核酸分析方法和核酸分析装置制造方法

核酸分析方法和核酸分析装置制造方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种简便的核酸分析方法，所述核酸分析方法具有一次能够解析的核酸种类达千种以上的包罗性和动态范围达4位以上的定量性。特别是提供一种对于解析对象核酸为1万种以下的非翻译RNA、microRNA的解析极其有效的解析方法。本发明通过准备解析对象核酸片段组各一分子，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，并对标记在发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测，能够不使用PCR等扩增反应而对解析对象核酸的种类和存在量兼顾包罗性和定量性地、以一分子的灵敏度和分辨率简便、迅速地进行核酸分析。
【专利说明】核酸分析方法和核酸分析装置
【技术领域】[0001]本发明涉及核酸分析方法和核酸分析装置。
【背景技术】
[0002]近年来，作为核酸解析方法，开发出了对试样中所包含的核酸的种类和量简便地进行解析的方法。例如，如非专利文献I所记载的那样，在DNA微阵列中，预先将多种具有能够识别已知基因序列的序列的合成DNA固定在支撑基体上的规定位置，将赋予了荧光体标记的核酸试样或核酸试样的逆转录产物、扩增产物在所述支撑基体上进行杂交，然后利用荧光扫描仪获得荧光图像，从而可以由荧光强度解析何种基因以怎样的量进行了表达。此外，如非专利文献2所记载的那样，如下的定量PCR法也被用作核酸解析方法:使用作为核酸扩增反应的PCR求出扩增曲线，在试样之间对获得一定量扩增产物所必需的反应次数进行比较。进而，如非专利文献3所记载的那样，如下的所谓新一代测序法也已经实用化:在包含微粒的乳液中进行PCR反应，将大量包裹有扩增产物的微粒固定在支撑基体上后进行DNA延伸反应,从而掺入荧光体标记的核苷酸，通过观察荧光，平行性良好地进行碱基序列解析。
[0003]现有技术文献
[0004]非专利文献
[0005]非专利文献1:Sciencel995, Vol.270, ρρ467_470.[0006]非专利文献2:Nucleic Acid Research, 1992, Vol.20, pp4939.[0007]非专利文献3:Genome Research2008, Vol.18, ppl051-1063.[0008]非专利文献4:Nature Methods, 2009, Vol.6, pp474_476.[0009]非专利文献5 =Nature Methods2010, Vol.7, pp687-692.
【发明内容】

[0010]发明要解决的问题
[0011]作为探索疾病相关基因的方法，将健康人和特定疾病患者的核酸试样进行比较从而找出在疾病患者中表达量显著高或显著低的基因的方法被用作常用手段。作为这样的方法，通常是首先通过微阵列选定表达量不同的候选基因，然后使用定量PCR对这些候选基因的表达量的差异进行严格确认的方法。微阵列具有如下特征:一次能够解析的基因数为数万以上，所探索的基因的包罗性高，但动态范围(Dynamic Range)为2~3.5位左右，定量性低；而定量PCR法具有如下特征:动态范围为6~7位，定量性高，但一次能够解析的基因数为400左右，包罗性低，因而上述方法是组合了各自的优点而得到的方法。因此存在如下问题:为了进行试样之间的表达比较解析，必须进行微阵列和定量PCR2个阶段的实验。而新一代测序一次能够解析的核酸片段数为数亿~数十亿条，可以通过对同一序列的核酸片段数进行计数而确定表达量，因此动态范围达到8位以上。其虽然适合于存在2万种以上的信使RNA的包罗性表达解析，但对于解析非翻译RNA、数十个碱基以下的miciORNA等存在的种类数为2千种以下的核酸的表达量而言规模过大，一次解析中耗费的试剂等运行成本、花费长达数十小时的解析时间成了问题。
[0012]此外，如非专利文献4所指出的那样，在利用定量PCR、新一代测序进行表达解析时，存在如下问题:通过PCR对核酸试样进行扩增，扩增效率依赖于GC含量等碱基序列，因此，无法以相同的扩增效率扩增试样的全部核酸，核酸群体中产生偏差，无法正确解析各核酸分子的存在量的分布。
[0013]本发明的目的在于，提供一种简便的核酸分析方法，所述核酸分析方法不使用PCR等扩增反应，具有一次能够解析的核酸种类达千种以上的包罗性和动态范围达4位以上的定量性。特别是提供一种解析对象核酸为I万种以下的对于非翻译RNA、microRNA的解析极其有效的解析方法。
[0014]用于解决问题的手段
[0015]本发明涉及如下方法:通过将试样的核酸分子在空间上分离的位置上各固定一分子并使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述试样的核酸分子组进行杂交，获取荧光图像，从而以一分子的灵敏度和分辨率对核酸分子的种类和表达量进行解析。
[0016]发明的效果
[0017] 根据本发明，能够不使用PCR等扩增反应而对解析对象核酸的种类和存在量兼顾包罗性和定量性地、以一分子的灵敏度和分辨率简便、迅速地进行核酸分析。
[0018]此外，本发明的方法不仅能够应用于核酸试样，还能够通过使用抗体等作为捕捉分子而应用于蛋白质等核酸试样以外的生物分子的解析。对于由多种生物分子构成的生物分子试样，可以使解析对象生物分子在支撑基体上的有规律的位置，在每一个固定位置各固定所述生物分子的一分子，使已知吸附于特定生物分子的检测用生物分子与所述固定于支撑基体上的生物分子试样反应，通过对所述检测用生物分子进行检测，与核酸试样的情形同样地进行分析。因此，能够兼顾包罗性和定量性地、以一分子的灵敏度和分辨率简便、迅速地对解析对象生物分子的种类和存在量进行分析。
