从丝状菌生产有用代谢产物的方法
【专利摘要】本发明涉及从丝状菌生产莽草酸等有用代谢产物的方法。通过包括以下工序的生产方法，能够得到有用代谢产物，该工序为通过抑制丝状菌的生长，特别是通过赋予比570nm短的中心波长的光刺激，使菌丝中的有用代谢产物的含量增加。
【专利说明】从丝状菌生产有用代谢产物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从丝状菌生产有用代谢产物的方法。更详细地涉及通过在丝状菌培养时施加特定波长的光刺激等，使菌丝中的莽草酸等代谢产物含量增加的方法。
【背景技术】
[0002]莽草酸是植物、微生物中包含的各种芳香族化合物共同的生物合成中间体，对植物、微生物而言是极其重要的物质。另外，该莽草酸是作为新型流行性感冒治疗药的奥司他韦(Oseltamivir) (TAMIFLU/达菲)(注册商标)的制造原料使用之外，还可以作为多种医药品、农药制造原料使用的极其有用的化合物。
[0003]莽草酸现在主要通过从八角茴香(八角)中提取、精制而制造。但是，从天然物的提取法的情况下，其成分含量有不固定等的问题，因此研究着能够稳定地进行制造的方法。例如，作为合成的制造方法，报告了从奎尼酸使用维尔斯梅尔试剂(Vilsmeier reagent) >选择性地脱水制造莽草酸衍生物的方法(专利文献I)，从间苯二甲酸制造二氨基莽草酸的方法(专利文献2)，从呋喃制造二氨基莽草酸的方法(专利文献3)等。这些方法都是莽草酸衍生物的制造方法，为了制造目标莽草酸还需要进一步的工序。
[0004]另外，作为从奎尼酸的制造方法，报告了使用来自醋酸菌的莽草酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，以2阶段制造莽草酸的方法(专利文献4)，使奎尼酸成为奎尼酸酯的缩醛体后，再开始制造莽草酸的方法(专利文献5)等。作为利用微生物的制造方法，报告了使用柠檬酸杆菌属微生物的制造方法(专利文献6和7)等，还报告了以在咖啡渣中包含的绿原酸为原料，使具有绿原酸分解酶的微生物作为微生物催化剂使其反应而制造莽草酸的方法(专利文献8)等。另外，作为利用发酵法的制造方法，还已知使用大肠杆菌由发酵使其生成的方法(非专利文献I)。
[0005]另一方面，目前为止，本发明的发明人报告了作为担子菌的一种的平菇的菌体生长被蓝色光抑制、以及对蓝色光显示基因表达应答(非专利文献2和3)。但是，完全不知道平菇通过受到蓝色光刺激，生长被抑制，由此会产生怎样的代谢产物。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本特许第3641384号公报
[0009]专利文献2:日本特开2001-354635号公报
[0010]专利文献3:日本特开2001-288152号公报
[0011]专利文献4:日本特开2007-300809号公报
[0012]专利文献5:日本特开平11-349583号公报
[0013]专利文献6:日本特开2000-78967号公报
[0014]专利文献7:日本特开2002-281993号公报
[0015]专利文献8:日本特开2009-201473号公报
[0016] 非专利文献[0017]非专利文献I:B.A.Bohm, Chemical Reviews, 65，435-466 (1965)
[0018]非专利文献2:Nakano et al., Biosci Biotechnol Biochem.2010 ；74 (10):2160-5
[0019]非专利文献3 =Nakano et al.，J.Light&Vis.Env.，35(1):90-942011
【发明内容】
[0020]发明所要解决的课题
