用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法
【专利摘要】同化的C和N很大程度地影响植物生长和农作物产量。之前的尝试企图用一个或两个基因改变植物的碳和氮状态。本发明涉及三个基因的同时共同过表达，其中一个基因(PECPase)有效地捕获CO2，而另外两个编码参与氮同化的酶(Asp?AT和GS)。组合的效果为植物的碳和氮状态以及生产力的增加。
【专利说明】用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法
[0001]以下的说明书说具体地描述了本发明及其实施方式。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于增强植物的碳(C)、氮(N)、生物量和产量的表达构建体。
[0003]另外，本发明提供了通过使用前述的表达构建体增强C和N水平并随之改进植物的生物量和产量的方法，所述构建体利用源自酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下称为“PEPCase”)，谷氨酰胺合成酶(以下称为“GS”)和天冬氨酸氨基转移酶(以下称为“AspAT”))之基因的共同过表达(co-overexpression)。特别地,本发明涉及编码所述蛋白的核酸序列在植物细胞中表达的转基因植物。
[0004]更特别地，本发明涉及用实现在组成型启动子控制下的三个基因的共同过表达的遗传构建体转化植物，所述三个基因中一个基因PEPCase编码负责捕获CO2的酶，而另外两个编码参与N同化的酶(AspAT和GS)，其中N同化所需要的C骨架由PEPCase满足，其包括用AspAT+GS+PEPCase基因转化的植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和此基因在植物中的表达，从而提高植物的C和N状态以及生物量和产量。
[0005]发明背景和现有技术
[0006]本发明涉及具有三个基因(即AspAT、GS和PEPCase)的共同过表达从而导致C、N含量、生物量和产量组分提高的经转化植物。PEPC酶(EC.4.1.1.31)是在植物中普遍存在的酶，在HC03_和Mg2+的存在下催化磷酸烯醇丙酮酸(以下称为“PEP”)的β-羧化，得到草酰乙酸(oxaloacetate)(以下称为“0ΑΑ”)和无机磷酸盐(inorganic phosphate)(以下称为“Pi”)，它主要具有为三羧酸循环补充中间体的回补作用。在高等植物中，有具有不同器官特异性的几个PEPC酶同种型，他们参与多种功能，包括气孔开放、果实成熟和种子成熟。C4和CAM植物的叶含有高水平的PEPC酶，其催化光合作用的初始CO2固定。在C3植物的叶中观察到低得多的PEPC酶水平，其有助于回补功能并在细胞pH调节中发挥作用。
[0007]GS(EC6.3.1.2)催化氨(以下称为“NH3”)与谷氨酸(以下成为“Glu”)的ATP依赖性缩合产生谷氨酰胺(以下成为“Gin”)。随后，谷氨酸合酶(GOGAT)转移Gln的酰胺基到α-酮戊二酸以产生两个分子的Glu。Gln和Glu 二者是蛋白质、核酸和叶绿素的有机N的主要来源。
[0008]AspAT (EC2.6.1.1)催化天冬氨酸(以下称为“Asp”)的氨基到α -酮戊二酸以形成OAA和Glu的可逆转移。在植物中，已提出AspAT发挥几种代谢作用，包括:在根部同化NH3+的过程中回收C骨架，提供酰胺前体用于主要的氮转运分子(例如天冬酰胺(以下称为“Asn”)和酰基脲)的生物合成，在种子填充(filling)期间募集Asn氮以及参与C4植物中的细胞内C穿梭，提供用于Asp家族氨基酸的生物合成的前体。
[0009]在生物量产生、产量或收获指数方面，植物的表现依赖于多个内部和环境因素。在这些因素中，植物的C和 N水平是控制植物生产力的重要因子之一。越来越多的C和N同化的细节表明，调控系统响应于代谢和环境这两种因素来协调这些营养物质的摄取和分布。植物感受到其C和N状态的变化并传递该信息给细胞核，在细胞核带来中基因表达的改变。由于植物生长和农作物产量很大程度地受C和N同化的影响，过去已经进行了很多尝试来改造有效的C和N同化。然而还没有报告显示出植物中C、N状态、生物量及产量的显著改进。
[0010]表1举例说明对于在不同植物中提高C和/或N及生物量的多种策略方面可获得的信息状态
[0011]表1
[0012]
【权利要求】
