利用与转移相关的多基因标签来确定肝细胞癌的预后的方法
【专利摘要】在Twist1-和MYC-诱导的肝细胞癌(HCC)的条件式转基因小鼠模型中，单独的MYC表达导致未能转移的肿瘤，而Twist1与MYC的共表达则导致与至淋巴结、脾、腹膜和肺的肝外转移相关的肿瘤。Twist1还引起循环肿瘤细胞的显著的增加。Twist1和MYC的组合失活导致如由大体病理学和微观病理学、X-射线计算机断层扫描和生物发光成像所显示的原发性肿瘤和转移性肿瘤两者的持续消退，以及循环肿瘤细胞的抑制。通过基因组分析鉴定出包括17个上调基因和3个下调基因的20-基因标签（signature），所述20-基因标签高度预测患有HCC的人患者中的转移和总存活。本发明的另一个方面包括确定患者的肝细胞癌的转移状态的方法，所述方法包括从来自患有肝细胞癌的受试者的癌样品获得第一差异基因表达谱以及创建概述通过所述第一基因表达分析获得的标准化数据并包括肝癌的转移状态的确定的报告。
【专利说明】利用与转移相关的多基因标签来确定肝细胞癌的预后的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求题为“AMETHOD OF DETERMINING THE PROGNOSIS OF HEPATOCELLULARCARCINOMAS USING A MULTIGENE SIGNATURE ASSOCIATED WITH METASTASIS” 且于 2011 年7月12日提交的美国临时专利申请序列号61/506，763的优先权，在此通过引用将该申请整体并入。
[0003]关于由美国政府提供的资金的声明
[0004]本发明根据由美国政府的美国国立卫生研究院授予的NIH基金号:CA89305和CA10510，在政府支持下完成。政府在本发明中具有某些权益。
【技术领域】
[0005]本公开一般涉及预测肝细胞癌的结果的基因标签(gene signature),并涉及鉴定基因标签的预测成员的方法。本公开还涉及鉴定与转移性肝细胞癌的消退(regression)相关的靶基因。
[0006]背景
[0007]肝细胞癌(HCC)是主要的全球性癌症健康问题(Jemal等人，(2010) CACancerJ.Clin.60:277-300 ； Altekruse 等人，J.Clin.0ncol.27:1485-1491)。因为其通常在广泛分布的局部侵入和/或远端转移之后被诊断，HCC具有很差的预后(Sherman，M.(2008)New Engl.J.Med.359:2045-2047 ；Tang, Z.Y.(2001) World J.Gastroenterol.7:445-454) ?HCC的鉴定机制和/或预测侵入的方法将具有实质性的临床重要性(Bruix&Sherman (2005)Hepatology42:1208-1236) ? 先前的报道已鉴定了与 HCC 中(Coulouarn 等人，(2009)0ncogene28, 3526-3536 ;Cou1uarn 等人，(2008) Hepatology47:2059-2067 ；Kapos1-Novak等人，(2006) J.Cl in.1nvest.116:1582-1595 ;Roessler 等人，Cancer Res.70，10202-10212 ；Ye 等人，(2003) Nat.Med.9:416-423)以及其他癌症类型中(Barrier等人，(2006) J.Clin.0ne.24:4685-4691 ；Bos 等人，(2009)Nature459:1005-1009 ；Bueno-de-Mesquita 等人，(2007) Lancet Oncol.8:1079-1087 ;Kang 等人，(2003) CancerCell3:537-549 ;Paik 等人，(2004)New Engl.J.Med.351:2817-2826 ;Salazar 等人，(2011)J.Clin.0ncol.29:17-24 ;Wan 等人，(2005)PLoS 0ne5, el2222)的转移和侵入相关的基因标签。Twistl表达与多种肿瘤类型，包括人HCC2-8中的转移相关(Zhu等人，(2008)J.Huazhong Univ.Sc1.Technolog.Med.Sc1.28:144-146)。
[0008]Twistl是与上皮间质转化(EMT)相关的碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族的成员，所述上皮间质转化是这样一个过程，上皮细胞通过所述过程转分化成更具侵入性的表型。在人HCC中，Twistl表达与疾病和不良预后的晚期临床阶段相关(Lee等人，(2006)Clin.Cancer Res.12:5369-5376 ；Niu 等人，(2007) J.Exp.Clin.Cancer Res.26:385-394 ；Sun 等人，Hepatology51:545-556 ;Yang 等人,(2009) Hepatology50:1464-1474 ;Ye 等人,(2003)Nat.Med.9:416-423)，并显示引起体外源自肿瘤的细胞系中的增加的侵入(Lee等人，(2006) Cl in.Cancer Res.12:5369-5376 ;Matsuo 等人，(2009) BMC Cancer9:240 ；Sun等人，Hepatology51:545-556 ；Yang 等人，(2009) Hepatology50:1464-1474 ；Zhao 等人，J.Cell Mo 1.Med.15:691-700)。然而，Twistl在侵入和转化中的因果作用还有待在任何自生肿瘤模型中被体内证明。
[0009]概述[0010]Twistl的表达与癌症侵入和转移相关，但对于自生肿瘤的因果作用还有待确立。已产生了 Twistl-和MYC-诱导的肝细胞癌(HCC)的条件式转基因小鼠模型。单独的MYC表达导致未能转移的肿瘤，而Twistl与MYC的共表达则导致与至淋巴结、脾、腹膜和肺的肝外转移相关的肿瘤。Twistl还造成循环肿瘤细胞中的显著增加。Twistl和MYC的组合失活导致了如由大体病理学(gross pathology)和微观病理学、X_射线计算机断层扫描和生物发光成像所显示的原发性肿瘤和转移性肿瘤二者的持续消退，以及循环肿瘤细胞的抑制。基因表达谱显示，HCC的小鼠模型具有人类疾病的代表性。通过基因组分析鉴定了包括17个上调基因和3个下调基因的20-基因标签，所述20-基因标签高度预测患有HCC的人患者中的转移和总存活。
[0011]本公开的一个方面包括用于对患者中的肝细胞癌预后的基因标签的实施方案，其中来自基因标签的差异基因表达预测患有转移性肝细胞癌的患者的存活，且其中基因标签包括选自由以下组成的组的多个基因:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和gstm6。
[0012]在本公开该方面的实施方案中，基因标签可基本上由以下基因组成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
[0013]在本公开该方面的实施方案中，基因标签可由以下基因组成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
[0014]在本公开该方面的实施方案中，基因标签可由以下基因组成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
[0015]本公开的另一个方面包括确定患者的肝细胞癌的转移状态的方法的实施方案，该方法包括:从来自患有肝细胞癌的受试者的癌样品获得第一差异基因表达谱，其中第一差异基因表达谱可包括选自由以下组成的组的多个基因的表达信息的数据集:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6 ;和创建概述通过所述第一基因表达分析获得的标准化数据的报告，其中该报告可包括肝癌的转移状态的确定。
[0016]在本公开该方面的实施方案中，患者的肝细胞癌的转移状态可提供患者中的癌的发展的预后。
[0017]在本公开该方面的实施方案中，第一基因标签可基本上由以下基因组成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。[0018]在本公开该方面的实施方案中，第一基因标签可由以下基因组成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
[0019]在本公开该方面的实施方案中，第一基因标签可由以下基因组成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
[0020]在本公开该方面的实施方案中，方法可包括以下步骤:(i)从怀疑患有转移性肝细胞癌的患者获得第一生物样品；(ii)从该生物样品中分离RNA ;及(iii)确定第一基因标签的表达的差异水平。
[0021]在本公开该方面的实施方案中，第一基因标签可包括基因:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、Ip1、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6,其中如果当与非转移性组织中的水平相比时,基因标签的基因 hbegf > aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、Ipl、pygb、map3k6 的表达的差异水平提高且基因 acp2、cyp4v2 和 gstm6的表达的差异水平降低，则所述水平表明癌的转移，从而提供患者中的癌的发展的预后。
