。
[0082]上述培养在实现向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导的期间进行。培养时间可根据所使用的多能干细胞的种类等而不同，本领域技术人员可以适当设定，没有特别限定。例如，可以培养至在后述的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞中观察到特异性标记基因的表达为止。从实现充分的分化诱导的观点出发，例如优选进行约6周以上、优选约8周以上、特别优选约12周以上的培养。例如可以将培养时间设定为约6~20周左右、优选约8~16周左右、更优选约8~14周左右。
[0083]在本发明的培养 工序中，优选使用无血清培养基。本领域技术人员可以从公知的培养基和今后会新开发的培养基中、能够培养哺乳类的细胞且实质上不含有血清的培养基中适当选择无血清培养基。可以例示例如格拉斯哥极限必需培养基(Glasgow MinimumEssential Medium, G-MEM)、达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco ' sModified Eagle Medium,D-MEM)等作为上述无血清培养基,但并不限定于此。上述无血清培养基中可以含有约5~20%左右、优选约10%左右的敲除血清替代物(Knockout SerumReplacement, KSR、商品名、Invitogen公司);约0.5~5mM左右、优选约2mM左右的L-谷氨酰胺；约0.5~5%左右、优选约I %左右的丙酮酸(丙酮酸钠，Gibco公司)、约0.5~5%左右、优选约I %左右的非必需氨基酸溶液(非必需氨基酸、Gibco公司)；约0~1%左右、优选约0.1%左右的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)等添加物。
[0084]根据常规方法，上述无血清培养基优选定期进行更换。对于本领域技术人员而言，无血清培养基的更换可以利用公知的方法进行。更换无血清培养基时，更换前后所使用的无血清培养基可以使用组成相同的培养基，也可以使用组成不同的培养基。本领域技术人员可以适当设定更换与更换之间的时间、和进行更换的频率。培养基更换优选以约I~3天左右一次、更优选以约2天左右一次的频率进行。在使用基质细胞作为饲养细胞的情况下，通常不更换饲养细胞，但并不限定于此。
[0085]上述无血清培养基优选至少从培养开始至培养开始后约第I~2周左右(例如约第二周左右)之间实质上不含有BMP4。BMP4 (Bone Morphorogenic Protein4 (骨形态发生蛋白4))是公知的蛋白质。在本发明之前，一般认为BMP4具有抑制外胚叶性细胞的神经分化、向上皮细胞(表皮、角膜上皮等)分化诱导的作用。上述无血清培养基特别优选至少在从培养工序开始至I~2周左右实质上不含BMP4。在此，“实质上不含BMP4”是指培养基中的BMP4含量为低于不影响本发明的分化诱导方法的效果的程度的量，只要为该含量，则例如为低于0.5nM、更优选低于0.1nM、进一步优选低于0.05nM，从其他观点出发，优选为不使其有意含有。简便起见，可以使用以不含BMP4的培养基的形式贩卖的市售的培养基试剂、以及将其多种组合而得到的培养基试剂作为实质上不含BMP4的无血清培养基。
[0086]上述无血清培养基可以为实质上不含有视黄酸的培养基，但并不限定于此。
[0087]上述培养可以使用例如上述无血清培养基、以本领域技术人员公知的方法来进行。作为优选的进行培养的方法，可以例示在约37°C左右和约5%左右的二氧化碳浓度的条件下进行培养的方法，但并不限定于此。在上述条件下的培养可以使用例如公知的0)2培养箱来进行。
[0088]这样，可以实现向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法。需要说明的是，由本发明分化诱导出的角膜上皮干细胞也可以包含角膜上皮前体细胞。
[0089]可以利用对本领域技术人员而言公知的手段来验证分化诱导出了角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞。作为用于进行上述验证的具体方法，可以列举例如:定期(例如每两周)地获取上述培养中的细胞的一部分，利用定量RT-PCR法检测标记基因(例如眼组织特异性表达的pax6基因、分化后的角膜上皮特异性表达的K12(角蛋白12)基因)等)的表达。此时，可以将能够确认到标记基因的表达作为分化诱导出了角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的指标。
[0090]2.制诰方法
[0091]本发明的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的制造方法包括下述工序:
[0092](I)培养多能干细胞的工序、和
[0093](2)从所述培养的细胞中选择角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的工序。