【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1是用于说明本实施例的解析方法的一例的图。
[0020]图2是用于说明本实施例的解析方法中使用的器件的构成的一例的图。
[0021]图3是用于说明本实施例的解析方法中使用的器件的制造方法的一例的图。
[0022]图4是用于说明本实施例的固定有一个分子的微粒的制作方法的一例的图。
[0023]图5是用于说明本实施例的解析方法的一例的图。
[0024]图6是用于说明本实施例的解析方法的一例的图。
[0025]图7是用于说明本实施例的核酸分析装置的一例的图。
【具体实施方式】
[0026]实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，准备解析对象核酸片段组，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，对标记在发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测，对所述荧光体的个数进行计数。
[0027]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，准备解析对象核酸片段组各一分子，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，对标记在发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测。
[0028]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，包含:将解析对象核酸分子组各一分子固定在空间上分离的位置的工序，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸分子组杂交的工序，以及在所述杂交的工序后对所述荧光体的荧光进行测定的工序。
[0029]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，包含:将解析对象核酸分子组各一分子固定在支撑基体上的不同位置的工序，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述支撑基体上的核酸片段组杂交的工序，以及在所述杂交的工序后对所述荧光体的荧光进行测定的工序。
[0030]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，包含:将解析对象核酸片段组固定在微粒上使得每一个微粒上各固定所述核酸片段一分子的工序，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述微粒上的核酸片段杂交的工序，在所述杂交的工序后将所述微粒固定在支撑基体上的工序，以及对所述荧光体的荧光进行测定的工序。
[0031]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，解析对象核酸片段组并不是在每个核酸试样被隔离开的微小容器内、而是全部核酸片段组与包含具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子的同一溶液反应，从而进行杂交。
[0032]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，所述荧光体标记为包含配合比例按照解析对象核酸的种类而不同的多种荧光体的微粒。
[0033]此外，实施例中公开`一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，对于特定核酸品种以外的核酸品种使用同一荧光体标记，按照所述核酸分子对荧光亮点数进行计数并算出每个特定核酸品种的亮点数相对于总亮点数的比值，从而对所述每个特定核酸品种的存在量进行评价。
[0034]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，包含对解析对象核酸片段组赋予共通的荧光体标记、使其与用不同于所述荧光体的荧光体标记的具有已知碱基序列的核酸分子杂交的工序，通过算出前者和后者的荧光体的亮点数的比值，对所述解析对象核酸片段的每个种类的存在量进行评价。
[0035]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，准备各固定有解析对象核酸片段组一分子的微粒，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，对标记在发生了杂交的所述核酸分子上的荧光体进行检测。
[0036]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，各固定有解析对象核酸片段组一分子的所述微粒为磁性微粒，所述荧光体标记为包含配合比例按照解析对象核酸的种类而不同的多种荧光体的微粒，杂交后将未发生杂交的所述被荧光体标记的核酸分子和所述磁性微粒分尚，然后对标记在与所述磁性微粒上的核酸分子发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测。
[0037]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，对于特定核酸品种以外的核酸品种使用同一荧光体标记，按照所述核酸分子对荧光亮点数进行计数并算出每个特定核酸品种的亮点数相对于总亮点数的比例，从而对所述每个特定核酸品种的存在量进行评价。[0038]此外，实施例中公开一种核酸分析方法，其特征在于，所述核酸分析方法中，包含对解析对象核酸分子组赋予同一荧光体标记、使其与用不同于所述荧光体的荧光体标记的具有已知碱基序列的核酸分子杂交的工序，通过算出前者和后者的荧光亮点数的比值，对所述解析对象核酸的每个种类的存在量进行评价。
