工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法
【专利摘要】本发明提供了用于递送生物学部分(例如修饰的核酸)至细胞以诱导、减少或调节非人脊椎动物中蛋白质表达的制剂、组合物、试剂盒和方法。
【专利说明】工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年5月17日提交的美国系列号61/519，158的优先权，所述申请的内容通过引用方式完整并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及设计、制备、制造和/或配制用于非人类脊椎动物的修饰的核酸分子和/或增强的核酸分子的组合物、方法、过程、试剂盒和装置。
【背景技术】
[0004]向非人类脊椎动物、尤其家畜施用活性物质如治疗性和/或生物活性物质的方法和装置是本领域已知的，包括片剂、口服施用溶液剂和通过包括倾倒和点滴制剂的手段注射和局部施用。为了向反刍动物施用活性物质，已经改造制剂(如胶囊剂)以便定位并留在瘤胃中。这些制剂使治疗性和/或生物活性物质在不同时间范围内逐步释放至瘤胃中。这类制剂仅适于施用能够从胃肠道吸收的物质。然而，当治疗性和/或生物活性物质可能对动物有潜在毒性时，当施用药物如抗寄生药或抗生素可能造成动物对该治疗性和/或生物活性物质形成抗性或该治疗性和/或生物活性物质可能在动物中引起可能危害动物健康的生理状态改变时，这类制剂是不合乎需要的。
[0005]目前，在兽医应用中所施用的基于蛋白质的治疗药如生长因子、细胞因子和抗体已经带来涉及免疫原性、功效和成本的顾虑。例如，引入的DNA可能以某种频率整合入宿主细胞基因组DNA，导致宿主细胞基因组DNA的改变和/或破坏。或者，引入细胞的异源脱氧核糖核酸(DNA)(不论该异源DNA是否已经整合入染色体)可能被子代细胞或由后代遗传。
[0006]此外，假定正确递送并且没有损伤或整合入宿主基因组，在产生编码的蛋白质之前存在必须进行的多个步骤。一旦进入细胞，DNA必须转运到细胞核中，在此被转录成RNA。从DNA转录的RNA随后必须进入细胞质，在此被翻译成蛋白质。从施用的DNA至蛋白质的多个加工步骤不仅在功能性蛋白质产生之前产生滞后时间，而且每个步骤都可能产生差错和细胞损伤。此外，由于DNA往往进入细胞但不表达，或者不以合理的速度或浓度表达，难以在细胞中获得DNA。将DNA引入原代细胞或修饰的细胞系时，这可能尤其是个问题。
[0007]本发明通过提供基于核酸的化合物或多核苷酸(例如，修饰的mRNA或修饰的核酸)解决这些顾虑，其中所述化合物或多核苷酸编码目的多肽并且具有避免本领域中一个或多个问题的结构特征和/或化学特征，例如，可用于优化基于核酸的治疗药的配制和递送的特征，同时保留结构完整性和功能完整性、克服表达阈值、改善表达速率、半寿期和/或蛋白质浓度、优化蛋白质定位并且避免有害生物反应如免疫反应和/或降解途径。
[0008]发明概述
[0009]本文中描述了用于设计、制备、制造和/或配制修饰的核酸分子或增强的核酸分子的组合物、方法、过程、试剂盒和装置。
[0010]在以下说明书中叙述本发明的多种实施方案的详细内容。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从权利要求书中显而易见。
[0011]在一个实施方案中，本发明提供一种通过以下方式在有需要的非人类脊椎动物受试者的细胞、组织或体液中产生目的多肽的方法:施用包含编码该目的多肽的核酸的药物组合物。该药物组合物可以如但不限于在盐水和/或脂质制剂中配制。该制剂用途是，例如但不限于静脉内、肌内、皮下和局部途径。制剂可以按选自一日3次、一日2次、一日I次、每隔I日一次、每隔2日一次、每周、每两周、每三周或每四周和每月的方案施用。另外，该制剂可以通过多次施用法施用。
[0012]在一个实施方案中，非人类脊椎动物可以选自驼羊、爪哇野牛、野牛(bison)、骆马它、猫、牛、鹿、狗、驴、麋鹿、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲马它(llama)、小鼠、骡、猪、兔、大鼠、驯鹿、绵羊、水牛、牦牛、凯克鹦鹉(caiques)、金丝雀、牛背鹭、鸡、鸡尾鹦鹉、美冠鹦鹉、锥尾鹦哥(conure)、鸠鸽、鸭、雀、鹅、情侣鹦鹉、金刚鹦鹉、长尾鹦鹉、鹦鹉、短尾鹦鹉、鸽、青铜翅鹦鹉(Pionus)、玫瑰鹦鹉、火鸡、鬣蜥、蜥蜴、蛇、海龟、陆龟、蚓螈(caecilian)、蛙、蝾螈(newt)、鲷(salamander)和蟾蜍。在又一个实施方案中，非人类脊椎动物是小鼠,所述小鼠可以是转基因、敲入和/或敲除小鼠。
[0013]在一个实施方案中，目的多肽可以在体液，如但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耵聍、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、尿道球腺液或预射精液、汗、粪尿、毛发、泪、囊肿液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血中提供。
[0014]在一个实 施方案中，目的多肽可以在组织如但不限于肝、脾、肾、肺、心、肾周脂肪组织、胸腺和肌肉中提供。
[0015]由本发明涉及目的多肽可以包括但不限于胰岛素、猫干扰素、红细胞生成素、环孢菌素、胸腺肽β-4、精氨酸加压素、牛促生长素、催产素、葛瑞林、戈那瑞林(gonadorelin)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、马绒毛膜促性腺激素(ECG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素释放激素类似物(GRHa)、胰酶、Cre重组酶、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、干扰素(IFN) a、IFNP、IFN Y、IFNco、IFNt、肿瘤坏死因子(TNF) a、TNF β、TNF y、TRAIL、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 和 VEGF。