[0021]以往的莽草酸的制造方法，因为在制造中都需要几个阶段的工序，所以，在制造中必需要长时间和高成本，存在不适合大量生产的问题。本发明的发明人在为了解决该问题而进行的研究中，获得了通过对丝状菌进行光刺激可以生产有用代谢产物的发现，即，通过用蓝色光刺激平菇等丝状菌，菌丝体中的莽草酸量飞跃性地增加，除此以外，来自用蓝色光刺激后的菌体中的有机层的提取物显示抗肿瘤作用等，进一步进行深入研究，结果完成了本发明。[0022]用于解决课题的方法
[0023]即，本发明涉及以下的丝状菌的有用代谢产物及其生产方法。
[0024][I] 一种有用代谢产物的生产方法，其包括通过抑制丝状菌的生长，使菌丝中的有用代谢产物的含量增加的生长抑制工序。
[0025][2]在[I]中记载的有用代谢产物的生产方法，其中，生长抑制工序通过对丝状菌赋予比570nm短的中心波长的光刺激，抑制该丝状菌的生长。
[0026][3]在[I]或[2]中记载的方法，其包括从丝状菌中提取有用代谢产物的工序。
[0027][4]在[I]~[3]的任意一项中记载的方法，其中，丝状菌为担子菌。
[0028][5]在[4]中记载的方法，其中，担子菌为平菇属。
[0029][6]在[2]~[5]的任意一项中记载的方法，其中，光刺激为蓝色光的光刺激。
[0030][7]在[2]~[6]的任意一项中记载的方法,其中，以IOymolnT2S4以上照射光刺激。
[0031][8]在[2]~[7]的任意一项中记载的方法，其中，以断续的照射给予光刺激。
[0032][9]在[I]~[8]的任意一项中记载的方法，其中，有用代谢产物为莽草酸。
[0033][10]在[I]~[8]的任意一项中记载的方法，其中，有用代谢产物为抗肿瘤性物质。
[0034][11]由[I]~[10]的任意一项中记载的方法生产得到的有用代谢产物。
[0035]发明的效果
[0036]本发明的有用代谢产物的生产方法，能够从丝状菌有效地生产在医药等中所使用的生理活性物质和成为医药品原料的前体等。通过本发明，例如，能够从丝状菌有效地生产
莽草酸。
[0037]本发明的莽草酸的制造方法，只通过一阶段的工序，就能够使丝状菌的菌丝中的莽草酸含量飞跃性地增加、积累。本发明的方法因为使用市售的廉价材料，能够高效率地得到莽草酸，所以，能够以低成本且短时间制造莽草酸，可以稳定地供给莽草酸。
[0038]本发明的莽草酸的制造方法是利用由光产生的菌类的生长抑制机理的方法，推断通过对暗处培养的丝状菌给予光刺激，在菌丝中生物合成莽草酸后，阻断芳香族氨基酸生物合成路径，使莽草酸在菌丝中积累，由此能够使莽草酸含量飞跃性地增加。
[0039]另外，也能够以得到的莽草酸为起始物质，得到新的产物。即，本发明的芳香族氨基酸生物合成路径的阻断机理不仅得到莽草酸，而且通过加上再使其进一步反应的工序，能够提供用于得到以莽草酸为前体所合成的其它物质的手段。通过在药剂等中应用这些被合成的物质，能够贡献于医疗领域。
[0040]此外，本发明的有用代谢产物的生产方法，还能够生产抗肿瘤性物质等生理活性物质。由本发明生产的抗肿瘤性物质，能够有效地抑制参与癌转移的FABP5基因的表达，即使微量，抗肿瘤效果也高，能够提供安全的抗肿瘤剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1是表示照射的光的波长与平菇菌丝生长的关系的图。
[0042]图2是表示照射的蓝色光的强度与平菇菌丝生长的关系的图。
[0043]图3是表示断续地进行蓝色光照射时的平菇菌丝生长变化的图。
[0044]图4是表示通过有机成分添加的细胞数的观察结果的照片图。
[0045]图5是表示利用半定量PCR法的β -actin基因的表达解析结果的图。
[0046]图6是表示利用半定量PCR法的c-myc基因的表达解析结果的图。
[0047]图7是表示利用半定量PCR法的Smad4基因的表达解析结果的图。
[0048]图8是表示利用定量PCR法的FABP5基因的表达解析结果的图。
【具体实施方式】