[0094]以下详述本发明的制造方法。
[0095]工序(I)的培养多能干细胞的工序，为上述“1.分化诱导方法”栏中记载的培养多能干细胞的工序。即在基质细胞的存在下或在来源于羊膜的因子的存在下培养多能性肝细胞的工序。关于工序(I)，例如，对于培养的多能干细胞，可以继续至角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞中表达特异性标记为止。
[0096]接着，在工序⑵中，从工序⑴中培养的细胞(细胞团)中选择角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞。本领域技术人员可以适当设定选择角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的手段。
[0097]例如选择角膜上皮干细胞时，作为选择手段的一种方式，可以列举从工序⑴中培养的细胞(细胞团)中选择自我增殖能力和/或角膜上皮干细胞特异性标记的表达作为指标。更具体而言，可以通过进行如下工序来选择角膜上皮干细胞:选择具有自我增殖能力的细胞的工序、和选择表达角膜上皮干细胞特异性标记的细胞的工序，但并不限定于此。需要说明的是，选择具有自我增殖能力的细胞的工序、和选择表达角膜上皮干细胞特异性标记的细胞的工序所进行的顺序没有限定，先进行任意一道工序都能够选择出角膜上皮干细胞。
[0098] 对于细胞具有增殖能力的评价，本领域技术人员可以通过公知的方法进行。例如，可以通过将细胞接种至培养体系中进行继代培养使细胞增殖来确认，但不限定于此。可以通过在继代培养中形成菌落来确认细胞增殖。可以优选用于确认形成菌落的继代培养在与饲养细胞(例如NIH/3T3细胞等)的共培养体系下进行、或者在用于上皮干细胞的培养基中进行，但并不限定于此。
[0099]用于进行上述继代培养的培养基，只要为能够培养角膜上皮干细胞的培养基(例如本领域技术人员公知的keratinocyte-conditioned medium(角质形成细胞条件培养基)(KCM培养基)、keratinocyte serum-free medium(角质形成细胞无血清培养基)(KSFM培养基、能够从Invitrogen公司等购入)、CnT_20培养基(CELLnTEC公司)、CnT_50培养基(CELLnTEC公司)等)，则没有特别限定。
[0100]在上述继代培养中，例如在使用十二孔板的情况下，再接种密度优选设定为2000~16000细胞/孔左右。
[0101]上述增殖能力优选为自我复制能力。对于细胞具有自我增殖能力的的评价,例如能够以细胞具有增殖能力、并且增殖后的细胞所具有的特性不随继代培养而改变为指标，但并不限定于此。对于增殖后的细胞所具有的特性，可以优选利用后述角膜上皮干细胞标记来确认，但并不限定于此。
[0102]对于细胞表达角膜上皮干细胞特异性标记的评价，可以利用本领域技术人员公知的方法进行。作为角膜上皮干细胞标记，可以例示例如:作为复层上皮干细胞(和前体细胞)的特异性标记的K14(角蛋白14)蛋白和/或p63蛋白和/或N-cadherin蛋白等,但并不限定于此。另外，也可以检测眼组织特异性标记(例如pax6蛋白)和/或角膜上皮特异性分化标记(例如K12(角蛋白12)蛋白)。另外，也可以在检测出角膜上皮特异性分化标记(K12)后，检测在角膜上皮干细胞中特异性表达的细胞表面标记(例如Integrin alpha6、N-cadherin 等)。
[0103]已表达出角膜上皮干细胞标记的具体的检测方法是公知的，例如优选基于免疫细胞化学的检测。更详细而言，可以例示:基于使用抗体染色法的显微镜观察的检测、利用细胞分选仪(流式细胞仪)的细胞表面标记的检测等。或者可以在要进行分化诱导的多能干细胞中导入上述角膜上皮干细胞标记的报告基因(例如将编码角膜上皮干细胞标记的基因的启动子区域、和绿色荧光蛋白(GFP)等荧光蛋白连接而得到的报告基因)，并在分化诱导后检测报告基因的表达。
[0104]另外，在选择角膜上皮细胞的情况下，可以列举选择表达角膜上皮细胞标记的细胞的工序。作为角膜上皮细胞标记，可以列举:眼组织特异性标记(例如pax6蛋白)、角膜上皮特异性分化标记(例如K12(角蛋白12)蛋白质)等，但并不限定于此。作为检测角膜上皮细胞标记的表达的手段，可以例示例如:在要进行分化诱导的多能干细胞中导入上述角膜上皮细胞标记的报告基因(例如将编码角膜上皮干细胞标记的基因的启动子区域、和绿色荧光蛋白(GFP)等荧光蛋白连接而得到的报告基因)，并在分化诱导后检测报告基因的表达。
[0105]在选择角膜上皮干细胞的情况下，作为上述工序(2)的具体方式，可以例示下述(a)和(b)的方式，但并不限定于此:[0106](a)在工序(I)的分化诱导后，确认表达角膜上皮干细胞标记的细胞，然后利用酶处理等回收细胞，并将其再接种到能够选择性培养角膜上皮干细胞的体系(例如以NIH/3T3细胞作为饲养细胞的共培养体系等)中，以菌落形成为指标选择增殖的细胞，由此来纯化角膜上皮干细胞。