1.SEQ ID N0.7所示的用于AspAT、GS和PEPCase基因之共表达的表达构建体，其包含与至少一个控制序列和转录终止子序列相连的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，其中SEQ ID NO:1示出AspAT基因，SEQ ID NO:2示出GS基因以及SEQID NO:3示出PEPCase基因，所述表达构建体可用于使植物相对于野生型或未转化植物具有提高的碳、氮、生物量和产量。
2.权利要求1所述的表达构建体，其中所述控制序列如SEQID N0.4所示，所述转录终止子序列如SEQ ID N0.5所示。
3.权利要求1所述的表达构建体，其中所述控制序列是选自以下的组成型启动子:CaMV35S启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子。
4.权利要求1所述的表达构建体，其中所使用的终止子优选选自Nos终止子和CaMV3' UTR。
5.权利要求1所述的表达构建体，其中具有所述SEQID N0.7的多核苷酸在植物中过表达。
6.用于制备权利要求1所述的表达构建体的方法，其中所述方法包括以下步骤: i)使用SEQID NO:10和SEQ ID NO:11所示引物扩增编码SEQ ID NO:1所示基因的cDNA序列，使用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示引物扩增编码SEQ ID NO:2所示基因的cDNA序列，以及使用SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13所示引物扩增编码SEQ ID N0:3所示基因的cDNA序列； ii)将在步骤Q)中获得的SEQID NO:1、2和3的扩增产物独立地克隆入pGEM_T easy载体中；· iii)将来自步骤(ii)中获得之阳性克隆的质粒独立地与PCAMBIA1302—起消化，以及进一步将消化的基因产物与PCAMBIA1302连接并转化入大肠杆菌(E.coli)DH5a细胞中； iv)对来自步骤(iii)中获得之阳性菌落的质粒进行测序，确认AspAT::pCAMBIA1302 ；GS::pCAMBIA1302 和 PEPCase::pCAMBIA1302 的框内克隆；
V)使用 SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO: 15 以及 SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18所示引物扩增步骤(iv)中获得的产物； vi)对扩增的GS编码序列再次独立地进行克隆、消化、连接和测序以形成GS+pCAMBIA1302，将其进一步被消化并与扩增的AspAT编码序列之阳性克隆的质粒连接以形成 AspAT+GS+pCAMBIA1302 表达盒； vii)将扩增的PEPCase编码序列之阳性克隆的经消化质粒与目的pCAMBIA1302连接，所述目的PCAMBIA1302预先克隆有步骤(vi)中获得的所述AspAT+GS+表达盒，以使得AspA, GS和PEPCase基因被独立的CaMV35S启动子和Nos转录终止子控制，以形成SEQ IDNO:7所示的单个植物表达构建体AspAT+GS+PECPase。
7.使用权利要求1中所述的表达构建体提高植物的碳、氮、生物量和产量的方法，其中所述方法包括以下步骤: a)用权利要求1所述的表达构建体转化根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefacians)菌株; b)用步骤(a)中获得的重组根瘤农杆菌菌株转化外植体；c)选择步骤(b)的经转化外植体以获得期望的经转化植物，其相对于野生型植物具有提高的植物碳、氮、生物量和产量水平。
8.权利要求7所述的方法，其中所述经转化植物选自拟南芥、番茄、马铃薯、烟草、玉米、小麦、稻、棉花、芥菜、木豆、豇豆、豌豆、甘蔗、大豆和高粱。
9.权利要求7所述的方法，其中所述经转化植物相对于野生型表现出约45%至50%的PEPC酶活性增加，至少55%的GS活性增加和55%至60%的AspAT活性增加，从而使得所述植物中碳和氮水平增加。
10.权利要求7所述的方法，其中所述经转化植物相对于野生型表现出由种子产量和/或荚果产量增加所表明的产量和/或生物量增加。
11.权利要求7所述的方法，其中所述经转化植物表现出提高的生长特性，所述提高的生长特性的特征在于与野生型或未转化植物相比嫩枝鲜重、嫩枝干重、根鲜重和根干重增加。
【文档编号】C12N15/82GK103597081SQ201280027891
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月19日
【发明者】阿尼什·卡奇拉, 苏伦德·库马尔·瓦茨, 帕拉姆维尔·辛格·阿胡贾, 桑贾伊·库马尔 申请人:科学与工业研究会