[0049]在本发明的有用代谢产物的生产方法中使用的丝状菌，可以使用担子菌类、子囊菌类、接合菌类、变形菌类等，但特别优选担子菌类。在担子菌中包含平菇属和香菇属等，具体地包含糖皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)、刺芳:侧耳菌(Pleurotus eryngii)、埃杜香恭(Lentinula edodes)等。在本发明中使用的担子菌优选平燕属,特别优选平燕。
[0050]本发明的有用代谢产物的生产方法，可以包括通过抑制丝状菌的生长而使菌丝中的有用代谢产物的含量增加的生长抑制工序。这样的生长抑制工序，优选通过赋予光刺激，抑制丝状菌的生长。
[0051]光刺激优选为单色可见光，包含紫色、蓝紫色、蓝色、蓝绿色、绿色和黄绿色的可见光，优选为蓝色光，但也可以为近紫外线(例如UVA等)。另外，也可以包括在光照射前进行丝状菌培养的培养工序。赋予光刺激时的丝状菌的状态没有特别限定，菌丝体、子实体的任意一种都能够适用，在使用菌丝体时能够缩短培养时间。
[0052]光的波长希望是比570nm短的中心波长，优选为400~545nm，更优选为450~495nm,更加优选为460~480nm。另外，也可以为315~400nm。
[0053]光量子束密度希望为10μ molm-2 s-1以上，没有特别限定，可以设为10~1000 μ moIm 2S \优选为30~500 μ moIm 2S \更优选为50~200 μ moIm 2S \更加优选为90 ~120 μ mo Im 2S、
[0054]照射时间没有特别限定，但希望一次照射3小时以上，优选为12~120小时，更优选为24~60小时。另外，照射优选连续进行，但也可以反复暗处培养和明处培养(照射)。例如，可以每1、2、3、4或5天反复暗处培养和明处培养(照射)。[0055]作为光照射装置，没有特别限定，可以使用产生单色可见光和近紫外线等光刺激的装置。例如，可以使用LED光照射装置。
[0056]本发明的有用代谢产物的生产方法，可以包括从丝状菌提取有用代谢产物的工序。提取物可以使用利用有机溶剂分离为有机层和水层的方法，代谢产物的提取溶剂没有特别限定，可以使用甲醇、水、氯仿和二氯甲烷等。其它的也可以组合使用醋酸甲酯、醋酸乙酯等酯、丙酮等酮、二乙醚等醚、二甲苯、甲苯、苯等芳香族烃、己烷等脂肪族烃等有机溶剂以及甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等醇等。典型地，在有机层中含有较多的抗肿瘤性物质，在水层中含有较多的莽草酸。
[0057]本发明的有用代谢产物的提取方法，例如，作为溶剂，可以使用甲醇、氯仿和水。具体而言，在菌体中加入甲醇，破碎菌体后，相对甲醇，添加等量的氯仿和2/5量的水，进行离心分离等，能够分离为水层和有机层。对于得到的水层和有机层，可以进一步进行离心分离和超滤等。典型地，从水层能够回收莽草酸等的有用代谢产物，从有机层能够回收本发明的抗肿瘤性物质。
[0058]因此，本发明的有用代谢产物的生产方法包括有用代谢产物的提取工序，其包括菌体的破碎工序、离心分离工序、使用有机溶剂等的提取工序以及分离和干燥等的精制工序。
[0059]本发明的有用代谢产物包含一次代谢产物和二次代谢产物，包含莽草酸等芳香族化合物的中间体和抗肿瘤物质等生理活性物质等。
[0060]本发明的一个方面涉及莽草酸的制造方法。
[0061]在本发明的一个方式中，本发明的莽草酸的制造方法，其特征在于，包括通过抑制丝状菌的生长，使菌丝中莽草酸含量增加的生长抑制工序。
[0062]另外，其特征在于，上述丝状菌为菌丝体。
[0063]另外，其特征在于，上述生长抑制工序为通过对上述丝状菌赋予光刺激来抑制该丝状菌生长的工序。
[0064]另外，其特征在于，上述光刺激中所使用的光为波长比570nm短的光。
[0065]另外，其特征在于，上述光刺激中所使用的光为蓝色光。