[0039]此外，实施例中公开一种核酸分析装置，其特征在于，具备:将解析对象核酸分子组各一分子固定在空间上分离的位置的手段，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸分子组杂交的手段，以及在所述杂交的工序后对所述荧光体的荧光进行测定的手段。
[0040]以下参照附图对本发明的上述以及其它新颖特征和效果进行说明。这里，为了完整理解本发明而对特定的实施方式进行了详细说明，但本发明不受这里所记载的内容的限定。
[0041]实施例1
[0042]使用图1说明本实施例的器件的构成和解析方法。
[0043]本实施例的器件构成如下。在支撑基体101之上形成有粘接垫102。作为支撑基体101，可以使用石英等玻璃基板、硅晶圆等。作为粘接垫102，为不同于支撑基体101的材质即可，可以使用金属或金属的氧化物。粘接垫的制作方法将在实施例3中详细描述。粘接垫102优选有规律性地形成于支撑基体101上，细节在实施例3中描述。在粘接垫102之上固定有微粒103。每个粘接垫上固定的微粒数为I个。在微粒103上，仅一分子的捕捉分子104介由结合分子105而固定。根据解析对象核酸片段106的种类，捕捉用标签分子107、捕捉分子104、结合分子105可以使用各种各样的组合分子组。例如，当解析对象核酸片段106为RNA的逆转录产物 时，捕捉用标签分子107可以使用逆转录反应时的引物DNA，作为捕捉分子104，可以使用具有捕捉用标签分子107的互补序列的核酸分子。或者还可以以末端具有生物素的核酸分子作为捕捉用标签分子107，使用末端具有抗生物素蛋白的分子作为捕捉分子104。结合分子105可以使用碳原子数10左右以下的烷烃分子，可以使用通过化学键与捕捉分子104结合、相反侧的末端带有生物素的分子。此时，在微粒103的表面修饰有抗生物素蛋白、链酶抗生物素蛋白等是理想的。关于捕捉用标签分子107和捕捉分子104的反应，当两者为具有互补序列的核酸分子时，优选为杂交。此外，也优选使用通过连接反应使两者以化学键连接的方法。结果，解析对象核酸片段106按照规律的配置以每一分子孤立的状态被固定在支撑基体101上。
[0044]然后，鉴定所固定的解析对象核酸片段106的种类，求出其存在数。使带荧光体标记的核酸分子108与固定有解析对象核酸片段106的基板反应。带突光体标记的核酸分子108中包含与解析对象核酸片段106互补的核酸序列。荧光体标记可以使用Cy3和Cy5等通常的荧光色素分子、包含Zn - Se等的半导体微粒。当需识别的解析对象核酸片段106的数量多时，可以使用引入了荧光体的荧光珠子作为荧光体标记。例如，通过将2种荧光体的含量设为各10种水平并改变2种荧光体的含量水平进行混合，能够制作100种荧光珠子，如果将荧光体的数量设为3种，则能够容易地制作1000种可识别的荧光珠子的珠子套装。例如，Luminex公司销售一种通过以2波长的激光进行激发可以识别的100种荧光珠子的荧光珠子套装。通过对这些荧光珠子的表面进行化学修饰并使其与核酸分子结合，可以制作带荧光体标记的核酸分子108。杂交后，适当洗涤非特异吸附物，然后进行荧光检测，从而进行解析对象核酸片段106的分析。当为荧光体标记仅带有一分子Cy3、Cy5等通常的荧光色素分子的带荧光体标记的核酸分子108时，从基板上的固定有解析对象核酸片段106的位置，观察到一分子荧光。此时，由于荧光微弱，因此需要EM-CXD等高灵敏度的荧光检测仪。当使用荧光珠子作为荧光体时，发出比一分子荧光更强的荧光，因此用通常的CCD也能够充分检测。由于粘接垫102是高度规律性地、例如以格子状形成于支撑基体101上的，因此荧光图像中也是在有规律性的位置观测到荧光的亮点。因此，即使带荧光体标记的核酸分子108非特异性地附着在支撑基体101上，也能够根据荧光图像的亮点位置容易地识别、除去。这一点在微量试样的解析、微弱荧光的观察中实际上是非常有用的特征。在荧光体或荧光珠子的识别中，可以通过使用衍射光栅将发光光谱分光后照射在CCD的感光面上并对按波长方向分开的各像素的强度进行研究，来识别荧光体或荧光珠子的种类。或者，还可以使用反射特性具有较大波长依赖性的分色镜，使用反射光和透过光的比率来识别荧光体或荧光珠子的种类。在进行各亮点的识别后，对其进行合计，从而可以最终获得解析对象核酸片段106的种类和亮点数、即存在量的信息。例如，在以I μ m间距制作粘接垫102时，每
一mm中存在IO6个粘接垫，因此可以对最大总分子数IO6中存在多少分子的规定种类的解析对象核酸片段进行研究。
[0045]以下，作为具体解析对象，以HiiCT0RNA为例对细节进行说明。
[0046]解析对象为microRNA时,可以从已知的microRNA碱基序列数据库(例如http://www.microrna.0rg/)中获取各microRNA分子的序列数据。基于该数据可以设计逆转录用引物。引物的喊基长度优选为10~15喊基左右,5'端具有10喊基的DNA作为捕捉用标签分子107。例如，WAmicroRNA为对象设计、合成1000种引物。制作将合成的1000种引物各以等量混合的引物混合物(cocktai I)，以总RNA为对象，混合了逆转录用引物混合物、逆转录酶后，在37-40°C的环境下进行逆转录反应，合成cDNA，从而获得解析对象核酸片段106和捕捉用标签分子107的结合产物。或者，也可以使用RNA作为解析对象核酸片段106，使用10碱基左右的RNA作为捕捉`用标签分子107，用T4RNA连接酶使两者结合，从而使捕捉用标签分子107结合在解析对象核酸片段106上。基板预先固定有一分子的针对捕捉用标签分子107的10碱基核酸的互补链DNA作为捕捉分子104。关于一分子的捕捉分子104对微粒103的固定，细节记载在实施例4中。通过常规手段使cDNA (结合了解析对象核酸片段106和捕捉用标签分子107的分子)在基板上进行杂交，从而将解析对象核酸片段106固定在基板上。
