序列特异性工程改造的核糖核酸酶h和用于确定dna-rna杂交物结合蛋白序列偏好的方法
【专利摘要】本发明的主题为切割DNA-RNA杂交物中RNA链的核糖核酸酶，其中核糖核酸酶包括含有RNA酶HI(RNA酶HI)的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交结合结构域的融合蛋白，并且其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。本发明还涉及用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好的新方法，并允许确定经DNA-RNA杂交物中序列特异性结合蛋白识别的序列。
【专利说明】序列特异性工程改造的核糖核酸酶H和用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白序列偏好的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及序列特异性核糖核酸酶H，其包含工程改造的核糖核酸酶HI (RNA酶HI)结构域与锌指结构域的融合物。本发明可应用于遗传学。作用于DNA-RNA杂交物的序列特异性核糖核酸酶可用于任何应用，其中DNA-RNA杂交物中RNA链的切割可例如在核酸、特别是带有特定序列的DNA-RNA杂交物的体外操作中进行。除体外用途之外，以序列特异性方式切割DNA-RNA杂交物的酶还可发现在某些RNA病毒感染(例如致癌病毒、逆转录病毒、乙型肝炎、流行性感冒)的治疗中的用途，所述RNA病毒通过在RNA模板上瞬时形成DNA链来复制，或者切割在体内形成的其他DNA-RNA杂交物。
[0002]本发明还涉及用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好的方法并借此确定经DNA-RNA杂交物结合蛋白识别的序列。在此范围内的本发明可应用于遗传学。用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的序列偏好的方法可应用于确定与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合的任何蛋白质或其结构域的序列偏好，并借此确定经DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域识别的序列。所述方法可补充地用于这类蛋白质的任何特异性工程改造技术。序列特异性DNA-RNA杂交物结合蛋白可用于某些RNA病毒(例如致癌病毒、逆转录病毒、乙型肝炎、流行性感冒)的诊断，所述RNA病毒通过将RNA模板转换形成DNA链来复制。这样的结构域还可应用于蛋白质工程以获得具有新特异性的酶，例如DNA-RNA结合蛋白与酶促结构域(例如核酸酶、RNA修饰酶或DNA修饰酶等)的融合物。
【背景技术】 [0003]在特定位置切割核酸常用于许多基因工程技术。有许多断裂DNA分子的方法，包括广泛使用的市购可得的限制性酶。已知的RNA加工酶不多并且其大多数表征为低序列特异性或完全缺失序列特异性。
[0004]WO 2010076939 Al描述了使用嵌合的锌指核酸酶实施定向遗传重组或突变的组合物和方法。WO 03087341 A2描述了使用锌指核酸酶定向编辑人囊性纤维化跨膜传导调节因子基因，从而提供用于囊性纤维化的潜在疗法。WO 2009146179 Al描述了高效且易于实施的模块化装配方法的开发，其使用公开可得的锌指制备能够修饰人细胞中数个基因组位点的 DNA 序列的锌指核酸酶。WO 2010076939 AUffO 03087341 A2 或 WO 2009146179 Al都未描述或表明RNA酶HI或其部分与锌指、特别是与ZfQQR的融合物的用途，特别是它们也未公开或表明DNA-RNA杂交物的定向切割的可能性或者通过任何蛋白质对DNA-RNA杂交物的任何类型的定向切割的可能性。从说明书W02007014181A2和W02007014182A2中已知利于定向基因组编辑的许多锌指结构域与FokI核酸酶的融合物。然而，与前者情况不同，仅天然蛋白质(RNA酶HI和锌指)的融合物不产生序列特异性酶。
[0005]用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好并借此确定经DNA-RNA杂交物结合蛋白识别的序列的方法为SELEX程序的改进。SELEX代表通过指数富集的配体系统进化。此方法的原理是基于从很大差异的核酸序列文库中反复筛选和富集对配体表现出高亲和力的分子。富集步骤通过将核酸与配体结合并去除未结合的序列来完成。此方法目前用于获得以高特异性结合配体的RNA和DNA适体(Ellington, A.D.，Szostak,J.ff., 1990.Nature 346, 818 - 822; Huizenga DE, Szostak Jff.1995.Biochemistry34(2):656-65),用于确定DNA或RNA结合蛋白的序列偏好(Blackwell TK & Weintraub H.1990.Science 250:1104-1110)，但从未用于与DNA-RNA杂交物结合的蛋白质。用于已知的SELEX改进的所述寡核苷酸文库由单链寡核苷酸(RNA、ssDNA、修饰的RNA或修饰的ssDNA、PNA)或者双链DNA (dsDNA)组成，但未表征DNA-RNA杂交物文库的用途。