[0022]在本公开该方面的实施方案中，方法可包括以下步骤:从未患有肝细胞癌或怀疑未患有发展的转移性肝细胞癌的受试者获得第二生物样品，从该生物样品中分离RNA ;确定包括基因 hbegf> aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、Ipl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6 的第二基因标签的差异表达的水平；比较第一和第二基因标签的表达的差异水平，其中来自第一和第二基因标签的表达的相对差异水平指示怀疑患有转移性肝细胞癌的患者中的转移性肝细胞癌细胞的存在或不存在；和创建概述通过所述基因表达分析获得的标准化数据的报告，其中所述报告包括患有肝细胞癌的患者的长期存活的可能性的预测。
[0023]在本公开该方面的实施方案中，第一和第二生物样品来自相同的患者，从而指示患者中的肝细胞癌的进展。`
[0024]在本公开该方面的实施方案中，方法可包括确定基因标签的基因的表达的差异水平的步骤，包括从第一和第二生物样品中分离RNA ;以及检测源自基因标签的基因的RNA的水平。
[0025]本公开的又另一个方面包括引起动物或人受试者中的肝细胞癌的消退的方法的实施方案，所述方法包括降低Twistl基因的表达水平或其产物的量，从而降低癌的转移水平。
[0026]附图简述
[0027]当结合附图查阅以下描述的本公开的多种实施方案的详细描述时，将更容易领会本公开的方面。在以下描述和实施例中更加详细地描述了这些图。
[0028]图1A-1E说明Twistl促进MYC-诱导的HCC的转移。
[0029]图1A示意性说明用于产生在肝细胞中共表达鼠(murine)Twistl、人c-MYC和萤火虫萤光素酶(Luc)的转基因小鼠的Tet系统。通过当从供水中去除多西环素(Dox)时的转基因活化诱导成年动物中的肝细胞癌(HCC)。
[0030]图1B是说明Twistl与MYC协作来诱导52%的动物中的具有多个靶器官的肝外HCC转移的图(η=21 ;ρ〈0.001)。单独的MYC并未诱导HCC转移(η=30)。
[0031]图1C显示了说明小鼠的大体解剖学的一系列数字图像，显示MYC/Twistl动物(n=21)中至淋巴结、脾和腹膜(38%,p<0.001)以及肺(29%,p<0.001)的转移，且单独的MYC诱导未转移的HCC，而单独的Twistl (n=15)对肝重或组织学不具有可识别的作用。
[0032]图1D显示了说明MYC的免疫组织化学(IHC)的一系列数字图像，其显示在原发性位点和转移性位点的转基因表达，表明转移源自MYC-诱导的原发性肿瘤。
[0033]图1E显示了说明免疫组织化学的一系列数字图像，其显示E-钙粘蛋白和β_连环蛋白以与正常肝脏可比较的水平表达并定位于MYC/Twistl原发性和转移性HCC中的细胞周围，表明上皮粘附连接(epithelial adherens junction)的保持。MYC HCC显示异质的及非定域化(delocalized)的E-1丐粘蛋白和β_连环蛋白。
[0034]图2A-2D说明当Twistl和MYC失活时转移性HCC的消退。
[0035]图2Α显示了说明在疾病进展过程中MYC/Twistl小鼠中的丰富的循环肿瘤细胞(CTC)的图。萤火虫萤光素酶(FLuc)的表达在肿瘤发作期间显著增加(p=0.04)，并然后当MYC/Twistl失活时明显下降(p=0.0121)(在将Dox重新引回至供水之后)。
[0036]图2B显示了说明转 基因MYC(hMYC)表达的图，其用于评价CTC的发生率(prevalence),且其显示在疾病发作期间的增加(p=0.0335)及在MYC/Twistl失活后的显著降低(0=0.0159)。
[0037]图2C显示了在HCC进展期间X-射线计算机断层扫描(微型CT)的一系列数字图像。在肿瘤发作期间，检测到肺转移和肝脏大小的增加。当MYC/Twistl失活时，肺转移不再是可检测的，且肝脏缩回至肿瘤前的大小(pre-tumor size)。
[0038]图2D显示了用于移植的MYC/TwistlHCC细胞以研究休眠肿瘤细胞在转基因失活时是否存留的生物发光成像(BLI)的一系列数字图像。当MYC/Twistl失活时肿瘤消退并停止发光。MYC和Twistl的再活化引起发光肿瘤的快速再度出现，表明休眠肿瘤细胞在转基因失活后存留。
[0039]图3-6C说明了用于人HCC患者中的临床结果的预测是有用的MYC/Twistl原发性肿瘤对转移性肿瘤的基因表达分析。
[0040]图3是来自个体样品的重要基因的基因聚类(gene clustering)的图示(AN0VA,p〈0.05 ;>2 倍表达)。正常=正常肝脏，n=2 ；MYC HCC=MYC-诱导的 HCC，n=2 ；MYC/Twi st 1HCC=MYC/Twi st 1HCC, n=6 ；MYC/Twistl MET=MYC/Twistl 转移，n=8。
[0041]图4是说明基因在MYC/TwistlHCC和MYC/TwistlMET中表达的一系列图，其显示来自两个人MYC-相关的HCC数据集的基因集的强的富集(strong enrichment)。利用从比较每种肿瘤类型与正常肝脏建立的基因列表(非配对t-检验，p〈0.05)，进行GSEA分析以比较鼠HCC表达与人HCC以及转移基因数据集。
[0042]图5示意性说明显示每一种肿瘤类型之间不同的、或重叠的基因标签的肿瘤类型的比较(非配对t-检验，p〈0.05 ;与正常相比>2倍的改变)。
[0043]图6A和6B是说明图5中显示的标签被分为上调(_UP)基因或下调(_D0WN)基因并被用于在人HCC定群中执行存活分析的一对图，其中基因表达与临床结果相关。MYC/TwistlHCC+MET_UP基因与HCC患者中的差的总存活相关(GSE1898 ；KapIan-Meier左侧曲线，对数秩检验，p=0.002)。该发现在独立的人HCC定群中得到证实，其显示MYC/TwistlHCC+MET_UP匹配(aligning)患者的类似的不良预后(GSE14520 ；KapIan-Meier曲线右侧，对数秩检验，P=0.0001)。
[0044]图6C是利用MYC/TwistlHCC+MET_UP标签，基于原发性肿瘤转移分开HCC患者组的图解箱线图(GSE364 ;非配对t-检验，p〈0.00001)。
[0045]图7和图8A-8C说明了小鼠和人基因表达的比较分析，其鉴定了对人HCC侵入和存活高度预后的17-基因标签。
[0046]图7显示了小鼠MYC/Twist 1HCC+MET_UP标签和5个现有的人HCC转移标签的汇编(人HCC总转移标签)之间的基因比较的维恩图(Venn diagram)，其揭示了在小鼠和人HCC转移标签之间重叠的17个上调基因。
[0047]图8A和8B是说明17-基因标签是人HCC患者中的差的总存活的预后的一对图(GSE364 ；KapIan-Meier左侧曲线；对数秩检验，p=0.004)。该发现在人HCC患者的独立的数据集中得到证实，其显示了与17基因标签匹配的患者(patients aligning withthel7Gene Signature)的类似的不良预后(GSE14520 ;Kaplan_Meier右侧曲线；对数秩检验，p=0.0012)。
[0048]图SC是利用17-基因标签，基于转移的存在显示人HCC定群的分层(stratification)的图解箱线图(GSE364)(平均值的 t_ 检验，p〈0.00001)。
[0049]图9A和图9B说明Twistl在人HCC中表达。
[0050]图9A是显示在来自患者的8个正常肝脏样品和40个癌症样品上执行的qRT_PCR的结果的图。人HCC的子集具有升高的Twistl表达。Twistl的表达跨所有40个人HCC样品是可变的，其中一些显示低于`正常肝中的表达谱的表达，且一些显示高于正常肝中的表达谱的表达。
[0051]图9B是说明图9A的表达数据被分组到组织类型的图解箱线图。
[0052]图10是说明Twistl促进MYC-诱导的HCC的转移但是当单独表达时不影响肝脏组织学的一系列数字图像。正常肝脏对过表达Twistl的肝脏的H&E未显示组织的组织学中的显著差异。MYC HCC主要显示了分化不良的腺样组织学。MYC/Twistl原发性HCC显示了类似于MYC HCC的腺样组织学以及小梁组织学。MYC/Twi st IHCC转移至肺和淋巴结(LN)并分别显示小梁和固体(solid)组织学。所有转移在组织学上被确定为HCC起源的。
[0053]图11是显示Twistl增加MYC-诱导的HCC的存活的图。显示了关于MYC小鼠、MYC/Twi st I小鼠和Twistl小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。MYC小鼠(n=30)以13.2周的中值时间死于HCC。MYC/Twi st I小鼠(n=30)以19.1周的中值时间死于HCC(p〈0.0001，对数秩检验)。Twistl小鼠(n=15)从未死于疾病并直至转基因活化之后的18个月都是健康的。
[0054]图12-16显示Twistl增加了鼠和人HCC细胞系的迁移、侵入和转移。
[0055]图12是显示转导的细胞表达高水平的TWISTl蛋白的免疫印迹的数字图像。Twistl通过逆转录病毒转导到人Huh7细胞系或源自LAP-tTA/TRE-MYC(MYC)小鼠的鼠HCC细胞系中。
[0056]图13是为了显示Twistl增加鼠和人HCC细胞的迁移潜能而执行的划痕伤口愈合试验的数字图像。
[0057]图14是显示transwell胶原侵入试验的图,其中Twistl的表达显著地增加了体外鼠和人HCC细胞的侵入(对于每一种细胞系，p〈0.01)。
[0058]图15是显示当腹膜内注射至免疫功能低下的(immunocompromised) SCID小鼠中时，MYC HCC (n=4)和由Twistl转导的MYC HCC(n=4)两者是致瘤的一系列数字图像。仅MYC/TwistlHCC呈现了转移的迹象，其中4只小鼠中的2只显示肾上的致瘤生长。