[0066]另外，其特征在于，作为上述生长抑制工序的前工序，具备进行丝状菌培养的培养工序。
[0067]本发明的莽草酸的制造方法，基于如下发现:在植物、菌类的生长速度与形态形成的控制以及在含有功能性营养成分量的增加中，光的刺激扮演着重要角色，其中，如果对营养生长期的平菇菌丝照射特定波长以下的光，则菌丝生长就被显著抑制。另外还基于如下发现:该抑制在被照射的光是比绿色光波长短的光时、特别是为蓝色光时显著出现，其抑制程度依赖于被照射的光的光量子束密度。
[0068]本发明的莽草酸的制造方法，如上所述，是利用由光产生的菌类生长抑制机理的制造方法，推断通过对暗处培养的丝状菌给予光刺激，在菌丝中莽草酸被生物合成后，阻断芳香族氨基酸生物合成路径，使莽草酸在菌丝中积累，由此能够使莽草酸含量飞跃性地增加。
[0069]作为植物的蓝色光受体，发现有隐花色素和向光素。关于菌类的蓝色光受体，充分研究了子囊菌的粗糙链孢霉具有的WCl和WC2，可以认为参与类胡萝卜素的合成和生物钟的光控制。另外，作为WCl和WC2的同源基因，在被分类为与平菇相同的担子菌的灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea)中报告了 dstl,在接合菌中报告了须霉的madA。这样,编码蓝色光受体的基因，广泛保存于植物和菌类，因此可以认为蓝色光是在生物体控制系统中扮演着非常重要角色的光。关于菌类的光受体或由光受体的作用产生的芳香族氨基酸生物合成路径的阻断、由此产生的生长抑制作用，能够作为发明的新构成或作为新的发明，在本发明的内部或外部适用。
[0070]在本发明的莽草酸的制造方法中，对于使莽草酸含量增加的菌类没有特别限制，只要是具有光受体和莽草酸路径的菌类，则任意一种都能够适用。具体而言，可以在平菇、香菇、其它的子囊菌类、担子菌类、接合菌类、变形菌类等中适用，但特别优选担子菌类。另外，赋予光刺激时的丝状菌的状态没有特别限制，菌丝体、子实体的任意一种都能够适用。其中，使用菌丝体时，因为可以缩短培养时间而优选。
[0071]在本发明的莽草酸的制造方法中，关于照射的光的光源没有特别限制，只要是可以得到特定波长的光的光源，任意一种都能够适用。其中，LED消耗电能低而优选。另外，关于光的波长，没有特别限制，只要能够得到菌类的生长抑制作用的波长的光，则任意一种都能够适用。具体而言，可以适用可见光、红外线、紫外线、其它的电磁波，优选为单色可见光和近紫外线。此外，由温度、声音等光以外的刺激，也具有能够得到菌类的生长抑制作用的可能性。其中，生长抑制作用由光的波长为495nm至570nm范围的绿色光确认，当从380nm至495nm范围的蓝色光时，因为效果显著而优选。
[0072]本发明的一个方面涉及抗肿瘤性物质的制造方法。
[0073]本发明的抗肿瘤性物质的制造方法可以包括从丝状菌中提取有用代谢产物的工序。提取物可以使用利用有机溶剂分离为有机层和水层的方法，代谢产物的提取溶剂没有特别限定，可以使用甲醇、水、氯仿和二氯甲烷等。此外，可以组合使用醋酸甲酯、醋酸乙酯等酯，丙酮等酮，二乙醚等醚，二甲苯、甲苯、苯等芳香族烃，己烷等脂肪族烃等的有机溶剂及甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等醇。本发明的抗肿瘤性物质典型地可以从有机层较多提取。
[0074]本发明的抗肿瘤性物质具有癌细胞的增殖抑制活性或细胞凋亡诱导活性。另外，可以有效地抑制FABP5基因的表达，即使微量也具有优异的抗肿瘤活性。
实施例
[0075]通过以下的实施例详细说明本发明的有用代谢产物的生产方法，但本发明不受各实施例限定。
[0076]〈实施例1>
[0077](使用设备)