[0047]与上述同样地从已知的microRNA碱基序列数据库获取各microRNA分子的序列数据，按照与该序列相同的碱基序列合成1000种在5'端修饰有生物素的合成寡核苷酸。
[0048]作为荧光珠子中使用的荧光体，可以使用例如Cy5、Cy5.5、Cy3，激发光可以以532nm、633nm2种进行应对。制作各色素的浓度比不同的溶液，在由苯乙烯单体合成聚苯乙烯珠子的阶段进行混合，从而可以制作具有规定色素混合比的聚苯乙烯珠子。为了在聚苯乙烯表面实施抗生物素蛋白等修饰，通过使用丙烯酸/甲基丙烯酸和苯乙烯的共聚反应在珠子表面导入羧基，以碳二亚胺为交联剂与抗生物素蛋白的氨基反应，从而可以容易地进行修饰。
[0049]通过使修饰有抗生物素蛋白的突光珠子和在5'端修饰有生物素的合成寡核苷酸反应，可以合成带荧光体标记的核酸分子108。[0050]然后，使用常规方法使带荧光体标记的核酸分子108与固定有解析对象核酸片段106的基板进行杂交。
[0051]用包含十二烷基硫酸钠的洗涤液洗涤后，获取荧光图像，识别各粘接垫的荧光亮点相当于何种荧光珠子并对亮点进行计数，从而可以解析各种miCToRNA的存在量。
[0052]能够检测的核酸品种的数量取决于可以识别的荧光珠子的数量。当HiiCT0RNA的种类存在大约1000种时，制作1000种荧光珠子即可，如前所述，通过将荧光体的含量各设为10种水平并改变3种荧光体的含量水平进行混合，能够容易地制作1000种可以识别的荧光珠子的珠子套装，可以一次对所有HiiCT0RNA种类全部进行检测。此外，在欲仅研究特定microRNA的表达量时，制作与特定microRNA品种对应的带荧光体标记的核酸分子108并仅准备相应数目的荧光珠子。对于特定microRNA品种以外的microRNA品种，使用它们以外的同一荧光珠子，从而作为荧光珠子的种类，即使不准备1000种，也能够作为亮点的计数值知晓全部microRNA的存在量,此外,还可以求出特定microRNA相对于全部microRNA的存在比。
[0053]或者，预先对捕捉用标签分子107赋予具有发光波长或发光强度不同于带荧光体标记的核酸分子108的荧光色素标记,将标记在捕捉用标签分子107上的荧光色素产生的荧光亮点数判断为相当于全部核酸试样分子数、将各种标记在带荧光体标记的核酸分子108上的荧光体的荧光亮点数判断为相当于各种核酸试样分子数，将两者的亮点数的比值判断为各种核酸试样分子的存在比率，这在欲仅研究特定核酸分子的表达量时也是极其有效的。
[0054]进而，本发明的方法不仅能够应用于核酸试样，通过优化捕捉分子104，也能够应用于蛋白质等核酸试样以外的生物分子的解析。对于由多种生物分子构成的生物分子试样，可以将解析对象生物 分子在支撑基体上的有规律的位置通过捕捉分子104使用适当的抗体等，在每一个固定位置各固定所述生物分子一分子，使已知吸附于特定生物分子的检测用生物分子与所述固定于支撑基体上的生物分子试样反应，对所述检测用生物分子进行检测，从而与核酸试样的情形同样地进行分析。因此，能够兼顾包罗性和定量性地、以一分子的灵敏度和分辨率简便、迅速地对解析对象生物分子的种类和存在量进行分析。
[0055]上述实施例中，示出了将解析对象的DNA试样各一分子固定在基板上的例子，各固定一分子在计数上容易，但各固定一分子并非必须条件，即使固定各二个或各三个，只要能够计数，当然也能够达到对解析对象DNA试样的种类和存在量进行解析的本发明的目的。
[0056]实施例2
[0057]使用图2说明本实施例的器件的构成。在支撑基体201之上有规律地、例如如图2所示那样以格子状形成有粘接垫202。粘接垫202和微粒203介由线状分子205通过化学键或化学性相互作用而被连接。线状分子205的末端的官能团206和粘接垫202优选通过化学性相互作用结合。此时，优选官能团206与支撑基体201的相互作用弱、与粘接垫202的相互作用强。从这样的观点出发，作为支撑基体201，可以使用石英玻璃、蓝宝石、硅基板等。此外，粘接垫202可以由选自金、钛、镍、铝的材料构成。官能团206必须考虑支撑基体201和粘接垫202的组合而进行选择，可以使用例如巯基、氨基、羧基、磷酸基、醛基等。线状分子205发挥连接微粒203和粘接垫202的作用，对于长度没有大的限定，在低分子的情况下，优选碳原子数3至20左右的直链状分子。线状分子205的末端的官能团207具有与微粒203的粘接性。此外，使用高分子作为线状分子205时，可以使用具有多个侧链且同时具有带有官能团206的侧链和带有官能团207的侧链的分子。作为微粒203，可以使用金属微粒、半导体微粒。例如，作为金的微粒，可以利用市售的直径5nm~IOOnm的微粒。此外，作为半导体微粒，可以利用市售的直径为IOnm~20nm左右的CdSe等化合物半导体。可以用作官能团207的官能团根据微粒的种类的不同而不同，例如，在使用金微粒时，优选为巯基、氨基等。使用半导体微粒时，市售有用链酶抗生物素蛋白修饰了表面的微粒，可以使用生物素作为官能团207。进而，作为微粒203，还可以使用由聚苯乙烯等高分子材料形成的微粒。在为高分子材料的情况下，可以使微粒的粒径一致，粒径的大小也可以从数十nm至数μm的宽广的范围进行选择。此外，通过以高分子材料所具有的官能团为基础进行表面修饰，可以使得用于固定于微粒表面的捕捉分子204的固定反应的官能团的导入量均匀，从这一点来看是优选的。特别是仅将一分子捕捉分子204固定于微粒表面时，固定率的再现性非常高，故而优选。