[0016]在一个实施方案中，药物组合物包含了带一个或多个修饰的核酸。所述修饰可以包括但不限于嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6，N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷(wyosine)、怀丁昔(wybutosine)、7_去氣_鸟昔、7_去氣-8-氣杂_鸟昔、6_硫代_鸟昔、6_硫代-7-去氮-鸟苷、6-硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基次黄嘌呤、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷和它们的组合。[0017]在一个实施方案中，本发明提供一种用于在有需要的非人类脊椎动物的细胞、组织和/或体液中产生第一目的多肽的试剂盒。在又一个实施方案中，所述试剂盒可以包含可编码第二目的多肽的第二核酸。第二目的多肽可以与第一目的多肽相同或不同。
[0018]本发明的具体实施方案
[0019]对于治疗药、诊断药、试剂并且对于生物测定法而言，人们很有兴趣将核酸(例如核糖核酸(RNA))在体内或离体递送于细胞内部，从而引起核酸的胞内翻译和所编码多肽的产生。特别重要的是向非人类脊椎动物递送非整合性核酸及其功能。
[0020]本文中提供了用于设计、制备、制造和/或配制核酸的组合物(包括药物组合物)和方法，其中所述核酸编码的多肽能够在非人类脊椎动物受试者中作为目的生物学部分发挥作用。如本文所述，这些核酸能够减少向其所引入的细胞群的天然免疫活性，从而提高蛋白质在该细胞群中的产生效率。
[0021]修饰的核酸
[0022]本发明提供了含有一个或多个修饰核苷的核酸(称作“修饰的核酸”)，包括RNA如mRNA，所述核酸具有有用特性，包括基本上不诱导向其中引入该mRNA的细胞的天然免疫反应。由于这些修饰的核酸增强蛋白质产生的效率、核酸的胞内保留作用和所接触的细胞的生存力，以及具有减低的免疫原性，因此具有这些特性的这类核酸在本文中称为“增强的核酸”。
[0023]术语“核酸”，在其最广泛的含义上，包括掺入或者能够掺入寡核苷酸链的任意化合物和/或物质。本发明使用的示例性核酸包括但不限于本文中详细描述的以下一种或多种:DNA、RNA (包括信使mRNA (mRNA))、其杂交分子、诱导RNAi的物质、RNAi物质、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化性DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适配体、载体等。
[0024]对核酸的修饰
[0025]本文提供了含有可翻译区和一个、二个或多于二个不同核苷修饰的修饰核酸。在一些实施方案中，与相应的未修饰核酸相比，修饰的核酸在向其中引入该核酸的细胞中显示出降解减少。示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)或其杂交分子。在优选的实施方案中，修饰的核酸包括信使RNA (mRNA)。如本文所述，本发明的核酸基本不诱导其中引入mRNA的细胞胞的天然免疫反应。
[0026]在一些实施方案中，修饰的核苷包括嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
[0027]在一些实施方案中，修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-ZebUlarine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。
[0028]在其他实施方案中，修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2.6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2.6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6，N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
[0029]在特定的实施方案中，修`饰的核苷是V -0-(1-硫代磷酸酯)_腺苷、5' -0-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5' -0-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5' -0-(1-硫代磷酸酯)_尿苷或5' -O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷。
[0030]
【权利要求】
1.一种在有需要的非人类脊椎动物受试者的细胞、组织或体液中产生目的多肽的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码所述目的多肽的核酸的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中药物组合物是制成制剂的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中制剂选自盐水制剂或脂质制剂。
4.根据权利要求2所述的方法，其中制剂是通过选自静脉内、肌内、皮下和局部的途径施用。
5.根据权利要求1所述的方法，其中药物组合物按选自一日3次、一日2次、一日I次、每隔I日I次、每隔2日I次、每周I次、每两周I次、每三周I次或每四周I次和每月I次的方案施用。
6.根据权利要求5所述的方法，其中制剂是通过多次施用而施用的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中非人类脊椎动物选自驼羊、爪哇野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、麋鹿、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲骑、小鼠、骤、猪、兔、大鼠、驯鹿、绵羊、水牛、牦牛、凯克鹦鹉、金丝雀、牛背鹭、鸡、鸡尾鹦鹉、美冠鹦鹉、锥尾鹦哥、鸠鸽、鸭、雀、鹅、情侣鹦鹉、金刚鹦鹉、长尾鹦鹉、鹦鹉、短尾鹦鹉、鸽、青铜翅鹦鹉、玫瑰鹦鹉、火鸡、鬣蜥、蜥蜴、蛇、海龟、陆龟、蝴螺、蛙、蝾螈、鲵和蟾蜍。
8.根据权利要求 8所述的方法，其中非人类脊椎动物是小鼠。
9.根据权利要求9所述的方法，其中小鼠选自转基因小鼠、敲入小鼠和敲除小鼠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中体液选自外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耵聍、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、尿道球腺液或预射精液、汗、粪尿、毛发、泪、囊肿液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血。