[0078]在本实施例中作为植物培养装置使用的设备是CCS公司生产的ELUX-1096LED植物培养装置。在本实施例中，将其设定在设定温度20°C，进行平菇中的莽草酸的制造实验。作为对平菇菌丝进行照射的光的光源，使用CCS公司生产的LED光源面板ISL系列305X302。另外，在发光强度的测定中，在L1-COR公司生产的L1-205Light-Meter上安装该公司生产的LI_190QuantumSensor或PPSystem International公司生产的660/730nmSKRl IOSensor 来使用。
[0079] (接种源菌丝体的制备)[0080]在Pyrex (注册商标)玻璃培养皿(内径90mm)内配制的2.5%琼脂浓度改良MA培养基(组成:2%麦芽提取物、2%葡萄糖、0.1%蛋白胨)的中央，接种作为供试菌准备的市售菌种的平菇KH-3株(株式会社千曲化成生产)，将其在温度设定为20°C的暗处放置，进行培养。由该操作，在培养皿内，菌丝体菌落呈同心圆状地生长，因此，从其外周部分，使用穿孔器(Cork borer)切出直径约6mm的圆盘状,将其作为本实施例的接种源使用。
[0081 ](进行光照射的样品的制备)
[0082]在Pyrex (注册商标)玻璃培养皿(内径90_)内配制的2.5%琼脂浓度GPY培养基(组成:5%葡萄糖、2.5%多聚蛋白胨、2.5%酵母提取物)的中央，接种如上所述准备的接种源，将其在温度设定为20°C的暗处放置，进行培养。在本实施例中的实验中，将直径生长到6mm的菌落和直径生长到20mm的菌落作为样品使用。
[0083](光的波长的变化实验)
[0084]改变对菌丝体照射的光的波长，进行确认光波长对菌丝生长施加的影响的实验。对如上所述准备的样品，照射将发光强度设定为95 μ Hi0InT2iT1的蓝色、绿色、红色、远红色的各波长的单色光，观察、比较各菌丝体菌落的生长。生长变化的追踪为如下评价方法:约每24小时测定菌丝体菌落的直径最大值和最小值，求出其平均值，将该值作为菌丝体菌落生长量变化。另外，各单色可见光的中心波长，蓝色光为470nm，绿色光为525nm，红色光为660nm,远红色光为735nm。
[0085]图1表示对样品照射各波长的光并评价其生长得到的结果的图。从图中可以确认，在照射了红色光和远红色光的样品中，菌丝体菌落以与没有照射光而在暗处培养时相同的速度生长。另外，可以确认在照射了绿色光的样品中，菌丝的生长显著变慢，通过蓝色光的照射，菌丝的生长完全停止。由此可以确认，平菇菌丝的生长抑制在比绿色光波长短的情况下得到确认，在蓝色光时是特别显著的现象。
[0086](蓝色光的发光强度的变化实验)
[0087]改变对菌丝体照射的蓝色光的发光强度，进行确认光强度对菌丝生长的影响的实验。对如上所述准备的样品，照射将发光强度设定为6 μ mollies'll μ moln^s'26 μ molm_2s_1>51 μ molm_2s_1和105 μ mo I IrTiV1的蓝色光并且培养I周，观察、比较各菌丝体菌落的生长。评价方法与上述实验相同。
[0088]图2表示使照射的蓝色光的发光强度变化，评价菌丝体菌落的生长得到的结果的图。从图中可以确认，照射的蓝色光的发光强度越大，则菌丝体菌落的生长越被抑制。另外，可以确认照射光的发光强度为105 μ Hi0InT2s-1的样品中，生长完全停止。另外，可以确认在任意样品中，从实验开始经过3天以后，生长速度达到一定，稳定。由此，可以确认由蓝色光照射产生的菌丝的生长抑制效果依赖于照射的光的发光强度，而且其抑制效果持续地稳定。
[0089](蓝色光的断续照射实验)
[0090]进行评价交替反复蓝色光照射和暗处保存的断续照射，对于菌丝体菌落生长施加的影响的实验。对如上所述准备的样品，照射3天设定为ΙΟδμ molπ-2^1的蓝色光，此后3天进行暗处培养，将其交替反复21天。评价方法与上述实验相同。