[0058]捕捉分子204可以使用DNA、RNA核酸分子的一条链。预先对核酸分子的末端与官能团207同样地进行修饰并与微粒203反应。优选在一个微粒203上固定的捕捉分子204为一分子，从而在粘接垫202之上仅固定一分子捕捉分子204。
[0059]在利用简便的荧光检测来识别探针时，考虑到衍射极限，优选探针之间距离Iym左右。因此,微粒203的尺寸优选为I μπι以下。
[0060] 作为在支撑基体201上形成粘接垫202的方法，可以利用在半导体中已经实用化的薄膜工艺。例如，可以通过透过掩模进行蒸镀、溅射、或在通过蒸镀、溅射形成薄膜后利用干式蚀刻或湿式蚀刻而制造。使用薄膜工艺可以容易地实现有规律地配置。衬垫间的间隔可以任意设定，在进行光检测作为检测手段时，考虑到光检测的衍射极限，优选为I μ m以上。
[0061]在支撑基体201上形成粘接垫202后，供给连接微粒203和粘接垫202的线状分子205，将线状分子205固定在粘接垫202上。此时，出于防止在支撑基体201上的非特异性吸附的目的，在供给线状分子205之前使与支撑基体201的粘接力强的材料在支撑基体201上进行反应的方法是有效的。例如，可以使用硅烷偶联剂等。然后，将固定有捕捉分子204的微粒203供给于基板上，将微粒203固定在粘接垫202上，从而制成核酸分析用器件。
[0062]将微粒203固定在粘接垫202上时，具有在一个粘接垫202上固定多个微粒203的可能性。如果固定了多个，则不同种类的核酸片段的信息会相互重叠，导致无法进行正确的核酸分析。因此，一个粘接垫202上必须固定I个微粒203。为此，发明人反复进行各种条件下的固定实验，进行了深入研究，结果发现，当满足粘接垫202的直径d比微粒203的直径D小的条件时，能够在一个粘接垫202上固定I个微粒203。说明如果固定了与粘接垫202相比大小为同等或更大的微粒203，则未反应的线状分子会被所固定的微粒遮挡，从而无法与其它微粒反应。进而，继续进行了深入研究，结果表明:当微粒203的表面具有电荷时，微粒间静电斥力发挥作用，因而，即使在粘接垫202的直径d比微粒203的直径D大时，也能实现每个粘接垫上的固定微粒数为I个。因此阐明了:当微粒203的表面电荷少、静电斥力弱时，优选粘接垫202的直径d比微粒203的直径D小，当微粒203的表面电荷多、静电斥力大时，粘接垫202的直径d可以不必比微粒203的直径D小。[0063]美国专利公报第6859570号中公开了下述方法:在将光纤集束化的前端部的各光纤中设置孔(微小容器)，将带有用于捕捉解析对象生物分子的抗体的微粒放入各个孔中，用光纤按每个孔对荧光进行检测。本发明中，即使在使微粒排列成格子状时，也不需要这样的孔(微小容器)，如果将微粒放在孔中，反而会产生洗涤工序花费时间等问题。因此，在本发明中，优选如本实施例所记载的那样使用粘接垫在支撑基体上排列成格子状并进行固定的方法。
[0064]实施例3
[0065]使用图3说明本实施例的器件的制造方法。在平滑的支撑基体301上利用旋转涂布法涂覆电子束用正型抗蚀剂302。作为平滑的支撑基体，可以使用玻璃基板、蓝宝石基板、硅晶圆等。在制成器件后需要从与排列有微粒的面相反侧的背面照射激发光时，使用光透过性优异的石英基板、蓝宝石基板即可。作为电子束用正型抗蚀剂，可以列举例如聚甲基丙烯酸甲酯、ZEP-520A (日本瑞翁公司制)。利用基板上的标记的位置进行位置对齐后进行电子束直接曝光，在抗蚀剂中形成通孔。例如，形成直径15nm的通孔。虽然取决于平行处理所能够解析的核酸的分子数，但考虑到制造上的简便性、成品率的高低以及平行处理所能够解析的核酸的分子数，通孔以Iym左右的间距形成是适宜的。通孔形成区域也取决于平行处理所能够解析的核酸的分子数，但也大幅依赖于检测装置方的位置精度、位置分辨率。例如，Wlym间距构成反应位点(粘接垫)时，若将通孔形成区域设为1mmX Imm则可以形成100万个反应位点。形成通孔后，通过溅射使构成粘接垫303的材料如金、钛、镍、铝成膜。在使用玻璃基板、蓝宝石基板作为平滑的支撑基体、使用金、铝、镍作为粘接垫材料时，就强化基板材料和粘接垫材料间的粘接而言，优选引入钛、铬的薄膜。然后使线状分子304与粘接垫303反应。当粘接垫303为金、钛、铝、镍时，作为线状分子末端的官能团305，优选各自使用巯基、磷酸基、磷酸基、噻唑基。线状分子的相反侧的官能团306可以使用例如生物素。在使线状分子与粘接垫反应后，将抗蚀剂剥离。将抗蚀剂剥离后，对于形成了粘接垫以外的支撑基体表面实施防止非特异吸附的处理。为了实现防止对带荧光色素的核苷酸的吸附，用具有带负电荷的官能团的防止非特异吸附用分子307进行涂覆。例如，通过旋转涂布在表面涂布环氧硅烷并加热处理后，用弱酸性溶液(PH5~pH6左右)进行处理，从而使环氧基开环、在表面导入OH基，从而可以带来防止非特异吸附的效果。
[0066]优选预先用抗生物素蛋白309修饰微粒308表面。在使用金或钼微粒时，与氨基硫醇反应后与生物素-琥珀酰亚胺(Pierce公司制NHS-Biotin)反应，最后与链酶抗生物素蛋白反应，从而可以容易地进行抗生物素蛋白修饰。在使用金或钼以外的金属微粒时，通过在氧气气氛中进行加热处理对表面进行氧化处理后，与氨基硅烷反应，然后与生物素-琥珀酰亚胺(Pierce公司制NHS-Biotin)反应，最后与链酶抗生物素蛋白反应。由此，可以容易地对金属微粒表面进行抗生物素蛋白修饰。使用半导体微粒作为微粒时，可以使用市售的微粒。例如，可以使用直径为15~20nm的制品名为“Qdot (R)链酶抗生物素蛋白标记”(Invitrogen公司制)的产品。此外,还可以使用聚苯乙烯珠子作为微粒。例如，可以使用直径为 40nm 的制品名为 “FluoSpheres NeutrAvidinLabele” (Invitrogen 公司制)的制品。使用寡核苷酸作为捕捉分子310时，通过用生物素修饰末端而合成，可以容易地固定在微粒308上。通过将固定有捕捉分子310的微粒308固定到粘接垫303上，可以制造本实施例的核酸分析用器件。[0067]实施例4