[0059]图16是显示将由载体(n=4)或Twistl (n=4)转导的人HCC细胞系Huh7静脉注射到SCID小鼠中以检查转移性生长的一系列数字图像。表达Twistl的细胞显示在4只小鼠中的3只中的转移性肺生长，而由载体转导的Huh7注射的动物则未显示肺转移的迹象。
[0060]图17A-17C显示了说明EMT标志物在MYC/Twistl转移性病灶中被最高表达的图。
[0061]图17A是显示与通过qRT-PCR检查的EMT相关的多种间质标志物的图。将MYC/Twistl原发性和转移性HCC与MYC HCC比较。MMP2显示了 MYC/Twistl原发性HCC的大幅度增加，尽管相对于MYC或MYC/Twistl原发性HCC，转移中的Fspl、FoxC2和MMP9是增加的。将所有值都显示为相对于正常肝脏对照的倍数变化。
[0062]图17B是显示上皮标志物的分析的图，说明了与MYC HCC相比，MYC/Twistl中的细胞角蛋白8和18(Ck8、Ckl8)、血小板亲和蛋白-2(plakophilin-2) (Plako2)和连接蛋白32 (Cx32)的表达仅些许(modest)下降。这四个标志物与闭合蛋白(Occludin)(Occ) —起显示了 MYC/Twistl转移中的显著较低的表达。
[0063]图17C是显示先前涉及的EMT的诱导物的图。Zebl显示了 MYC和MYC/Twistl原发性HCC之间的最大增加，且SIPl显示了转移的增加。Snaill在样品之间基本上是未改变的。相对于MYC HCC，Snail2/Slug显示在MYC/Twist HCC和转移中的下降的表达。
[0064]图18和19说明Twistl增加了循环肿瘤细胞(CTC)的发生。
[0065]图18是说明通过qRT-PCR分析收集自MYC/Twistl小鼠的外周血的CTC标志物萤火虫萤光素酶(FLuc)的箱线图，显示与正常对照相比的162倍增加及与MYC小鼠相比的19倍增加(p=0.0428)。将表达针对泛素标准化，跨多个样品平均，并相对于野生型小鼠设定。
[0066]图19是说明与MYC小鼠相比，MYC/Twistl小鼠显示转基因人MYC(hMYC)表达的2156倍增加(p=0.0007)的箱线图。
[0067]图20说明对最佳鼠HCC模型标签和最佳总体鼠和人的比较标签的人HCC Z-分数存活分析的一对GSEA预排序(pre-rank)富集图。富集图图解显示了来自MYC/TwistlHCC+MET (最佳鼠模型标签)和17-基因标签(鼠HCC和人HCC之间的最佳重叠标签)的基因在人HCC数据库内、在正的Z-分数范围内如何被富集。正的Z-分数谱中的富集显示这些基因与患者的不良预后相关。这还反映在分别为1.751和1.743的MYC/Twist 1HCC+MET和17-基因标签的累积NES0两个标签经P-值(分别为ρ〈0.00001和ρ=0.006)和FDR值(分别为q=0.014和q=0.012)均达到统计显著性。
[0068]图2IA和2IB说明了独立的人HCC定群证实了源自小鼠肿瘤的标签与差的存活相关。
[0069]图21A是显示MYC/TwistlHCC+MET基因标签预后人HCC患者中差的总体存活的图(GSE364 ；KapIan-Meier左侧曲线)；在该特定的人HCC定群中，存活比较未达到统计显著性(对数秩检测，P=0.12)。
[0070]图21B是显示17-基因标签预后人HCC患者中差的总体存活的图(GSE1898 ;Kaplan-Meier右侧曲线)；在该特定的人HCC定群中，存活比较未达到统计显著性(对数秩检测，p=0.16)。
[0071]图22显示了小鼠MYC/TwistlHCC+MET_DOWN标签和现有的人HCC转移标签的汇编(人HCC下调转移标签)之间的基因比较的维恩图，其显示在小鼠和人HCC转移标签之间重叠的3个下调基因。
[0072]图23显示了小鼠MYC/TwistlHCC+总标签和现有的人HCC转移标签的汇编(人HCC总转移标签)之间的基因比较的维恩图，其显示在小鼠和人HCC转移标签之间重叠的20个
差异调苄基因。
[0073]图24A显示了说明20-基因标签预后人HCC患者中的差的总存活的一对图(GSE364 ;Kaplan-Meier左侧曲线；对数秩检验，p=0.004)。该发现在人HCC患者的独立的数据集中得到证实，其显示了关于与20基因标签匹配的患者的类似的不良预后(GSE14520;Kaplan-Meier右侧曲线；对数秩检验，P=0.0012)。
[0074]图24B是利显示用20-基因标签，基于转移的存在对人HCC定群的分层的图解箱线图(GSE364)(平均值的t检验，p〈0.00001)。
[0075]图25是说明鉴定预后人肝细胞癌的结果的基因标签的图示。
[0076]图26A和26B说明HCC转移需要MYC和Twistl两者的表达。
[0077]图26A是显示产生源自小鼠Twistl/MYC HCC的细胞系并由组成型MYC或Twistl通过逆转录病毒转导该细胞系并将该细胞系静脉(IV)注射到免疫功能低下的SCID小鼠中的图示。
[0078]图26B是显示当MYC和Twistl被表达时HCC细胞的静脉注射导致肺转移的形成的一系列数字图像。
[0079]在更加详细地描述本公开之前，应理解本公开不限于所描述的特定实施方案，且如此本公开当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，而不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅被所附的权利要求限制。
[0080]公开的描述
[0081]在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确指明，在该范围的上限值和下限值之间的至下限单位的十分之一的每一个中间值以及在所规定的范围中的任何其他的规定值或中间值都包括在本公开内。这些较小范围的上限值和下限值可以独立地被包含在较小范围中并且也可以被包括在本公开内，在所规定的范围中经受任何特定排除的限值。在所规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些包括的限值中的一个或两个的范围也包含在本公开中。
[0082]除非另外界定，否则本文所使用的所有的技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。虽然与本文描述的方法和材料相似的或等同的任何方法和材料也可被用于本公开的实践或测试，现在描述优选的方法和材料。
[0083]本说明书中引用的所有的出版物和专利如同每一种单独的出版物或专利通过引用被并入所具体地且单独地指示的通过引用被并入本文，且该所有的出版物和专利通过引用被并入本文来公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是由于其公开在提交日期之前且不应解释为承认凭借在先公开本公开无权先于此出版物。此外，提供的出版物的日期可以不同于可能需要单独证实的实际出版日期。
[0084]如将对本领域的技术人员明显的， 当阅读本公开内容时，本文描述和阐明的每一个单独的实施方案中具有分立的(discrete)组分和特征,这些特征可以容易地与其他若干实施方案的任一个的特征分开或结合，而并不偏离本公开的范围或精神。可以按照所列举的事件的顺序或逻辑上可行的任何其他顺序来实施任何所列举的方法。
[0085]除非另外指明，否则本公开的实施方案将采用为本领域的技术内的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药物学技术，等等的技术。此类技术在文献中被充分解释。
[0086]必须注意到的是，如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非在上下文中另外明确指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数指代对象。因此，例如提及“支撑物(support)”包括多个支撑物。除非相反的意图是明显的，否则在本说明书中和在下面的权利要求中，将作出提及应被定义为具有以下含义的一些术语。
[0087]如本文所用的，除非另外规定，否则以下术语具有赋予它们的含义。在本公开中，“包括(comprise) ”、“包括(comprising) ”、“包含(containing) ” 和“具有(having)，，及类似术语可具有在美国专利法中赋予它们的含义并可以指“包括(includes) ”、“包括(including)”及类似的术语；当应用于本公开包括的方法和组合物时，“基本上由…组成(consisiting essentially of)”或“基本上包括(consisits essentially) ” 或类似的术语是指如本文公开的那些组合物的组合物，但其可包含另外的结构基团、组成组分或方法步骤(或如以上讨论的其类似物或衍生物)。然而，与本文公开的对应组合物或方法的基本特征和新颖特征相比，此类另外的结构基团、组成组分或方法步骤等不会实质性影响组合物或方法的基本特征和新颖特征。当应用于本公开包括的方法和组合物时，“基本上由…组成”或“基本上包括”或类似的术语具有在美国专利法中赋予的含义，且该术语是开放式的，允许超出所列举的那些的存在，只要所列举的那些的基本特征或新颖特征未被超出所列举的那些的存在改变，但排除现有技术实施方案。
[0088]在描述多种实施 方案之前，提供以下定义且除非另外指明，应使用以下定义。
[0089]定义
[0090]在描述和要求所公开的主题中，将根据以下阐述的定义使用以下术语。