[0107](b)在工序(I)的分化诱导后，确认表达角膜上皮特异性标记的细胞，然后使用细胞分选仪等选择表达在角膜上皮干细胞中特异性表达的细胞表面标记的细胞，由此来纯化角膜上皮干细胞。[0108]这样，可制造出角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞。需要说明的是，利用本发明的制造方法得到的角膜上皮干细胞也包括角膜上皮前体细胞。
[0109]3.角膜上皮细胞片
[0110]本发明的角膜上皮细胞片是来源于通过上述“2.制造方法”栏中记载的方法得到的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的角膜上皮细胞片。上述角膜上皮细胞片可以是角膜上皮细胞片的复层化片。
[0111]对于角膜上皮细胞片的制造手段，本领域技术人员可以从公知的方法和今后开发的方法中进行适当选择。可以使用例如专利文献3或4、或非专利文献I或2等中公开的下述方法。
[0112]作为角膜上皮细胞片的制造手段的具体例，没有特别限定，可以列举包括下述工序的手段:在饲养细胞的存在下、在温度感应性培养皿或载体上培养上述角膜上皮干细胞的工序，和回收通过所述工序得到的细胞片的工序。
[0113]作为上述培养工序中使用的饲养细胞，可以使用例如经丝裂霉素C(MMC)处理后的NIH/3T3细胞，但并不限定于此。
[0114]上述培养工序中使用的温度感应性培养皿，只要是能够通过改变温度(优选降低)将细胞片剥离的培养皿，则没有特别限定。具体而言，可以例示包覆有聚(N-异丙基丙烯酰胺)等温度感应性高分子的培养皿。简便起见，也可以使用市售的温度感应性培养皿。
[0115]作为上述载体，可以例示:胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白(优选胶原蛋白)等细胞外基质，但并不限定于此。
[0116]本领域技术人员可以适当设定进行上述培养工序的条件。可以在例如约37°C左右和约5%左右的二氧化碳浓度的条件下进行培养，但并不限定于此。培养时间可以设定为约2周左右。
[0117]关于上述回收，在温度感应性培养皿上进行培养的情况下，可以通过降低温度、将形成的细胞片从温度感应性培养皿上剥离来进行。在载体上进行培养的情况下，可以将形成的片与载体一起回收。
[0118]上述角膜上皮细胞片可以优选用于史-约综合征、眼类天疱疮、碱腐蚀等难治性眼病的治疗等。
[0119]4.可有效地分化为角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞的诱导多能干细胞
[0120]通过对来源于眼表上皮的细胞导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而得到的诱导多能干细胞，与在成纤维细胞等中导入重编程因子而得到的诱导多能干细胞相比，可以更快、更高效地分化诱导为角膜上皮细胞和/或角膜上皮细胞，因此是有益的。
[0121]上述来源于眼表上皮的细胞可使用前述“1.分化诱导方法”栏中记载的来源于眼表上皮的细胞。具体而言，可以例示例如:可以由从角膜缘上皮、角膜上皮或结膜上皮获取的约2mm2左右的组织片得到的、来源于眼表上皮的细胞，但不限定于此。来源于眼表上皮的细胞可以为由如上所述获取的组织片得到的细胞、或者将该细胞适当培养而得到的细胞。
[0122]上述能够向多能干细胞诱导的重编程因子，可以优选使用前述“1.分化诱导方法”栏中记载的能够向多能干细胞诱导的重编程因子。另外，将该能够向多能干细胞诱导的重编程因子导入来源于眼表上皮的细胞的手段，也可以优选使用前述“1.分化诱导方法”栏中记载的导入细胞的手段。
[0123]如后述的实施例所示，本发明的诱导多能干细胞具有分化诱导为角膜上皮干细胞的高取向性。在此，作为“分化诱导为角膜上皮干细胞的高取向性”，可以使用例如作为角膜上皮特异性标记的角蛋白12(K12)的表达取向性。在分化诱导为角膜上皮干细胞的高取向性为K12的表达取向性的情况下，在分化诱导开始后的早期阶段就高表达K12。因此，本发明的诱导多能干细胞可以优选在向角膜上皮干细胞的分化诱导中使用。
[0124]5.细朐材料
[0125]如前所述，本发明的诱导多能干细胞具有分化诱导为角膜上皮干细胞的高取向性。因此，本发明也提供包括前述“4.诱导多能干细胞”栏中记载的诱导多能干细胞在内的、用于向角膜上皮干细胞分化诱导的细胞材料。
[0126]上述细胞材料可以优选在向角膜上皮干细胞的分化诱导及其制造中使用。另外，所得到的角膜上皮细胞可以进一步在角膜上皮细胞片的制造中使用、作为药物开发工具使用等，但不限定于此。
[0127]实施例
[0128]以下基于实施例`等详细说明本发明，但本发明并不限定于此。
[0129](I)来源于眼表皮细胞的iPS细胞的制造
[0130]从用于研究的输入巩角膜片上摘除来源于人的角膜内皮细胞、周边的结合组织等，在此基础上，通过分散处理仅分离出眼表的角结膜上皮层。通过胰蛋白酶处理将所得到的上皮细胞制成单细胞，并在NIH/3T3细胞的培养上清与新鲜KCM培养基的1:1混合培养基中进行培养。