[0068]本实施例中，使用图4说明仅固定有一分子捕捉分子的微粒的制造方法的一例、特别是在每个微粒上固定一分子捕捉分子的方法。预先使用于捕捉捕捉分子404的结合位点402结合在微粒401的表面。例如，可以使用链酶抗生物素蛋白作为结合位点，可以使用市售的链酶抗生物素蛋白包被微粒(Invitrogen公司制)作为微粒。捕捉分子404预先修饰有结合位点403。结合位点403选择容易与微粒401表面的结合位点402结合的位点。例如，使用所述的链酶抗生物素蛋白作为结合位点402时，使用生物素作为结合位点403。通过合成用结合位点403进行末端修饰的寡核苷酸，可以容易地合成末端具有结合位点403的捕捉分子404。然后，使微粒401和捕捉分子404反应，从而使捕捉分子404结合在微粒401上。对于在每个微粒401上固定一分子捕捉分子404，优选使单位体积中的捕捉分子404的分子数比微粒401的个数少。这是由于，当捕捉分子404与微粒401相比过量时，每个微粒401的捕捉分子数多于一分子的可能性高。发明人研究的结果是，如果使微粒401的数量比捕捉分子404的数量多10倍而进行反应，则大约90%的微粒401上未捕捉到捕捉分子404，约9%的微粒401上捕捉了一分子捕捉分子404。该结果与假设为泊松分布时的预测结果的一致性良好。因此，若仅收集捕捉到了捕捉分子404的微粒401，则收集的微粒401中，90%以上为仅捕捉了一分子捕捉分子404的微粒401。作为收集方法，例如可以使捕捉分子404与磁性微粒407结合并用磁体收集。准备具有与捕捉分子404的末端序列互补的序列且末端修饰有结合位点406的寡核苷酸405，将与结合位点406进行结合的结合位点408预先涂覆在磁性微粒407的表面。通过使用这样制作的磁性微粒407，可以以高达90%以上的比例分离、收集捕捉了一分子捕捉分子404的微粒401。为了将微粒401从磁性微粒407分离，可以使用例如使捕捉分子404和寡核苷酸405的双链分离的变性处理(高温处理)。分离后的微粒401可以使用实施例2中记载的方法固定在支撑基体上的规定的配置，从而可以制造本实施例的仅固定有一分子捕捉分子404的核酸分析用器件。
[0069]进而，为了提高仅捕捉了一分子捕捉分子的微粒的比例，使用电泳法是有效的。即，利用由微粒所捕捉的核酸的`分子数导致的微粒上的电荷量的不同，使微粒在捕捉了核酸的状态下在凝胶如琼脂糖中泳动，根据电荷量、即捕捉的核酸分子数的差异使电泳带型分离。未捕捉到核酸的微粒的移动距离最短，仅捕捉了一分子核酸分子的微粒在移动距离第二短的位置形成条带。因此，通过切出该条带可以以高纯度获得仅捕捉了一分子核酸分子的微粒。
[0070]实施例5
[0071]使用图5说明本实施例的器件的构成和解析方法。使标记有荧光色素503的捕捉用标签分子502结合于解析对象核酸片段501。结合可以使用连接反应、在预先在解析对象核酸片段501和捕捉用标签分子502中导入氨基、琥珀酰亚胺基等官能团的情况下官能团彼此的偶联反应。尤其是当解析对象核酸片段501为microRNA时，使捕捉用标签分子502为10-20碱基长度左右的RNA分子、使用T4RNA连接酶的方法是有效的。在使标记有荧光色素503的捕捉用标签分子502与解析对象核酸片段501结合后，与标记有荧光体505的核酸分子504进行杂交。核酸分子504是用于识别各解析对象核酸片段的分子，需要具有代表各基因序列的碱基序列。在进行序列设计时，需要通过各标记分子将作为核酸双链稳定性的指标的熔解温度限定在一定范围内。该范围越窄越优选，优选控制在规定温度± 3°C左右。此外，优选标记分子彼此的碱基序列的同源性低，优选将最高同源性控制在70%以下，更优选控制在60%以下。然后，使用实施例4中记载的方法，预先制作介由结合分子507将仅一分子捕捉分子506固定在微粒508上的微粒，添加该微粒进行杂交，从而可以制作下述微粒:在微粒508上，形成有一分子对的解析对象核酸片段501和标记有荧光体505的核酸分子504的杂合体。荧光体505可以如实施例1所述使用引入有荧光体的荧光珠子。
[0072]然后，将该形成有杂合体的微粒508固定在支撑基体510的预先形成的粘接垫509上。固定反应条件可以使用实施例1中记载的条件。最后，利用检测器511对荧光色素503和荧光体505的荧光进行测定，算出荧光色素503和每种荧光体505的亮点数。荧光色素503的亮点数对应于解析对象核酸片段501的总数，每种荧光体505的亮点数相当于各种解析对象核酸片段数。因此，通过算出两者的比值，可以算出各核酸片段数相对于解析对象总核酸片段数的比例。算出该比例在进行试样间的表达比较解析时尤其有用。例如，当对在健康人和特定疾病患者间表达量不同的标志基因进行探索时，需要找出两试样间表达量相等的基因并利用该表达量进行标准化，但实际上找出两试样间表达量相等的基因是非常困难的。非专利文献5中指出，尤其是在定量PCR中，这是一个大问题。而本实施例的方法由于能简便地对各试样分子算出相对于总体的比例，因此健康人和患者的比较也可以直接通过相对于全部试样分子数的比例来进行比较。这一点对于临床被检体中核酸分子的比较解析特别有用。
[0073]实施例6