[0091]如本文所用的，术语“基因”指包括对产生多肽或前体必需的控制序列和编码序列的核酸序列。多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分来编码。基因可整体或部分源自本领域已知的任何来源，包括植物、真菌、动物、细菌基因组或附加体(印i some )、真核的、细胞核的或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成的DNA。基因可在编码区或非翻译区中包含一个或多个修饰，该一个或多个修饰可影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或表达控制的方式。此类修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和取代。基因可构成不间断的编码序列或其可包括由适当的剪接点界定的一个或多个内含子。
[0092]术语“基因表达”指核酸序列通过该过程经受成功的转录和翻译如此以致可检测水平的核苷酸序列被表达的过程。
[0093]如本文所用的，术语“基因标签(gene signature)”指由特定细胞或组织类型表达的一组基因，其中基因一同存在、且特别地、此类基因的差异表达指示/预测某些病症。
[0094]如本文所用的， 术语“阵列”和“微阵列”指通过寡核苷酸在阵列上展示的基因的类型，且其中在阵列上展示的基因的类型取决于阵列的预期目的(例如，监测人基因的表达)。在给定阵列上的寡核苷酸可对应于相同类型、类别或组的基因。如果基因共享某些共同的特征诸如起源物种(例如，人、小鼠、大鼠)；疾病状态(例如，癌症)；相同的生物学过程(例如，凋亡、信号转导、细胞周期调控、增殖、分化)，该基因则被认为是相同类型的。例如，一个阵列类型可以是“癌症阵列”，其中阵列寡核苷酸各自对应于与癌症相关的基因。
[0095]如本文所用的，术语“差异表达的”或“差异表达”指生物标志物的表达水平的差异，其可通过测量生物标志物的产物的表达水平分析，诸如，生物标志物的信使RNA转录表达的或蛋白表达的水平的差异。在优选的实施方案中，该差异是统计显著的。术语“表达水平的差异”指与对照中的给定生物标志物的可测量的表达水平相比，通过样品中信使RNA转录的量和/或蛋白的量测量的给定生物标志物的可测量的表达水平的增加或减少。在一个实施方案中，可利用给定的一个生物标志物或多个生物标志物的表达水平与对照的给定的一个生物标志物或多个生物标志物的表达水平相比的比来比较差异表达，其中比不等于1.0。例如，如果第一样品中的表达水平与第二样品相比的比大于或小于1.0，则RNA或蛋白是差异表达的。例如，大于1、1.2,1.5,1.7、2、3、3、5、10、15、20或更大的比，或者小于1、0.8,0.6,0.4,0.2,0.1,0.05,0.001或更小的比。在另一个实施方案中，利用P-值测量差异表达。例如，当利用P-值时，当P-值小于0.1、优选地小于0.05、更优选地小于0.01、甚至更优选地小于0.005、最优选地小于0.001时,生物标志物被鉴定为在第一样品和第二样品之间是差异表达的。
[0096]术语“可检测的”指RNA表达模式通过本领域技术人员熟知的聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶-(RT)PCR、差异显示及Northern分析的标准技术是可检测的。术语“生物样品”指获自生物体(例如，人患者)或获自生物体的部分(例如，细胞)的样品。样品可以是任何生物组织或流体的样品。样品可以是“临床样品”，其是源自患者的样品。此类样品包括但不限于唾液、 血液、血细胞(例如，白细胞)、羊水、血浆、精液、骨髓以及组织或细针活检样品、尿、腹膜液，及胸膜液，或来自其的细胞。生物样品还可包括组织的切片，诸如为组织学目的而截取的冷冻切片。生物样品还可以被称为“患者样品”。
[0097]该方法用于鉴定和证实表明肝细胞癌癌症是否已转移的本发明的基因表达谱。用于鉴定基因和/或蛋白表达谱的其他方法是已知的；这些可选的方法中的任一个也可被使用。
[0098]本方法可利用测试，其中在一个追踪中，鉴定了与正常(非癌)组织样品相比的过量/低水平表达的那些基因。可采用阳性和阴性对照以标准化结果，包括消除在来自相同患者的正常组织中也是差异表达的那些基因和蛋白，及确认感兴趣的癌症特有的基因表达
-1'TfeP曰。
[0099]根据良好确立的方法，基于总RNA，可从生物样品产生基因表达谱(GEP)。简言之，典型的方法包括从生物样品分离总RNA、扩增RNA、合成cDNA、用可检测标记物标记cDNA、使cDNA与基因组阵列诸如AFFYMETRIX U133GENECHIP.RTM.杂交、以及通过测量来自与阵列结合的可检测标记物的信号强度确定标记的cDNA与基因组阵列的结合。
[0100]可利用市售可得的或定制的探针或寡核苷酸阵列诸如cDNA或寡核苷酸阵列分析组织样品中的mRNA。这些阵列的使用允许同时测量成千上万个基因的稳定状态的mRNA水平，从而展示了用于鉴定诸如不受控制的细胞增殖的发作、抑制(arrest)或调节的效果的有力的工具。阵列上的探针与来自细胞的感兴趣的核酸的杂交和/或结合可通过检测和/或测量接收自标记的探针的信号的位置和强度被确定，或阵列上的探针与来自细胞的感兴趣的核酸的杂交和/或结合可被用于检测来自样品的与微阵列上已知位置的核酸序列杂交的DNA/RNA序列。信号的强度与样品组织中存在的cDNA或mRNA的数量成比例。许多阵列和技术是可用的并且有用的。用于确定样品组织中的基因和/或蛋白表达的方法在例如美国专利号 6，271，002,6, 218，122,6, 218，114 和 6，004，755 中；和 Wang 等人，(2004)J.Clin.0ncol.22:1564-1671 (2004) ;Schena 等人，(1995) Science270:467-470 中描述；通过引用将该全部文献并入本文。
[0101]作为本公开方法中的第一个步骤，可从组织样品中分离并标记RNA。对样品运行平行处理以形成基于mRNA水平的关于基因的过量表达或低水平表达的数据。每一个癌症组织样品中的基因的过量表达或低水平表达都可与正常(非癌)样品中的基因表达进行比较。优选地，基于杂交的微阵列探针的强度测量的倍数变化区别上调和下调的水平。约2.0倍或更大倍数的差异或小于约0.05的P-值对于作出此类区别是优选的。即，在基因被称为在患病细胞对正常细胞中是差异表达的之前，发现患病细胞产生比正常细胞高或低至少约2倍的表达强度。一般地，倍数差异越大(或者P-值越低)，则基因越优选地用作诊断或预后工具。选择用于本公开的基因标签的基因具有如下的表达水平，所述表达水平导致利用临床实验室仪器与正常基因或非调苄基因的信号以超出背景的量可区别的信号的产生。
[0102]统计值可被用于确信区别调苄基因与非调苄基因和噪音。统计检验可鉴定在样品的不同组之间最显著地差异表达的基因。学生t_检验是强大的统计检验的实例，其可被用于发现两组之间的显著差异。P-值越低，基因显示不同组之间的差异的迹象越令人信服(compelling)。然而，由于微阵列允许一次测量多于一个基因，因此可能同时要求数以万计的统计检验。正因如此，不大可能仅通过偶然观察到小的P-值，且可利用Sidak校准或类似的步骤以及随机/排列实验进行调整。经t-检验的小于约0.05的P-值是基因的表达水平显著不同的证据。更令人信服的证据是考虑Sidak校准之后的小于约0.05的P-值。对于每组中的大量的样品，随机/排列检验(randomization/permutation test)之后的小于约0.05的P-值是显著差异的最令人信服的证据。
[0103]可被用于选择产生大于非调苄基因或噪音的信号的信号的基因的另一个参数是绝对信号差的测量。优选地，由差异表达的基因产生的信号与正常基因或非调苄基因的信号相差至少约20%(在绝对基础上)。甚至更优选的是，此类基因产生与正常基因或非调节基因的表达模式至少约30%不同的表达模`式。
[0104]可利用市售可得的阵列例如AFFYMETRIX U133GENECHIP.RTM.阵列(Affymetrix, Inc.)执行差异表达分析。这些阵列具有用于固定在芯片上的整个人类基因组的探针集，并且可被用于确定测试样品中基因的上调和下调。具有贴附于其上的能够检测表达产物的人类基因组DNA或探针的其它基质(substrate)，诸如从Affymetrix, Agilent Technologies, Inc.或 Illumina, Inc.的可得的基质也可被使用。目前用于本发明的优选的基因微阵列包括Affymetrix U133GENECHIP.RTM.阵列和AgilentTechnologies的基因组cDNA微阵列。用于执行基因表达分析的仪器和试剂是市售可得的。参见，例如，AFFYMETRIX GENECHIP.RTM.System。然后，将由分析获得的表达数据输入数据库。
[0105]对来自相同患者的相同的样品实施分析以产生平行数据。使用相同的芯片和样品制剂以降低可变性。
[0106]优选地，还可同时测定被称为“参考基因”、“对照基因”或“管家基因”的某些基因的表达作为确保表达谱的准确性的手段。参考基因是在许多组织类型(包括癌组织和正常组织)中一致表达的基因，且因此对标准化基因表达谱是有用的。参见，例如，Silvia等人，(2006) BMC Cancer6:200 ；Lee 等人，(2002) Genome Research, 12:292-297 ;Zhang 等人,(2005)BMCMo1.Biol.，6:4。与特有的基因表达谱中的基因平行地确定参考基因的表达提供了用于确定基因 表达谱的技术正常工作的进一步的保证。将关于参考基因的表达数据也输入数据库。在目前优选的实施方案中，以下基因被用作参考基因:ACTB、GAPD、⑶SB、RPLPO和/或TRFC。