[0131]接着，在增殖后的来源于眼表的上皮细胞中感染分别搭载有人0ct3/4、SoX2、Klf4和c-Myc(山中四因子)的慢病毒载体。在感染后的2~4天后，将细胞再接种至iPS细胞的培养体系(iPS培养基中的MEF饲养细胞上)，培养约3~6周。确认外因性山中四因子的消失，利用SSE4抗体选出阳性菌落，建成iPS细胞株(B31、B34、B41、C51和D43 ;共5株)。建成的iPS细胞株和已有的iPS细胞株253G1的相位差显微镜图像如图1 (a)所示。本次建成的任意一种人iPS细胞株均与公知的来源于成纤维细胞的人iPS细胞株同样地在MEF饲养细胞上形成多能干细胞所特有的鹅卵石状的菌落。
[0132]对于所制造的iPS细胞株之一的B41株，利用免疫染色验证作为ES细胞标记的E-cadherin(H-108兔子多克隆抗体、SantaCruz公司、50倍稀释)、Nanog(R&D公司、山羊多克隆抗体、100倍稀释)、0ct3/4 (R&D公司、山羊多克隆抗体、100倍稀释)和Sox2 (245610、小鼠单克隆抗体、R&D公司、100倍稀释)的表达。二抗使用与各一抗的物种相对应的Alexa568抗体(Invitrogen公司、200倍稀释)。最后利用Hoechest33342将核染色。免疫染色图像如图1(b)所示。可以确认，所制造的iPS细胞表达了四种ES细胞标记即E-cadherin、Nanog、Oct3/4和Sox2中的任意一种。即，可以认为，正常地进行了向iPS细胞的诱导。
[0133]然后，按照常规方法验证所制造的四株iPS细胞(B34、B41、C51和D43)的核型。核型分析的结果如图2(a)所示。可以确认，所验证的四株人iPS细胞中的每一株，在其50个细胞中的50个细胞的核型均为46，XX[20]，具有正常的人的核型。
[0134]然后，利用常规方法对所得到的iPS细胞进行畸胎瘤形成试验。结果如图2(b)所示。在畸胎瘤中，可以确认外胚叶(视网膜色素上皮、表皮和神经)、中胚叶和内胚叶。
[0135](II)向角膜上皮细胞和角膜上皮干细胞的分化诱导
[0136]以MC3T3-G2/PA6细胞(PA6细胞)为饲养细胞，对上述⑴中制造的iPS细胞(B41株)、和公知的来源于人成纤维细胞的253G1株和201B7株进行培养。
[0137](I)使用下述培养基并在MEF (mouse embryonic fibroblast (小鼠胚胎成纤维细胞))饲养细胞上分别对上述三种人iPS细胞进行继代培养。
[0138]用于人iPS的培养基
[0139]
【权利要求】
1.一种多能干细胞向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导方法，其中，包括在基质细胞或来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞的工序。
2.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，所述培养在无血清培养基中进行。
3.根据权利要求2所述的分化诱导方法，其中，所述无血清培养基至少在从培养开始至培养开始后I~2周之间实质上不含BMP4。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的分化诱导方法，其中，所述多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
5.根据权利要求4所述的分化诱导方法，其中，所述诱导多能干细胞为通过在来源于眼表上皮的细胞中导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而得到的诱导多能干细胞。
6.一种包括下述工序的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的制造方法: (1)在基质细胞或来源于羊膜的因子的存在下培养多能干细胞的工序、和 (2)从所述培养的细胞中选择角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的工序。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，所述选择角膜上皮干细胞的工序为选择具有增殖能力且表达角膜上皮干细胞特异性标记的细胞的工序。
8.一种角膜上皮细胞片，其来源于利用权利要求6或7所述的制造方法而得到的角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞。
9.一种诱导多能干细胞，其通过对来源于眼表上皮的细胞导入能够向多能干细胞诱导的重编程因子而得到。
10.根据权利要求9所述的诱导多能干细胞，其用于向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞的分化诱导。
11.一种用于向角膜上皮干细胞和/或角膜上皮细胞分化诱导的细胞材料，其含有权利要求9或10所述的诱导多能干细胞。
【文档编号】C12N5/0735GK103492555SQ201280019381
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月20日
【发明者】林龙平, 西田幸二 申请人:国立大学法人大阪大学