[0006]WO 2010076939 Al描述了使用嵌合的锌指核酸酶实施定向遗传重组或突变的组合物和方法。WO 03087341 A2描述了使用锌指核酸酶定向编辑人囊性纤维化跨膜传导调节因子基因，从而提供用于囊性纤维化的潜在疗法。WO 2009146179 Al描述了高效且易于实施的模块化装配方法的开发，其使用公开可得的锌指制备能够修饰人细胞中数个基因组位点的DNA序列的锌指核酸酶。前述出版物均未描述SELEX法在确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的底物偏好中的用途或者锌指在结合DNA-RNA杂交物中的特异性序列中的用途或者特别是ZfQQR在用于该目的中的用途。
[0007]Herskovitz Μ.A.等，Mol Microbiol.2000 Dec: 38 (5): 1027-33，“Endoribonuclease RNAase III is essential in Bacillus subtilis (在枯草芽抱杆菌{Bacillus subtilis)中内切核糖核酸酶RNA酶III为必需的)。”描述了一种菌株的生长，其中Bs-RNA酶III (rncS)表达依赖于rncS自温度敏感型质粒的转录以及在非许可温度下导致90-95%细胞死亡，并且事实上幸存的全部细胞均保留了 rncS表达质粒。因此，作者推断rncS在枯草芽抱杆菌{B.subtilis)中为必需的。Dasgupta S.等,Mol Microbiol.1998; 28 (3): 629-40, “Genetic uncoupling of the dsRNA-binding and RNA cleavageactivities of the Escherichia coli endoribonuclease RNAase III—the effect ofdsRNA binding on gene expression (大肠杆菌 iBscherichia coli)内切核糖核酸酶RNA酶III的dsRNA结合活性和RNA切割活性的遗传解偶联——dsRNA结合对基因表达的影响)。”描述了在rnc中携带点突变的细菌表型，所述基因编码RNA酶III。Karen Shahbabian等，The EMBO Journal (2009) 28, 3523-3533， “ RNAase Y, a novel endoribonuclease,initiates riboswitch turnover in Bacillus subtilis (一种新型内切核糖核酸酶RNA酶Y在枯草芽孢杆菌中启动核糖开关转换)”描述了鉴定为新型内切核糖核酸酶的早期功能未知的必需蛋白质YmdA(现在称为RNA酶Y)，其能够在体外优先切割在SAM结合适体结构域上游的5’-单磷酸化yitj核糖开关。Herskovitz Μ.A.等、Dasgupta S.等或KarenShahbabian等均未提及或表明SELEX法在确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的底物偏好中的用途或与DNA-RNA杂交物结合的锌指或者获得DNA-RNA杂交物的任何方法。
[0008]US 2006057590描述了基本上涵盖基因的全部转录区的双链RNA分子的产生以及使用RNA内切核酸酶切割此分子以生成小RNA分子,所述小RNA分子已标记或可随后标记。JP54059392专利描述了一种新型核酸酶B-1，其攻击双链脱氧核糖核酸的一条DNA链的单链断裂区，并在其互补区特异地裂解另一条DNA链。US 2006057590和JP54059392未提及SELEX法在确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的底物偏好中的用途或者锌指在与DNA-RNA杂交物的特异性序列结合中的用途或者特别是ZfQQR在用于所述目的中的用途。
[0009]因此，需要在特定位置切割DNA-RNA杂交物的RNA链的核糖核酸酶。还需要新的改进方法来确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的底物偏好或者锌指在与DNA-RNA杂交物的特异性序列结合中的用途或者特别是ZfQQR在用于所述目的中的用途。
[0010]发明的公开内容
根据所述的现有技术，本发明的目标为克服所指出的缺点并提供在特定位置切割DNA-RNA杂交物的RNA链的核糖核酸酶。因此本发明目标为提供基于RNA酶HI的催化结构域和锌指结构域的组合的识别DNA-RNA杂交物中序列的工程改造的酶，并获得仅切割DNA-RNA杂交物的RNA链的序列特异性酶。