[0107]基因表达分析鉴定了癌样品特有的基因表达谱(GEP)，即，由癌细胞差异表达的那些基因。然后利用例如实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证该GEP，可利用市售可得的仪器和试剂诸如从Applied Biosystems可得的仪器和试剂实施所述实时定量聚合酶链式反应。
[0108]如本文所用的，术语“预后”指可归因于癌症的死亡或进展的可能性的预测，包括肿瘤疾病诸如HCC的复发、转移扩散和药物耐受性。本文所用的术语“预测”指患者将对药物或一组药物的有利地或不利地响应的可能性并且还指那些响应的程度。本发明的预测方法可在临床上被用于通过选择用于任何特定患者的最适合的治疗形式而作出治疗决策。本发明的预测方法是预测患者是否有可能有利地响应治疗方案，诸如外科介入、利用给定药物或药物组合的化学疗法、和/或辐射疗法的有价值的工具。本文所用的术语“预后”还指可归因于癌症的死亡或进展的可能性的预测，包括肿瘤疾病诸如HCC的复发、转移扩散和药物耐受性。
[0109]如本文所用的，术语“肿瘤”指所有肿瘤细胞生长和增殖，不论是恶性的或良性的，以及所有癌前期和癌细胞和组织。
[0110]术语“癌症”和“癌的”指或描述哺乳动物中通常以未经调节的细胞生长为特征的
生理病症。
[0111]在本发明的上下文中，提及任何特定基因集中所列的基因的“至少一个”、“至少两个”、“至少五个”等表示所列基因的任何一个或任何组合和所有组合。
[0112]术语“表达阈值”和“限定的表达阈值”被可交换地使用，并且指所讨论的基因或基因产物的水平，在该水平之上的基因或基因产物用作不具有癌症复发的患者存活的预测标志物。阈值由临床研究诸如以下实施例中描述的那些实验性地限定。可针对最大敏感度或针对最大选择性或针对最小误差选择表达阈值。针对任何情况的表达阈值的确定完全在本领域技术人员的知识之内。
[0113]缩写词
[0114]HCC，肝细胞癌；TRE，四环素反应元件；Luc，萤光素酶；0RF，开放阅读框；BLI，生物发光成像；LAP-tTA，肝脏特异性反式激活因子；GSEA，基因集合富集分析；H&E，苏木精和伊红；EMT，上皮间质转化；MET，转移；CTC，循环肿瘤细胞；Dox，多西环素；
[0115]hbegf:编码人肝素结合EGF-样生长因子的基因；aldoa:编码醛缩酶A的基因；lgalsl:编码半乳凝素-1的基因；plp2:编码蛋白脂质蛋白2的基因；kifcl:编码驱动蛋白-样蛋白I的基因；limk2:编码UM域激酶2的基因；SCCpdh:编码酵母氨酸脱氢酶的基因corolc:编码冠蛋白-1C的基因；ndrgl:编码NDRGl (N-myc下游调节I)的基因；uaplll:编码UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶I的基因；iqgapl:编码Ras GTP酶-活化-样蛋白(P195)的基因；afp:编码甲胎蛋白(不同地，AFP、a-胎蛋白、a-1-胎蛋白，甲种胎儿球蛋白)的基因；tbcldl:编码TBClDl (Rab家族蛋白的假定的GTP酶-活化蛋白)的基因，eno2:编码烯醇酶2的基因；lpl:编码脂蛋白脂肪酶的基因；pygb:编码脑糖原磷酸化酶(phosphorylase, glycogen;brain)的基因；map3k6:编码促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶6的基因；acp2:编码酸性磷酸酶2的基因；cyp4v2:编码细胞色素P450，家族4，亚家族V，多肽2的基因；gstm6:编码谷胱甘肽S-转移酶mu6的基因。
[0116]描述
[0117]为了直接质询(interrogate)Twistl贡献于转移的可能的作用和所通过的机理，产生了 Twistl/MYC-诱导的HCC的新的条件式转基因小鼠模型。该模型已被用于确认Twistl可给予体内侵入性和转移性表型。重要地，本公开的非转移性和转移性HCC的转基因小鼠模型可被用于鉴定在患有HCC的人患者中是高度预后的基因标签。
[0118]除非另外表明，否则本公开内容的实践采用了本领域技能之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。此类技术在诸如以下文献中被充分解释:“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook 等人，1989) ^iOligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait 编，1984) ;“Animal Cell Culture”(R.1.Freshney 编，1987) ;“Methods in Enzymology^(Academic Press, Inc.) ；^Handbook ofExperimental Immunology”,第4版(Weir&Blackwell编，Blackwell Science Inc., 1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller&Calos 编，1987) ；uCurrentProtocols in Molecular Biology”(Ausubel 等人编，1987) j[I“PCR:The PolymeraseChain Reaction”, (Mullis 等人编,1994)。
[0119]—般来说，基 因表达谱分析的方法可分为两大类:基于多核苷酸的杂交分析的方法，和基于多核苷酸的测序的方法。本领域已知的用于定量样品中mRNA表达的最常用的方法包括northern印迹法和原位杂交(Parker&Barnes (1999) Methodsin Molecular Biology 106:247-283) ； RNAse protect ion assays(Hod, (1992)Biotechniquesl3:852-854)； 和 reverse transcription polymerase chainreaction(RT-PCR) (Weis 等人,(1992)Trends in Genetics8:263-264。可选地，可利用能够识别特定双链体的抗体，包括DNA双链体，RNA双链体，和DNA-RNA杂化双链体或DNA-蛋白双链体。基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达的系列分析(SerialAnalysisof Gene Expression, SAGE)和通过大规模平行标签测序(MPSS)的基因表达分析。
[0120]最灵敏的且最灵活的定量方法是RT-PCR，其可被用于比较正常组织和肿瘤组织、用药物治疗或未用药物治疗的不同样品群体中的mRNA水平，以表征基因表达的模式、区别密切相关的mRNA、以及分析RNA结构。
[0121]第一步是从靶样品中分离mRNA。起始材料通常是从人肿瘤或肿瘤细胞系分离的、并分别对应于正常组织或细胞系的总RNA。在本公开的实施方案中，可从具有转移性HCC或非转移性HCC或两者的细胞中分离总RNA样品。因此可从原发性肿瘤中分离RNA。如果mRMA的来源是原发性肿瘤，则可从例如冷冻的或存档的石蜡包埋及固定的(例如，福尔马林-固定的)组织样品中提取mRNA。
[0122]用于mRNA提取的一般方法是本领域熟知的并公开于分子生物学的标准教科书中，所述标准教科书包括 Ausubel 等人，Current Protocols of Molecular Biology, Johnffiley&Sons (1997)。从石蜡包埋的组织中提取RNA的方法公开于例如Rupp&Locker (1987)Lab.1nvest.56:A67 和 DeAndres 等人，(1995) BioTechniquesl8:42-44 中。具体地，可根据生产商的说明书，利用来自商业生产商诸如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲液组合和蛋白酶执行RNA分离。例如，可利用QIAGEN RNEASY.RTM迷你柱分离来自培养的细胞的总RNA。其它市售可得的RNA分离试剂盒包括MASTERPURE.RTM。使用完整的DNA和RNA纯化试剂盒(EPICENTRE.RTM.，Madison, ffis.)和石蜡块 RNA 分离试剂盒(Ambion, Inc.)。可利用 RNAStat-60 (Tel-Test)分离来自组织样品的总RNA。可例如通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。
[0123]因为RNA不能用作PCR的模板，通过RT-PCR的基因表达谱分析的第一步是将RNA模板逆转录成cDNA，然后是其在PCR反应中的指数式扩增。两个最常用的逆转录酶是禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。通常根据表达谱分析的情况和目标，利用特异性引物、随机六聚体或寡-dT引物引导(prime)逆转录步骤。例如，可利用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer, Calif., USA)按照生产商的说明书逆转录提取的RNA。然后，得到的cDNA可被用作后续PCR反应中的模板。 [0124]虽然PCR步骤可使用多种热稳定的DNA-依赖的DNA聚合酶，但其通常采用具有5’-3’核酸酶活性但缺乏3’-5’校对核酸内切酶活性的Taq DNA聚合酶。因此，TAQMAN.RTMPCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5’ -核酸酶活性以水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但具有等效的5’核酸酶活性的任何酶都可被使用。两条寡核苷酸引物被用于产生典型的PCR反应的扩增子。第三寡核苷酸或探针被设计以检测位于两条PCR引物之间的核苷酸序列。探针是通过TaqDNA聚合酶不可延伸的，并被报告荧光染料和猝灭荧光染料标记。当两种染料在探针上实际定位靠近在一起时，来自报告染料的任何激光诱导的发射都被猝灭染料猝灭。在扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖的方式裂解探针。所产生的探针片段在溶液中分离，且来自释放的报告染料的信号免受第二荧光团的猝灭作用。针对每个合成的新的分子，释放一个分子的报告染料，且未猝灭的报告染料的检测提供了用于数据的定量解释的基础。