[0091]图3表示交替反复蓝色光照射和暗处培养、评价菌丝体菌落生长得到的结果。从图中可以确认，每3天反复蓝色光照射和暗处培养时，由光照射产生的菌丝体生长被抑制的状态和由中断光照射产生的菌丝体菌落生长的恢复就交替出现。可以认为这是由于蓝色光的信号被传递，从而参与平菇的菌丝生长的基因的表达和抑制被反复诱导的缘故。
[0092](莽草酸的提取方法)
[0093]为了评价通过上述实验生长的平菇菌丝中的莽草酸的含量，进行菌丝体含有代谢产物的提取。提取方法如下。
[0094]1.从通过对菌丝体的蓝色光照射产生的生长抑制实验而生长到规定大小的菌丝体菌落的培养皿中，使用刮器(Sumitomo Bakelite C0., Ltd.生产，Sumilon MS-93100)(注册商标)采集培养基表面的菌丝体。在本实施例中，使菌落的直径生长到60mm。
[0095]I1.在上述I工序采集的试样50mg中，冰冷下加入500 μ L包含50 μ M内部标准物质的甲醇溶液，使用台式破碎机(BMS公司生产，BMS-M10N21)将其以1500rpm、120秒X3次的条件破碎。
[0096]In.在上述II工序中破碎的破碎溶液中添加500 μ L氯仿和200 μ LMill1-Q水，搅拌混合，将其以2300Xg、4°C、120分钟的条件进行离心分离。
[0097]IV.在上述III工序中离心分离的溶液中，将水层在超滤管(MILLP0RE公司生产，UltraFree MC UFC3LCC离心式过滤单元5kD)中只移取400 μ LX I支。
[0098]V.将在上述IV工 序中移取的溶液再以9100 X g、4°C、120分钟的条件进行离心分离，进行超滤。
[0099]V1.使上述V工序的滤液干燥固化，再将其溶解于25 μ L Mill1-Q水，将其作为在生长实验中得到的菌丝体的评价用试样。
[0100](莽草酸的定量)
[0101]对于由上述方法准备的各试样，定量解析含有的莽草酸。解析中使用的设备使用毛细管电泳_飞行时间型质谱(AgilentTechnologies公司生产,Agilent CE-TOFMSSystem)，将其设定为阴离子模式，进行各试样的阴离子性代谢物质分析。就解析中使用的试样而言，对于将平燕在暗处培养的0M-1、对与OM-1同样的起始试样照射12小时蓝色光的0M-2、同样地照射36小时蓝色光的0M-3这3种试样进行解析。
[0102][表1]
[0103]
检体名称~1m-1 1m-2|om-3
含量 μ g/g 2.3 Π6 ￥0
[0104]表1表示由上述方法进行莽草酸的定量解析的结果。含量的计算通过在使用CE-TOFMS测得的浓度(nmol/g)上乘以莽草酸的分子量174.15而进行。从表中可以确认，随着对试样照射的蓝色光的照射时间变长,试样中的莽草酸的含量增加。由此可以确认本发明的菌丝体中的莽草酸的增加量与蓝色光照射的照射时间有较强的相关性。
[0105]另外，可以确认本发明的方法对于使菌丝体中的莽草酸含量增加有效。
[0106]<实施例2 >
[0107](培养条件和有机层成分的提取方法)
[0108]使用与实施例1中记载的莽草酸的提取方法同样的方法，从有机层中提取有机层成分。[0109](提取物对癌细胞增殖的影响)
[0110]对于得到的有机层成分研究对癌细胞增殖的效果。
[0111]用添加有10% FBS (MP Biomedicals公司生产)的RPMI培养基(SIGMA公司生产)培养人前列腺癌细胞PC-3 (从Japan Health Sciences Foundation (财团法人日本健康科学振兴财团)获得)。使用如上所述制备的有机层成分，由细胞数的显微镜观察解析对PC-3细胞的细胞增殖的影响(图4)。
[0112]以最终浓度为0.2% (v/v)和2% (v/v)的方式在培养基中添加以乙醇(EtOH)溶解的从在暗处(Oh)和蓝色光(48小时)照射条件下培养的菌丝体中提取的有机层成分，在培养48小时后，用显微镜观察细胞数。