[0011]本发明下一目标为提供用于获得含有随机序列的DNA-RNA杂交物文库的新型改进方法及其在确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的序列偏好(优选用于锌指结合、更优选用于ZfQQR结合的DNA-RNA杂交物的序列偏好)中的用途。所述方法可有效用于筛选DNA-RNA杂交物文库。本发明的下一目标为提供获得DNA-RNA杂交物文库的新型改进方法。
[0012]本发明人意想不到地发现，在特定位置切割DNA-RNA杂交物的RNA链的序列特异性工程改造的核糖核酸酶H可通过将RNA酶HI的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交物结合结构域融合来获得，其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。
[0013]在第一方面，本发明提供切割DNA-RNA杂交物中RNA链的核糖核酸酶，其中所述核糖核酸酶为包含RNA酶HI的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交物结合结构域的融合蛋白，并且其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。优选的核糖核酸酶为包含缺失RNA酶HI杂交物结合结构域的RNA酶HI的催化结构域的衍生物，优选RNA酶HI的催化结构域来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus,更优选包含由SEQ ID No:1所示raM基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。在核糖核酸酶中，优选的RNA酶HI催化结构域在底物结合区包含一个氨基酸的至少一个取代，所述取代选自:K81A、K89E和K123A，以及优选包含全部取代K81A、K89E和K123A。
[0014]在优选的核糖核酸酶中，锌指结构域为锌指ZfQQR的衍生物，优选为由SEQ IDN0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。所述核糖核酸酶优选包含如SEQID N0.4所示的融合蛋白catAEA-ZfQQR。所述核糖核酸酶优选包含如SEQ ID N0.6所示的融合蛋白GQ。所述核糖核酸酶还优选包含如SEQ ID N0.8所示的融合蛋白GGKKQ。
[0015]在下一方面，本发明提供包含本发明的核糖核酸酶的组合物。
[0016]本发明还涉及本发明的核糖核酸酶或本发明的组合物在切割DNA-RNA杂交物的RNA链中的用途。在所述用途上，DNA-RNA杂交物中RNA链的优选切割位于远离锌指结合位点的2-16个核苷酸、优选5-7个核苷酸。
[0017]本发明还提供获得工程改造的RNA酶HI的方法，所述酶切割DNA-RNA杂交物中的RNA链，其包括以下步骤:
a)优选通过去除结合结构域和/或取代涉及底物结合的氨基酸，获得不结合底物但保留催化活性的RNA酶HI催化结构域；
b)通过制备融合蛋白获得工程改造的RNA酶HI，所述融合蛋白包含在步骤a)中获得的RNA酶HI催化结构域与能够结合DNA-RNA杂交物中特异性序列的结合结构域(优选锌指DNA-RNA杂交物结合结构域)。在获得工程改造的RNA酶HI的优选方法中，锌指结构域为锌指ZfQQR的衍生物，优选为由SEQ ID N0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。在所述方法中，RNA酶HI的催化结构域优选来自耐盐芽孢杆菌(β_ halodurans),优选包含由SEQ ID No:1所示rnM基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。RNA酶HI的催化结构域优选包含在底物结合区上的改变，所述改变优选选自至少一个氨基酸的取代、缺失和/或插入。
[0018]本发明切割DNA-RNA杂交物的RNA链的核糖核酸酶，包含RNA酶HI或其衍生物和DNA-RNA杂交物结合锌指的融合物，其中RNA酶HI来自耐盐芽孢杆菌以及锌指能够与杂交物DNA-RNA中的特异性序列结合。优选本发明的核糖核酸酶表征为来自耐盐芽孢杆菌的RNA酶HI的衍生物、催化结构域多肽，甚至更优选包含由SEQ ID No:l所示raM基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。同样优选的是，本发明的核糖核酸酶表征为天然RNA酶HI的衍生物，其包含DNA-RNA杂交物结合结构域的缺失。优选本发明的核糖核酸酶表征为催化结构域衍生的RNA酶HI，其在底物结合区包含氨基酸取代:K81A、K89E和K123A。最优选本发明的核糖核酸酶表征为由SEQ ID No:1所示raM基因的第175-588位核苷酸编码的多肽和其为锌指ZfQQR衍生物的锌指结构域的融合物，所述锌指结构域优选为由SEQ ID N0.2所示锌指ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。