[0074]使用图6说明本实施例的解析方法。使标记有荧光色素603的捕捉用标签分子602与解析对象核酸片段601结合。结合可以使用连接反应、在预先在解析对象核酸片段601和捕捉用标签分子602中导入氨基、琥珀酰亚胺基等官能团的情况下官能团彼此的偶联反应。尤其是当解析对象核酸片段601为microRNA时，使捕捉用标签分子602为10-20碱基长度左右的RNA分子、使用T4RNA连接酶的方法是有效的。使标记有荧光色素603的捕捉用标签分子602与解析对象核酸片段601结合后，与标记有突光体605的核酸分子604进行杂交。核酸分子604是用于识别各核酸片段的分子，需要具有代表各基因序列的碱基序列。在进行序列设计时，需要通过各标记分子将作为核酸双链稳定性的指标的熔解温度限定在一定范围内。该范围越窄越优选，优选控制在规定温度±3°C左右。此外，优选标记分子彼此的碱基序列的同源性低，优选将最高同源性控制在70%以下，更优选控制在60%以下。然后，使用实施例4中记载的方法，预先制作介由结合分子607将仅一分子捕捉分子606固定在微粒608上的微粒，添加该微粒进行杂交，从而可以制作下述微粒:在微粒608上，形成有一分子对的解析对象核酸片段601和标记有荧光体605的核酸分子604的杂合体。荧光体605可以如实施例1所述，使用引入有突光体的突光珠子。
[0075]然后，使该形成有杂合体的微粒608在流路609中流动并照射激发光，从而利用检测器610对荧光色素603的荧光和荧光体605的荧光强度进行测定。通过将流路609的直径设定为微粒608的直径的2倍以下，可以逐个识别微粒608并对荧光进行测定而不同时对多个荧光色素603的荧光进行测定,故而优选。对荧光色素603的荧光亮点数进行计数，获得相当于总核酸片段数的值。另一方面，仅在同时测定到荧光色素603的荧光和荧光体605的荧光时，对特定的荧光体的亮点进行计数，获得相当于各种核酸片段数的值。通过算出两者的比值，可以算出各试样分子数相对于总试样分子数的比例。本实施例的方法中，由于各基因的表达量是以表达量相对于全部基因的表达量的比值形式获得的，因此不同试样间、例如健康人和患者试样的比较也可以直接进行比较。这一点对于临床被检体中核酸分子的比较解析特别有用。进而，还可以对微粒608的散射光进行检测，通过与荧光测定组合来提高识别精度。
[0076]作为流路609，公开了圆形流路作为例子，但通过使用薄的平面流路作为流路609，可以对荧光色素603的荧光和荧光体605的荧光、以及微粒608的散射光进行2维检测，还可以实现检测速度和灵敏度的提高。
[0077]作为微粒608，可以使用由聚苯乙烯等高分子形成的微粒，此外，还可以使用在高分子中含有磁性金属粉体的磁性微粒。尤其在使用磁性微粒时，在使反应后的微粒608在流路609中流动之前，可以容易地将反应液中残存的未固定在微粒608上的未反应的标记有荧光色素603的捕捉用标签分子602、标记有荧光体605的核酸分子604去除，存在仅在同时测定到荧光色素603的荧光和荧光体605的荧光时对特定的荧光体的亮点进行计数时测定变得容易的显著优点，故而优选。
[0078]实施例7
[0079]本实施例中，参照图7说明使用了核酸分析用器件的核酸分析装置的优选构成的一个例子。
[0080]本实施例的核酸分析装置具备:对核酸分析用器件基板供给解析对象核酸试样溶液、带荧光标记的分子溶液和洗涤液的手段，用于在核酸分析用器件基板中进行杂交的温度调节手段，对核酸分析用器件基板照射光的手段，以及对带荧光标记的分子的荧光体的荧光进行测定的发光检测手段。更具体而言，将核酸分析用器件基板701置于温度调节板703上，在其上贴合设有流 路704的流路形成部件702，从而形成反应室。流路形成部件702可以使用例如PDMS (Polydimethylsiloxane,聚二甲基硅氧烷)。
[0081 ] 送液单元705连接在注入口上，保存在送液单元705中的解析对象核酸试样溶液、带荧光标记的分子溶液和洗涤液依次被供给至核酸分析用器件基板701。在解析对象核酸试样溶液和带荧光标记的分子溶液被供给至核酸分析用器件基板701后，在流路704中，溶液被保持在核酸分析用器件基板701上，利用温度调节板703，核酸分析用器件基板701上的反应液的温度被控制在30°C至80°C的温度范围，从而进行杂交。杂交后，由送液单元705将洗涤液供给至核酸分析用器件基板701，洗涤未反应物。
[0082]洗涤后进行荧光检测。激发光源可以根据所使用的荧光体的种类适当选择。例如，在使用Cy5、Cy5.5、Cy3作为荧光珠子中使用的荧光体时，激发光可以以532nm (YAG激光)、633nm (He-Ne激光)2种来应对。利用分色镜714将从YAG激光源(波长532nm、输出功率20mW)707和He-Ne激光源(波长633nm、输出功率20mW)713发射的激光调整为所述2激光同轴后，通过分色镜709引导至物镜706，照射在核酸分析用器件基板701上。带荧光标记的分子发出的荧光与激发光沿着同轴的光路逆向前进，通过物镜706聚光后通过分色镜709，通过成像透镜711在2维CXD相机712的感光面上成像。激发光的散射光通过滤光器710而被滤除。
[0083]如上所述，通过由送液单元、温度调节板、激发光源和荧光检测单元组成核酸分析装置，可以自动进行基于杂交的核酸分析，可以实现对现有技术的通量(through-put)的大
幅改善。[0084]附图标记说明
[0085]101，201，510 支撑基体
[0086]102，202，303，509 粘接垫
[0087]103，203，308，401，508，608 微粒
[0088]104，204，310，404，506，606 捕捉分子
[0089]105，507，607 结合分子
[0090]106，501，601解析对象核酸片段
[0091]107，502，602捕捉用标签分子
[0092]108带突光体标记的核酸分子
[0093]205,304 线状分子
[0094]206,207 官能团
[0095]301平滑的支撑基体
[0096]302电子束用正型抗蚀剂
[0097]305,306线状分子末端的官能团