[0125]可利用市售可得的设备诸如例如ABI PRISM7700.RTM序列检测系统(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA)或 LIGHTCYCLER.RTM(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)执行 TAQMAN.RTM RT-PCR0 可在实时定量PCR装置诸如ABI PRISM7700.RTM序列检测系统上运行5’核酸酶程序。该系统由热循环仪、激光器、电耦合装置(CCD)、照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上的96-孔形式中扩增样品。在扩增过程中，激光诱导的荧光信号通过用于所有96孔的光纤电缆被实时地收集，并在CXD中被检测。该系统包括用于运行仪器及用于分析数据的软件。
[0126]为了使误差和样品间变化的影响最小化，通常利用内标执行RT-PCR。理想的内标在不同组织间以恒定的水平表达，并不受实验处理的影响。最频繁用于标准化基因表达的模式的RNA是管家基因甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)和β -肌动蛋白的mRNA。
[0127]RT-PCR技术的较新的变化形式是实时定量PCR，其通过双重标记的荧光探针(即，TAQMAN.RTM.探针)测量PCR产物累积。实时PCR与定量竞争性PCR和定量比较性PCR均是相容的，在定量竞争性PCR中，每个靶序列的内部竞争者(competior)被用于标准化，定量比较性PCR则利用样品中包含的标准化基因或用于RT-PCR的管家基因。关于进一步的详细信息，参见例如 Held 等人，(1996) Genome Research6:986-994。
[0128]利用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的、包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增的用于分析基因表达谱的代表性方案的步骤在各种出版的期刊文章中给出(例如:Godfrey 等人，(2000) J.Molec.Diagnostics〗:84-91 ；Specht 等人，(2001)Am.J.Pathol.158:419-29)。简言之，代表性过程始于切割约10 y m厚的石蜡包埋的肿瘤组织样品切片。然后提取RNA，并除去蛋白和DNA。在RNA浓度的分析之后，如果需要的话，可包括RNA修复步骤和/或扩增步骤，和利用基因特异性启动子及随后的RT-PCR逆转录RNA。
[0129]可基于存在于待扩增的基因中的内含子序列设计PCR弓丨物和探针。在该实施方案中，引物/探针设计的第一步是基因中的内含子序列的描绘(delineation)。这可通过公开可用的软件诸如由Kent, W.J.(2002)Genome Res.12: v656_664开发的DNA BLAT软件或由BLAST软件、包括其变化形式进行。后续步骤按照PCR引物和探针设计的良好确立的方法。
[0130]为了避免非特异性信号，在设计引物和探针时掩蔽(mask)内含子中的重复序列是重要的。这可通过利用通过Baylor College of Medicine在线可得的Repeat Masker程序而容易地实现，所述程序针对重复元件的文库筛选DNA序列并返回其中重复元件被掩蔽的查询序列。然后，掩蔽的内含子序列可被用于利用诸如以下的任何市售的或另外公开可得的引物/探针设计包设计引物和探针序列:Primer Express.RTM(Applied Biosystems)；MGB assay-by-design(Applied Biosystems) ；Primer3(Rozen&Skaletsky(2000)于:Krawetz&Misener (编)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods inMolecular Biology.Humana Press, Totowa, N.J.,第 365-386 页)。
[0131]在PCR引物设计中考虑的最重要的因素包括引物长度、解链温度(Tm)、和G/C含量、特异性、互补引物序列和3’-端序列。一般来说，最优的PCR引物通常的长度是17-30个碱基，并含有约20%-80%，诸如例如约50%-60%的G+C碱基。在50°C和80°C之间的Tm，例如约50°C至70°C的Tm通常是优选的。
[0132]关于PCR引物和探针设计的进一步的指南，参见例如Dieffenbach等人，“General Concepts for PCR Primer Design” 于:PCR Primer, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,1995,第 133-155 页；Innis 和 Gelfand, “Optimization of PCRs” 于:PCR Protocols,A Guide toMethods and Applications, CRC Press, London, 1994,第 5-11 页；和 Plasterer, T.N.Primerselect: Primer and probe design.Methods Mol.Biol.70:520-527 (1997),在此通过引用将其全部公开内容清楚地并入。
[0133]还可利用根据本公开的方法的微阵列技术鉴定或确认差异基因表达。因此，可利用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织中测量转移性或非转移性HCC-相关的基因的表达谱。在这些方法中，感兴趣的多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)在微芯片基质上被镀层或排列。然后将排列的序列与来自感兴趣的细胞或组织的特异性DNA探针杂交。正如在RT-PCR方法中，mRNA的来源通常是从人肿瘤或肿瘤细胞系以及对应的正常组织或细胞系的总RNA中分离的。因此，可从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系中分离RNA。如果mRMA的来源是原发性肿瘤，则可从例如日常临床实践中常规制备并保存的冷冻的或存档的石蜡包埋并固定的(例如，福尔马林-固定的)组织样品中提取mRNA。
[0134]在微阵列技术的特定实施方案中，但不预期限制地，cDNA克隆的PCR扩增的插入片段被应用于密集阵列中的基质。优选地，至少10，OOO个核苷酸序列可被应用于基质。以10，000个兀件每个微芯片被固定在微芯片上的微阵列基因适于在严格条件下杂交。突光标记的CDNA探针可通过荧光核苷酸的掺入、通过从感兴趣的组织中提取的RNA的逆转录而产生。应用于芯片的标记的cDNA探针与阵列上DNA的每个点特异性杂交。在严格洗涤以除去非特异性结合的探针之后，通过共聚焦激光显微术或通过另外的检测方法诸如CCD照相机扫描芯片。每个排列的元件的杂交的定量允许评价对应mRNA的丰度。利用双色荧光分别标记的、从两种来源的RNA产生的cDNA探针成对地与阵列杂交。因此，来自对应于每个特定基因的两种来源的转录物的相对丰度同时被确定。小型化规模的杂交给予了对大量基因的表达模式的方便且快速的评价。此类方法已显示具有检测其以几个拷贝每细胞表达的稀少转录物，以及可重现地检测表达水平中至少约两倍差异所需的灵敏度(Schena等人，(1996) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:106-149)。可通过市售可得的设备，按照生产商的方案诸如通过利用AfTymetrixGenChip技术或Incyte的微阵列技术执行微阵列分析。
[0135]Twistl诱导体内HCC侵入和转移
[0136]为了直接质询Twistl是否在HCC的侵入和转移中起作用，四环素可诱导的系统(Tet系统)被用于产生转基因小鼠，所述转基因小鼠以组织特异性的方式同等地调节小鼠 Twistl 和萤火虫萤光素酶(Luc) (Kistner 等人,(1996) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.93:10933-10938)。Tet系统被选择以仅在成年宿主中模拟HCC进展以避免由于在发育过程中Twistl的组成型表达的可能的致死性。将TRE-MYC转基因小鼠与具有或不具有 Twist 1/Luc (TRE-Twistl)的 LAP_tTA27 交配。在 LAP-tTA/TRE-MYC/TRE-Twist 小鼠中，MYC和Twistl均仅在除去多西环素时才表达，如图1A中所示的。[0137]LAPtTA/TRE-MYC (MYC)小鼠死于约13.2周的中值肿瘤潜伏期的HCC，如先前所描述的(Beer 等人，(2004)PLoSBiol2, e332 ;Shachaf 等人，(2004)Nature431:1112-1117)。然而，LAP-tTA/TRE-MYC/TRE-Twist I (MYC/Twi st I)小鼠形成约19.1周的肿瘤发作的衰减潜伏期的HCC (p〈0.0001)。LAPtTA/TRE-Twi st I (Twistl)小鼠在长达18个月的观察期间内未死于肿瘤，它们也未呈现大体病理学或微观病理学(图1C和1D)。因此,产生MYC/Twistl-诱导的HCC的条件式小鼠模型，并且发现Twistl适当地延长了肿瘤发作的潜伏期。