[0019]序列特异性核糖核酸酶H可用于核酸的特异性和定位断裂以用于RNA质谱分析，包括用于研究RNA的修饰。本发明可用来产生用于第三代测序的RNA片段。序列特异性工程改造的RNA酶H可用于探测或绘制带有特异性序列的病毒RNA，其中使单链RNA与DNA退火，并切割所得杂交物。本发明可通过改组片段和mRNA的连接而用于蛋白质工程，其中片段通过使用特异性工程改造的核糖核酸酶H消化获得。本发明可用于指导体内持久性DNA-RNA杂交物的位点特异性切割。
[0020]具有新特征的酶可通过构建具有不同功能性的数个结构域的融合物来获得。以序列依赖性方式切割DNA-RNA杂交物中RNA链的核糖核酸酶的工程改造基于以下两个蛋白质结构域的融合物:工程改造的RNA酶HI和DNA-RNA杂交物结合锌指。来自耐盐芽孢杆菌的RNA酶HI为以非序列依赖性方式水解DNA-RNA杂交物中RNA链的酶。锌指ZfQQR能够与DNA-RNA杂交物中明确确定的序列结合。在融合酶的一个实施方案中，表现出针对DNA-RNA杂交物中RNA链的核糖核酸酶活性的结构域为来自耐盐芽孢杆菌的基因片段(称为cat)，其编码催化结构域。其为raM基因第175-588位核苷酸的片段，对应于来自耐盐芽孢杆菌的天然蛋白质RNA酶HI的第59-196位氨基酸残基的区域。从所述天然基因中去除编码杂交物结合结构域(HBD)的片段，因其能够不依赖序列地结合DNA-RNA杂交物。催化结构域与ZfQQR的融合物称为cat-ZfQQR。工程改造的催化结构域具有在底物结合区引入的三个氨基酸取代:K81A、K89E和K123A。所述取代涉及带正电的赖氨酸，其定位靠近已知的底物结合区。并非意图结合位点中的取代使酶失活，而是意图导致酶的底物结合依赖于另外的DNA-RNA杂交物结合结构域的存在。赋予融合酶的序列特异性的结构域为锌指ZfQQR。在融合酶中，使用编码锌指ZfQQR的第19-303位核苷酸的基因片段，其对应于蛋白质的第7-101位氨基酸残基的区域。此外，对融合酶的域间接头区修饰以产生两个变体，称为GQ和GGKKQ0 GQ为具有在K81A、K89E和K123A的取代的催化结构域与ZfQQR的融合物，其缺少编码融合酶的第138-148位氨基酸的片段。GGKKQ为具有在K81A、K89E和K123A的取代的催化结构域与ZfQQR的融合物，其缺少编码融合酶的第138-139位和141-146位氨基酸的片段。产生的构建体的描述在表1中概括。[0021]轰i构建体的描述、其进一步使用和用于实施例中的缩写及其对SEQ ID NO的引用。
【权利要求】
1.一种核糖核酸酶，所述核糖核酸酶切割DNA-RNA杂交物中的RNA链，其中核糖核酸酶为包含核糖核酸酶HI (RNA酶HI)的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交物结合结构域的融合蛋白，并且其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结八口 ο
2.权利要求1的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化结构域的衍生物包含RNA酶HI杂交物结合结构域的缺失。
3.权利要求1或2的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化结构域优选来自耐盐芽孢杆菌{Bacillus,优选包含由SEQ ID No:1所不ιτ?Α基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。
4.权利要求3的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化结构域在底物结合区包含一个氨基酸的至少一个取代，所述取代选自:Κ81Α、Κ89Ε和Κ123Α，以及优选包含全部取代Κ81Α、Κ89Ε 和 Κ123Α。
5.权利要求1-4的核糖核酸酶，其中所述锌指结构域为锌指ZfQQR的衍生物，优选为由SEQ ID N0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。
6.权利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQID Νο.4所示的融合蛋白catAEA-ZfQQR。
7.权利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQID N0.6所示的融合蛋白GQ。
8.权利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQID N0.8所示的融合蛋白GGKKQ。
9.一种组合物,所述组合物包含权利要求1-8的核糖核酸酶。
10.权利要求1-8的核糖核酸酶或权利要求9的组合物在切割DNA-RNA杂交物的RNA链中的用途。