11.根据权利要求1所述的方法，其中组织选自肝、脾、肾、肺、心、肾周脂肪组织、胸腺和肌肉。
12.根据权利要求1所述的方法，其中目的多肽选自胰岛素、猫干扰素、红细胞生成素、环孢菌素、胸腺肽β _4、精氨酸加压素、牛促生长素、催产素、葛瑞林、戈那瑞林、孕马血清促性腺激素(PMSG)、马绒毛膜促性腺激素(ECG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素释放激素类似物(GRHa)、胰酶、Cre重组酶、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、白介素(IL)_1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL_18、干扰素(IFN) a , IFN β、IFN Y、IFNco、IFN τ、肿瘤坏死因子(TNF) a、TNF β、TNF Y、TRAIL、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 和 VEGF。
13.根据权利要求12所述的方法，其中目的多肽选自胰岛素、猫干扰素、红细胞生成素、环孢菌素、胸腺肽β _4、精氨酸加压素、牛促生长素、催产素、葛瑞林、戈那瑞林、孕马血清促性腺激素(PMSG)、马绒毛膜促性腺激素(ECG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素释放激素类似物(GRHa)、胰酶和Cre重组酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中核酸包含选自以下的一个或多个修饰:嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5_ 氮杂-2-硫代-zebularine、2_ 硫代-zebularine、2_ 甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2，6- 二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6, N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷、7-去氮-鸟苷、7-去氮-8-氮杂-鸟苷、6_硫代-鸟苷、6_硫代-7-去氮-鸟苷、6_硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基次黄嘌呤、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、和N2，N2- 二甲基-6-硫代-鸟苷和它们的组合。
15.一种用于在有需要的非人类脊椎动物受试者的细胞、组织或体液中产生第一目的多肽的试剂盒，所述试剂盒包含编码所述第一目的多肽的第一核酸。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，还包含第二核酸，所述第二核酸包含编码第二目的多肽的核酸。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中第二目的多肽不同于第一目的多肽。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，其中非人类脊椎动物选自驼羊、爪哇野牛、野牛、骆马它、猫、牛、鹿、狗、5户、麋鹿、大额牛、山羊、膝鼠、马、美洲骑、大鼠、骤、猪、兔、小鼠、驯鹿、绵羊、水牛、牦牛、凯克鹦鹉、金丝雀、牛背鹭、鸡、鸡尾鹦鹉、美冠鹦鹉、锥尾鹦哥、鸠鸽、鸭、雀、鹅、情侣鹦鹉、金刚鹦鹉、长尾鹦鹉、鹦鹉、短尾鹦鹉、鸽、青铜翅鹦鹉、玫瑰鹦鹉、火鸡、鬣蜥、蜥蜴、蛇、海龟、陆龟、蝴螺、娃、蝾螺、鲷和蟾蜍。
19.根据权利要求15所述的试剂盒，其中目的多肽选自胰岛素、猫干扰素、红细胞生成素、环孢菌素、胸腺肽β _4、精氨酸加压素、牛促生长素、催产素、葛瑞林、戈那瑞林、孕马血清促性腺激素(PMSG)、马绒毛膜促性腺激素(ECG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素释放激素类似物(GRHa)、胰酶、Cre重组酶、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、白介素(IL)_1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL_18、干扰素(IFN) a , IFN β、IFN Y、IFNco、IFN τ、肿瘤坏死因子(TNF) α、TNF β、TNF GAMAM、TRAIL、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 和 VEGF。
20.根据权利要求15所述的试剂盒，其中核酸包含选自以下的一个或多个修饰:嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5_ 氮杂-2-硫代-zebularine、2_ 硫代-zebularine、2_ 甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2，6- 二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6, N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷、7-去氮-鸟苷、7-去氮-8-氮杂-鸟苷、6_硫代-鸟苷、6_硫代-7-去氮-鸟苷、6_硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基次黄嘌呤、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基_8_氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2- 二甲基-6-硫代-鸟苷以及它们的组合。
【文档编号】C12P21/06GK103687957SQ201280035252
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年5月16日 优先权日:2011年5月17日
【发明者】努巴尔·B·埃非扬, 格雷戈里·J·西兹克维克兹, 斯蒂芬·邦塞尔 申请人:现代治疗公司