[0138]为了检查Twistl是否诱导转移性HCC，比较了 MYC和MYC/Twi st I小鼠的转移的大体或微观迹象的证据。MYC小鼠未呈现转移的迹象，如图1B和IC中所示的。然而，相比之下，MYC/Twistl小鼠则呈现高频率的转移(52%)，包括淋巴结、脾和腹膜(38%)以及肺中的大转移(macrometastase),如图1B和IC中所示的。原发性和转移性病灶的大体病理学和微观病理学是相同的(图1D)。同样，来自MYC/Twistl病灶的原发性和转移性肿瘤表达类似水平的MYC蛋白(图1D)。类似地，在源自MYC-诱导的HCC肿瘤的细胞系中或在来自人HCC的细胞系中的异位的Twistl过量表达呈现增加的体外能动性和侵入和至多个器官部位，包括肾和肺的增加的体内转移(图11)。因此，Twistl与转基因小鼠模型中的及当在鼠和源自人HCC的细胞系中过量表达时的转移的显著增加相关。
[0139]Twistl 已被认为是 ENT 的调苄基因(Lee 等人，(2006)Clin.Cancer.Res.12:5369-5376 ;Ansieau 等人，0ncogene29:3173-3184)且 E-钙粘蛋白和 3 -连环蛋白两者的连接(junctional)表达被保持在MYC/Twi st I原发性和转移性HCC中，如图1E中所示的。[0140]类似地，比较MYC对MYC/Twistl原发性HCC时，许多间质标志物(NCad、FSp1、Fn、Vm、SMA、FoxC2、MMP2、MMP3、MMP9、MT1-MMP)(图 17A)、上皮标志物(ECad、Ck8、Ckl8、Plako2、Cx32)(图 17B)和 EMT-诱导因子(Snaill、ZebU SIPU Snail2)(图 17C)是未改变的。然而，在转移中，表明 EMT 的这些标志物(FoxC2、MMP9、Ck8、Ckl8、0cc、Plako2、Cx32、SIPl)中的许多存在改变。另外，MYC/Twistl原发性和转移性病灶的微阵列表达谱与如由来自MeSH术语途径分析(MeSH term pathway analysis)的基因集合富集分析(GSEA预排序)所确定的EMT—致(参见以下和表2)。因此，虽然不存在MYC/Twistl-诱导的原发性HCC，但是由Twistl表达诱导的转移确实呈现EMT的迹象。
[0141]在转基因失活时Twistl-诱导的HCC转移是可逆的
[0142]血行转移(hematogenous metastasis)需要肿瘤细胞内渗到血管中，其可检测为循环肿瘤细胞(CTC)(Chaffer&Weinberg(201I)Science331:1559-1564 ；Maheswaran&Haber (2010) Curr.0pin.Genet.Dev.20:96-99)。通过针对 Luc 或人MYC 转基因(hMYC)的qRT-PCR分析测量MYC对MYC/Twistl转基因小鼠的外周血中的CTC。与MYC小鼠相比，来自MYC/Twistl小鼠外周血的Luc和hMYC分别增加2000倍和19倍(p=0.0119，图2A、图2B和图17A-17C)。因此，Twistl引起进入血流中的可促进转移的明显增加的内渗。
[0143]MYC和Twistl表达的抑制诱导Luc的170倍下降(p=0.0121)、hMYC的165倍下降(p=0.0159)的CTC的显著下降(图2A和2B)。通过微型CT的成像说明在转基因失活之后，原发性和转移性HCC经历直至10个月的完全的且持续的肿瘤消退(n=4，图2C)。致癌基因的再活化与原发性和转移性肿瘤的快速肿瘤再度出现相关(n=4，图2D)，类似于先前的描述(Shachaf 等人，(2004) Nature431:1112-1117)。因此，MYC 和 Twistl 诱导原发性和转移性HCC肿瘤两者的可逆的致瘤表型。
[0144]MYC/TwistlHCC可被用于模拟人肝癌
[0145]单基因Twistl的加入足以引起非转移性MYC-诱导的HCC肿瘤立刻转移。因此，本公开的非转移性HCC对转移性HCC的转基因小鼠模型提供了鉴定预测人HCC的转移和差的结果的基因的手段。
[0146]对MYC 原发性 HCC(MYC HCC, n=2)、MYC/Twistl 原发性 HCC(MYC/TwistlHCC,n=6)、MYC/Twistl转移性病灶(MYC/TwistIMET，n=8)、和正常肝脏(正常，n=2)执行表达微阵列。然后将数据分组并聚类(图3 ;AN0VA，p=0.05，FC>2，与正常比较)。通过使用GSEA排序的列表分析，比较了小鼠和人HCC基因表达并发现MYC/Twistl原发性和转移性肿瘤高度类似于与MYC过量表达和不良预后相关的人HCC肿瘤(Boyault等人，(2007)H印atology45:42-52 ;Hoshida 等人，(2009) Cancer Res.69:7385-7392)(图 4)。因此，本公开的MYC和MYC /Twistl转基因模型具有对应于人HCC的基因表达程序。
[0147]还鉴定了 MYC/Twistl原发性HCC或MYC/TwistIMet中特有地并统计显著地表达的基因。通过将这些结果与来自Cytoscape中的MeSH术语途径分析的基因集合比较，这些基因与EMT (p=0.0243)、转移(p=0.0747)和侵入(p=0.0973)相关，如表2和表3中所示的。因此，MYC/Twistl诱导的HCC的小鼠模型的分析鉴定了与侵入和转移相关的基因。
[0148]来自转移性小鼠HCC的基因标签在人患者中的预后
[0149]检查本公开的MYC/Twistl转基因动物模型以确定其是否可被用于鉴定可预测患有HCC的患者中的临床结果的基因。将来自非转移性的MYC-诱导的HCC原发性肿瘤的微阵列数据与MYC/Twi st I诱导的HCC原发性肿瘤和MYC/Twi st I诱导的转移性HCC比较。通过这些比较，鉴定了仅在MYC HCC(154个基因)、MYC/TwiStlHCC(3948个基因)或MYC/Twistl MET(197个基因)中差异调节的基因或在以下组之间重叠表达的基因:MYC/TwistlHCC+MYC/Twist MET (在此被称为 MYC/TwistlHCC+MET ;592 个基因)；MYCHCC+MYC/TwistlHCC(189 个基因)；MYC HCC+MYC/TwistlMET (18 个基因)，及 MYC HCC+MYC/Twist 1HCC+MYC/TwistIMET (99 个基因；图 3C)。
[0150]通过在具有微阵列和包括总共273名患者的存活数据的人HCC的4个在先研究的背景下分析它们，针对它们是否与临床结果相关评价了这些标签。检验了这些基因集合的成员是否偏向于表达水平与良好或不良预后有关的基因，如通过它们在Cox回归中的Z-分数所评估的。MYC/Twistl HCC+MET基因标签与人HCC患者的差的存活最密切相关(对于215 个上调基因，p〈0.00001，NES=L 749，FDR=0.0132 ;对于 84 个下调基因，p〈0.00001，NES=-2.018，FDR=6.33E-04)(表 2)。 [0151]Z-分数分析被用于比较这些新的标签与被报道对HCC转移和存活预后的五个先前公布的基因标签(Coulouarn等人，(2009) 0ncogene28:3526-3536 ；Coulouarn 等人，(2008)Hepatology47:2059-2067 ；Kapos1-Novak 等人，(2006) J.Clin.1nvest.116:1582-1595 ；Roessler 等人，Cancer Res.70:10202-10212 ；Ye 等人，(2003)Nat.Med.9:416-423)(表2和图18和图19)。在人HCC定群的存活预测时，MYC/TwistlHCC+MET标签与先前限定的人HCC转移标签表现同样好或比先前限定的人HCC转移标签好(Coulouarn 等人，(2008) Hepatology47:2059-2067)。
[0152]研究了使患有人HCC的患者的存活分层(stratify)的MYC/TwistlHCC+MET鼠标签的基因的表达。为了该分析，利用个体数据集是有必要的，因为随访时间段和排除的存活标准使所有定群分层在一起。Kaplan-Meier分析表明，具有本公开的MYC/Twi stlHCC+MET标签基因的较闻表达的患者具有比在先如公布的91个HCC样品的定群中具有标签基因的较低表达的患者差的总存活(Lee等人，(2004)Nat.Genet.36:1306-1311)。
[0153]与低标签患者的70个月的中值存活相对，高MYC/Twi stlHCC+MET标签患者的中值总存活是10个月(图6A和图6B ;对数秩p=0.002 ;图20 ;表4)。Kaplan-Meier分析确认，17基因-鼠标签对386名患者的独立定群中的患者的不良预后是高度预测性的(Roessler等人，Cancer Res.70:10202-10212)，与非标签匹配的患者的未限定的(没有达到的)中值存活相对，高MYC/Twi stlHCC+MET标签患者的中值总存活是42.2个月(图6B ;对数秩P=0.0001)。重要地，利用第三独立的人HCC定群(Ye等人，(2003) Nat.Med.9:416-423)确定了鼠MYC/Twi stlHCC+MET标签可基于原发性肿瘤的表达谱预测人HCC的转移的发生率(图6C，t-检验方法，p〈0.00001)。因此，通过由单独的Twistl在体内转基因小鼠模型中诱导的基因表达变化的分析，产生了预测患有HCC的人患者的转移和总存活的标签。