11.权利要求10的用途，其中DNA-RNA杂交物中RNA链的切割位于远离锌指结合位点的2-16个核苷酸,优选5-7个核苷酸。
12.—种获得工程改造的RNA酶HI变体的方法，所述变体切割DNA-RNA杂交物中的RNA链，所述方法包括以下步骤: a)优选通过去除结合结构域和/或涉及底物结合的氨基酸的取代，获得不结合底物但保留催化活性的RNA酶HI催化结构域； b)通过制备融合蛋白获得工程改造的RNA酶HI，所述融合蛋白包含在步骤a)中获得的RNA酶HI催化结构域与能够结合DNA-RNA杂交物中特异性序列的结合结构域，所述结合结构域优选锌指DNA-RNA杂交物结合结构域。
13.权利要求12的方法，其中所述锌指结构域为锌指ZfQQR的衍生物，优选为由SEQIDN0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的多肽。
14.权利要求12-13的方法，其中所述RNA酶HI的催化结构域优选来自耐盐芽孢杆菌，优选包含由SEQ ID No:1所示rnM基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。
15.权利要求12-14的方法，其中所述RNA酶HI的催化结构域包含在底物结合区的改变，所述改变优选选自至少一个氨基酸残基的取代、缺失或插入。
16.一种确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: a)使纯化的蛋白质或其结构域与DNA-RNA杂交物底物文库的混合物接触，其中DNA-RNA杂交物底物包含在中心部位的随机序列、优选在9或10个核苷酸位置的随机序列，所述随机序列具有固定的侧翼序列并允许测试的蛋白质或其结构域与对其具有亲和力的序列结合； b)通过将带有结合的DNA-RNA杂交物的蛋白质或其结构域固定到树脂、优选谷胱甘肽琼脂糖，分离未结合的DNA-RNA杂交物； c)去除未结合的杂交物； d)优选通过加入含有谷胱甘肽的缓冲液，分离重组蛋白连同所缔合的DNA-RNA杂交物； e)利用PCR、优选RT-PCR扩增分离的杂交物，其中在扩增反应中使用与位于随机区域侧翼的不变序列互补的引物，并且其中在PCR反应期间，将RNA聚合酶启动子的序列加入到引物之一上以获得用于以RNA聚合物体外转录的双链DNA ； f)使用不具有RNA酶H活性的逆转录酶和与RNA模板的3’末端互补的DNA引物进行逆转录以获得DNA-RNA杂交物，并优选重复步骤a) -f)。
17.权利要求16的方法，其中所述启动子序列包含T7RNA聚合酶的启动子序列并且RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
18.权利要求16或17的方法，其中所述蛋白质或其结构域为重组蛋白或重组结构域。
19.权利要求16-18的方法，其中所述蛋白质或其结构域包含锌指。
20.权利要求16-19的方法，其中所述蛋白质或其结构域为锌指结构域和谷胱甘肽S-转移酶结构域(GST)的融合物，优选为由SEQ ID No: 37编码的锌指结构域和GST的融合物。
21.权利要求16-20的方法，其中所述蛋白质或其结构域为RNA酶HI或衍生物和锌指的融合物，优选RNA酶HI来自耐盐芽孢杆菌，优选包含由SEQ ID No:1所示rnAA基因的第175-588位核苷酸编码的多肽。
22.权利要求16-19和21的方法，其中所述锌指能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。
23.权利要求16-22的方法，其中所述锌指为ZfQQR，优选具有由SEQID N0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸编码的序列。
24.获得DNA-RNA杂交物文库的方法，所述方法包括以下步骤: a)DNA寡核苷酸文库的PCR扩增，所述寡核苷酸包含在中心位置的简并序列，所述简并序列的侧翼为包含RNA聚合酶启动子序列的不变序列， b)使用RNA聚合酶以在a)中获得的双链DNA用作模板合成RNA链， c)使用不具有核糖核酸酶H活性的逆转录酶，将与存在于b)中所得RNA的3’末端的不变序列互补的引物逆转录，其中RNA链在逆转录期间未降解，并且获得由互补的RNA和DNA链组成的杂交物核酸分子。
25.权利要求24的方法，其中寡核苷酸包含在中心位置的简并序列，所述中心位置包括随机的9或10个核苷酸位置。
26.权利要求24或25的方法，其中所述启动子序列包含T7RNA聚合酶的启动子序列并且RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
【文档编号】C12N9/22GK103764820SQ201280027647
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2011年6月8日
【发明者】J.M.布尼基, A.A.苏勒, K.J.斯科罗内克, M.诺沃特尼 申请人:国际生物分子和细胞研究所