[0113]如图4所示，相比于对照(图4A)，通过添加来自暗处的样品，可见依赖于浓度的细胞数的减少(图4B、C)。另外，即使在添加蓝色光照射样品中也同样地可见细胞数的减少，但是相比于来自暗处的样品，蓝色光照射样品的细胞增殖抑制效果更加显著(图4D、E)。
[0114](被提取物处理过的癌细胞的利用半定量RT-PCR的基因表达解析)[0115](I)试样的制备
[0116]将培养的PC-3细胞在6孔板(NUNC(注册商标MULTIDISH))中培养到各孔达到50%。对其使用上述制备的有机层成分，进行利用半定量RT-PCR的基因表达解析。以最终浓度为0.2% (v/v)和2% (v/v)的方式在培养基中添加以乙醇(EtOH)溶解的有机层成分，培养48小时后进行半定量RT-PCR解析。
[0117]培养后，除去培养基，以PBS清洗后，添加500 μ L TRIzol，进行吹打，回收RNA。
[0118]在回收的RNA中添加100 μ L氯仿进行混合，室温放置2~3分钟后，进行离心分离(13000rpm、15分钟、4°C )，回收上清液。在该上清液中添加等量异丙醇,颠倒混合,室温放置10分钟后，尚心分尚(13000rpm> 10分钟、4°C )，将上清液倾析。
[0119]在其中添加70%乙醇，清洗团块(pellet)后，离心分离(13000rpm、5分钟、4°C )，将上清液倾析，室温干燥团块后,添加DEPC水20 μ L,将溶解物作为试样。
[0120](2) RT-PCR
[0121 ] 使用ReverTra Ace (注册商标)试剂盒(Τ0Υ0Β0公司生产)和2 X GoTaq (注册商标)Green Master Mix (Promega 公司生产)，进行 RT-PCR。
[0122]首先，用DEPC水将在上述⑴中制备的试样稀释成为250ng/l.! L。将使用其设为表2的组成的液体，用热循环仪以如下的工序I~3处理(工序1:30°C、10分钟，工序2:42°C>60 分钟、工序 3:95°C、5 分钟),合成 cDNA(互补 DNA, complementary DNA)。
[0123][表2]
【权利要求】
1.一种有用代谢产物的生产方法，其特征在于: 包括通过抑制丝状菌的生长，使菌丝中的有用代谢产物的含量增加的生长抑制工序。
2.如权利要求1所述的有用代谢产物的生产方法，其特征在于: 生长抑制工序通过对丝状菌赋予比570nm短的中心波长的光刺激，抑制该丝状菌的生长。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于: 包括从丝状菌中提取有用代谢产物的工序。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法，其特征在于: 丝状菌为担子菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于: 担子菌为平菇属。
6.如权利要求2~5中任一项所述的方法,其特征在于: 光刺激为蓝色光的光刺激。
7.如权利要求2~6中任一项所述的方法,其特征在于: 光刺激以IOymolnriV1以上照射。
8.如权利要求2~7中任一项所述的方法，其特征在于: 光刺激以断续的照射给予。
9.如权利要求1~8中任一项所述的方法，其特征在于: 有用代谢产物为莽草酸。
10.如权利要求1~8中任一项所述的方法，其特征在于: 有用代谢产物为抗肿瘤性物质。
11.一种有用代谢产物，其特征在于: 其是由权利要求1~1 0中任一项所述的方法生产的。
【文档编号】C12P7/42GK103930556SQ201280054117
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年8月6日 优先权日:2011年9月7日
【发明者】小嶋政信, 藤井博 申请人:国立大学法人信州大学