[0154]对人HCC转移和总存活预后的20-基因标签的鉴定
[0155]为了鉴定我们的MYC/Twi st 1HCC+MET标签中的与HCC的恶性进展相关的最关键的基因，将该标签中的368个上调基因与五个先前表征的本公开的鼠标签先前已与其比较的人HCC转移标签中包括的591个上调基因进行比较(Coulouarn等人，(2009)0ncogene28:3526-3536 ；Coulouarn 等人，(2008)Hepatology47:2059-2067 ;Kapos1-Novak 等人，(2006)J.Clin.1nvest.116:1582-1595 ;Roessler 等人，CancerRes.70:10202-10212 ;Ye 等人，(2003)Nat.Med.9:416-423)(在下文中，该 591 个基因被称为人HCC总转移上调标签)。这种比较意在查明本公开的高度预测性小鼠标签中对HCC转移是如此重要以致它们在由不同的遗传畸变(genetic aberration)驱动的至少一个其他转移标签中被上调的任何基因。当将MYC/TwistlHCC+MET标签基因列表与人HCC总转移上调标签的基因列表比较时，显示了 17个此类上调基因(图7、18和19 ;表2)。这些上调基因是包括本公开的基因标签的 hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
[0156]检查了该17个鉴定的上调基因的集合预测患者结果和疾病进展的能力。通过Z-分数存活分析，17-基因转移标签比来自本公开的或先前报道的小鼠转基因模型的其它个体或编译的HCC标签具有对HCC总存活大的预后能力(表2 ；p=0.0079，NES=L 774，FDR=0.0125)。在Z-分数存活分析中，17-基因标签也比其所源自的MYC/Twist 1HCC+MET标签表现的好(表2)。[0157]本公开的17-基因标签基于来自如在(Ye等人，(2003)Nat.Med.9:416-423 ；Lee等人，(2004)Nat.Genet.36:1306-1311)中所描述的两个定群的存活分层人HCC患者，如通过Kaplan-Meier分析评估的。17-基因标签与人HCC患者中差的存活相关(图8A ;对数秩P=0.004，未达到中值存活；图20 ;表4)。利用独立的人HCC定群进一步确认了结果(Roessler等人，Cancer Res.70:10202-10212)，如与未达到的非标签匹配的患者相对，MYC/TwistlHCC+MET标签患者的中值存活是32.6个月(图8B，对数秩p=0.0012)。而且，17-基因标签还能够预测原发性人HCC的转移能力(图8C，t-检验方法，p〈0.00001)。因此，17-基因标签具有以人患者中的转移和总存活的形式预测疾病进展的能力。
[0158]与包括以下的其他临床分期方法相比并与包括以下的其他临床分期方法结合，通过单变量和多变量Cox回归分析检查了我们的17-基因标签对人HCC中的总存活/临床结果的预后倉泛力:Cancer of the Liver Italian Program(CLIP) > Classification ofMalignant Tumors (TNM)和 Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) (Pons 等人，(2005)HPB (Oxford) 7:35-41)。在单变量Cox回归分析中，17-基因标签比性别、年龄、AFP、硬化和肿瘤大小的临床变量表现的好(图4D左侧；p=0.001, HR2.11)。在单变量分析中，17-基因标签确实与 CLIP (ρ=0.003，HR2.29)、ΤΝΜ(ρ=0.001，HR2.21)和 BCLC (ρ〈0.001，HR3.02)的临床分期方法可比较地表现。通过多变量Cox回归，发现17-基因标签甚至当与CLIP、TMN和BCLC分期系统结合时也是具有显著能力的独立的预后因素。表2显示了多变量分析，显示17-基因标签独立预后人HCC-特定存活中的总存活(HR2.27，p=0.006)，在与全部三个已知分期系统结合时，因此增加了其个体的预后能力(--Μ、CLIP和BCLC)。显示的是多变量模型中每个变量的HR和95%CI，以及P-值(对数似然)。
[0159]表1
[0160]
【权利要求】
1.一种对患者的肝细胞癌预后的基因标签，其中来自所述基因标签的差异基因表达预测患有转移性肝细胞癌的患者的存活，且其中所述基因标签包括选自由以下组成的组的多个基因:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
2.如权利要求1所述的对患者的肝细胞癌预后的基因标签，其中所述基因标签基本上由以下基因组成:hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
3.如权利要求1所述的对患者的肝细胞癌预后的基因标签，其中所述基因标签由以下基因组成:hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
4.如权利要求1所述的对患者的肝细胞癌预后的基因标签，其中所述基因标签由以下基因组成:hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
5.一种确定患者的肝细胞癌的转移状态的方法，所述方法包括:从来自患有肝细胞癌的受试者的癌样品获得第一差异基因表达谱，其中所述第一差异基因表达谱包括选自由以下组成的组的多个基因的表达信息的数据集:hbegf、aldoa、IgalsU plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uapll1、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6 ;及创建概述通过所述第一基因表达分析获得的标准化数据的报告，其中所述报告包括肝癌的转移状态的确定。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述患者的所述肝细胞癌的所述转移状态提供了所述患者中的所述癌的发展的预后。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述第一基因标签基本上由以下基因组成:hbegf、aldoa、IgalsKplp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp>tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述第一基因标签由以下基因组成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述第一基因标签由以下基因组成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
10.如权利要求5所述的方法，所述方法包括以下步骤: (i)从怀疑患有转移性肝细胞癌的患者获得第一生物样品； (?)从所述生物样品中分离RNA ;以及 (iii)确定所述第一基因标签的表达的差异水平。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一基因标签包括基因hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6,其中如果当与非转移性组织中的水平相比时所述基因标签的基因 hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl>uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6 的表达的差异水平提高且基因 acp2、cyp4v2和gstm6的表达的差异水平降低，则所述水平指示所述癌的转移，从而提供所述患者中的所述癌的发展的预后。
12.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括以下步骤: 从未患有肝细胞癌或怀疑未患有发展的转移性肝细胞癌的受试者获得第二生物样品; 从所述生物样品中分离RNA ； 石角定包括基因 hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6 的第二基因标签的差异表达的水平； 比较所述第一基因标签和所述第二基因标签的表达的差异水平，其中来自所述第一基因标签和所述第二基因标签的表达的相对差异水平指示怀疑患有转移性肝细胞癌的患者中的转移性肝细胞癌细胞的存在或不存在；以及 创建概述通过所述基因表达分析获得的标准化数据的报告，其中所述报告包括患有肝细胞癌的所述患者的长期存活的可能性的预测。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一和所述第二生物样品来自相同的患者，从而指示所述患者中的所述肝细胞癌的进展。
14.如权利要求12所述的方法，其中确定所述基因标签的所述基因的表达的差异水平的步骤包括从所述第一生物样品和所述第二生物样品中分离RNA ;以及检测源自所述基因标签的所述基因的RNA的水平。
15.一种诱导动物或人受试者中的肝细胞癌的消退的方法，所述方法包括降低Twistl基因的表达水平或其产物的量，从`而降低所述癌的转移的水平。
【文档编号】C12N15/11GK103687963SQ201280034774
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月12日
【发明者】迪安·W·费尔舍, 福·特朗, 斯泰西·亚当, 大卫·I·贝劳文 申请人:小利兰·斯坦福大学理事会