[0098]307防止非特异吸附用分子
[0099]309抗生物素蛋白
[0100]402，403，406，408 结合位点
[0101]405寡核苷酸
[0102]407磁性微粒
[0103]503,603 荧光色素
[0104]504，604 核酸分子
[0105]505,605 荧光体
[0106]511,610 检测器
[0107]609,704 流路
[0108]701核酸分析用器件基板
[0109]702流路形成部件
[0110]703温度调节板
[0111]705送液单元
[0112]706 物镜
[0113]707 YAG 激光源
[0114]708 透镜
[0115]709，714 分色镜
[0116]710滤光器
[0117]711成像透镜
[0118]712 2 维 CCD 相机
[0119]713 He-Ne 激光源
【权利要求】
1.一种核酸分析方法，其特征在于，准备解析对象核酸片段组，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，对标记在发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测，对所述荧光体的个数进行计数。
2.—种核酸分析方法，其特征在于，准备解析对象核酸片段组各一分子，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，对标记在发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测。
3.—种核酸分析方法，其特征在于，包含:将解析对象核酸分子组各一分子固定在空间上分离的位置的工序，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸分子组杂交的工序，以及在所述杂交的工序后对所述荧光体的荧光进行测定的工序。
4.一种核酸分析方法，其特征在于，包含:将解析对象核酸分子组各一分子固定在支撑基体上的不同位置的工序，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述支撑基体上的核酸片段组杂交的工序，以及在所述杂交的工序后对所述荧光体的荧光进行测定的工序。
5.一种核酸分析方法，其特征在于，包含:将解析对象核酸片段组固定在微粒上使得每一个微粒上各固定所述核酸片段一分子的工序，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述微粒上的核酸片段杂交的工序，在所述杂交的工序后将所述微粒固定在支撑基体上的工序，以及对所述荧光体的荧光进行测定的工序。
6.根据权利要求1所述的核酸分析方法，其特征在于，解析对象核酸片段组在每个核酸试样未被壁隔离的状态下，全部核酸片段组与包含具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子的同一溶液反应，从而进行杂交。
7.根据权利要求1所述的核酸分析方法，其特征在于，所述荧光体标记是包含配合比例按照解析对象核酸的种类而不同的多种荧光体的微粒。
8.根据权利要求7所述的核酸分析方法，其特征在于，对于特定核酸品种以外的核酸品种使用同一荧光体标记，按照所述核酸分子对荧光亮点数进行计数并算出每个特定核酸品种的亮点数相对于总亮点数的比值，从而对所述每个特定核酸品种的存在量进行评价。
9.根据权利要求7所述的核酸分析方法，其特征在于，包含对解析对象核酸片段组赋予共通的荧光体标记、使其与用不同于所述荧光体的荧光体标记的具有已知碱基序列的核酸分子杂交的工序，通过算出前者和后者的荧光体的亮点数的比值，对所述解析对象核酸片段的每个种类的存在量进行评价。
10.一种核酸分析方法，其特征在于，准备各固定有解析对象核酸片段组一分子的微粒，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸片段组杂交，对标记在发生了杂交的所述核酸分子上的荧光体进行检测。
11.根据权利要求10所述的核酸分析方法，其特征在于，各固定有解析对象核酸片段组一分子的所述微粒为磁性微粒，所述荧光体标记为包含配合比例按照解析对象核酸的种类而不同的多种荧光体的微粒，杂交后将未发生杂交的所述被荧光体标记的核酸分子和所述磁性微粒分离，然后对标记在与所述磁性微粒上的核酸分子发生了杂交的核酸分子上的荧光体进行检测。
12.根据权利要求10所述的核酸分析方法，其特征在于，对于特定核酸品种以外的核酸品种使用同一荧光体标记，按照所述核酸分子对荧光亮点数进行计数并算出每个特定核酸品种的亮点数相对于总亮点数的比例，从而对所述每个特定核酸品种的存在量进行评价。
13.根据权利要求10所述的核酸分析方法，其特征在于，包含对解析对象核酸分子组赋予同一荧光体标记、使其与用不同于所述荧光体的荧光体标记的具有已知碱基序列的核酸分子杂交的工序，通过算出前者和后者的荧光亮点数的比值，对所述解析对象核酸的每个种类的存在量进行评价。
14.一种核酸分析装置，其特征在于，具备:将解析对象核酸分子组各一分子固定在空间上分离的位置的手段，使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述解析对象核酸分子组杂交的手段，以及在所述杂交的工序后对所述荧光体的荧光进行测定的手段。
【文档编号】C12M1/34GK103703146SQ201280034897
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年5月16日 优先权日:2011年7月19日
【发明者】斋藤俊郎, 滨崎孝伸, 高桥智, 前岛宗郎, 今井恭子, 今井一成, 田尾龙治 申请人:株式会社日立高新技术