具有受限制的免疫球蛋白重链的小鼠的制作方法

具有受限制的免疫球蛋白重链的小鼠的制作方法
【专利摘要】本发明提供了具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其中所述基因座的特征为具有单一多态性人源VH基因区段、多个人源DH基因区段和多个JH基因区段。本发明提供了制备与抗原(例如病毒抗原)结合的抗体序列的方法，包括使用所关注的抗原免疫小鼠，其中所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链基因座包含单一人源VH基因区段、多个人源DH基因区段和多个JH基因区段。
【专利说明】具有受限制的免疫球蛋白重链的小鼠
发明领域
[0001]基因修饰免疫球蛋白重链可变(V)区基因座(或在转基因中)以从受限数量的免疫球蛋白重链可变(Vh)区段(或单一 Vh区段)和/或其变体中制备抗体的非人动物。具有来源于单一免疫球蛋白重链可变基因区段例如人源免疫球蛋白Vh1_69基因区段或人源Vh1_2基因区段的重链可变结构域的非人动物。在非人动物中制备用于与病原体包括人病原体结合的抗体序列的方法。
【背景技术】
[0002]非人动物例如小鼠己经被基因修饰为制备抗体序列方法中的有用工具，其中抗体序列用于抗体依赖的人体治疗。具有人源化可变区基因座(例如VinD1^P Jh基因以及'和叉基因)的小鼠可以用于生成在抗体治疗中使用的同源重链和轻链可变结构域。可以获得其他小鼠用于生成具有同源重链和轻链的全人源抗体。
[0003]人体抗体治疗是基于针对某些预定抗原的所需特性设计的。使用预定抗原免疫人源化小鼠，并且使用经免疫的小鼠生成抗体群以便从中鉴定具有所需结合特性的高亲和性同源重链和轻链可变结构域。一些人源化小鼠，例如仅在内源性小鼠基因座的可变区人源化的小鼠，产生在特征和数量上与野生型小鼠B细胞群类似的B细胞群。结果，在这些用于筛选抗体的小鼠中获得了极为大量和多样性的B细胞群。这些B细胞群反映出大量不同免疫球蛋白的重排，并可以从中鉴定具有最为需要特性的重链和轻链可变结构域。 [0004]但并不是所有抗原激发的免疫应答均显示出来自各种可变(V)区段的非常大量的重排。也就是说，人体对某些抗原的体液免疫应答明显受到了限制。这种限制反映为对B细胞的克隆选择，即选择那些仅表达某些对特定抗体具有非常高的亲和性和特异性结合的V区段的B细胞。这种抗原中的一些具有临床意义，即大量公知的人类病原体。有一种假设，在人免疫应答中表达的V区段是这样一种V区段，当其与人源D和人源J区段结合，较之在针对该抗原的人源抗体应答中未观察到的随机选择的V区段，更有可能生成有用的高亲和性抗体。
[0005]根据一种假说，几千年以来的自然选择己经选择出了最有效的基础，根据其可以设计出用于中和人类病原体最有效的武器——克隆选定的V区段。本领域中需要更多和更优越的用于结合和/或中和抗原(如上文所述的病原体)的抗体。需要更加迅速地由所选定的V区段生成有用的序列，选定的V区段包括多态性和/或体细胞突变选定的V区段，以及更加迅速地生成有用的B细胞群，其具有带多种D和J区段的V区段的重排，包括该重排的体细胞突变版本，并且特别是具有独特的和有用的CDR3的重排。需要一种生物系统例如非人动物(例如小鼠、大鼠、家兔等)，其能够从预定的V区段生成与例如现有经修饰的动物所能达到的相比更大数量和种类的具有治疗用途的抗体可变区序列。需要一种改造过的生物系统，其针对来源于受限制的、预定V区段的克隆选择抗体的可变序列具有定型的体液免疫系统，所述预定的V区段包括但不限于同源的人源重链和轻链可变结构域，所述系统可用于生产针对所选抗原(包括某些人类病原体)的人源抗体依赖的治疗剂。[0006]在本领域中需要一种能够中和病毒抗原例如HIV和HCV的治疗性抗体，包括抗原特异性抗体，其含有来源于单一人源可变区段的重链，以及由所选定的治疗性抗体序列生产多样性来源抗体的系统。还需要用于制备有用抗体的进一步的方法和非人动物，所述抗体包括来源于单一人源Vh区段并且具有多样性CDR序列集合的重链库，并且包括表达同源的人源轻链可变结构域的这种重链。还需要用于选择基于免疫球蛋白的结合蛋白的CDR的方法，该结合蛋白提供更多的供选择的结合蛋白的多样性，以及更多的免疫球蛋白可变结构域的多样性，其包括用于生成体细胞突变并克隆选择的免疫球蛋白可变结构域的组合物和方法，这些免疫球蛋白可变结构域可以在例如制备人用治疗剂中使用。
[0007]发明概沭
[0008]本申请提供了一种基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座包含具有有限数量的不同重链可变 区基因区段(即V基因、Vh基因、Vh基因区段或V基因区段)，例如不超过一个、两个或三个不同的V基因；或者不超过一个V基因区段家族成员以例如单一拷贝或多个拷贝中和/或包含一种或多种多态性存在。
[0009]本申请提供了一种基因座，所述基因座能够重排并且形成编码重链可变结构域的基因，所述基因来源于受限制的(例如是单一 Vh基因区段或选自多个单一 Vh基因区段的多态性变体)Vh基因库。本申请提供了一种经修饰的免疫球蛋白基因座，其包括了包含人源免疫球蛋白序列的基因座，例如可操作地与人源或者(或人源/非人源嵌合)非人源免疫球蛋白恒定序列(并且与例如D和/或J区段可操作地连接)连接的人源V区段。本申请提供了一种经修饰的基因座，所述基因座包括单一 Vh基因区段的多个拷贝，其中一个或多个拷贝可以包含多态性的变体。提供了一种经修饰的基因座，所述基因座包括单一 Vh区段的多个拷贝，其可操作地与一个或多个D区段以及一个或多个J区段连接，其可操作地与非人源免疫球蛋白恒定序列例如小鼠或大鼠序列连接。本申请还提供了一种包含这种人源化基因座的非人动物。
[0010]本申请提供了一种非人动物，所述动物具有降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性(即具有有限数量的重链可变基因区段，或具有受限制的重链可变基因库)，其中所述降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性表征为存在不超过一个或者不超过两个重链可变基因区段，并且其中所存在的重链可变基因可操作地与人源或非人源恒定区序列连接。
[0011]本申请提供了一种非人动物，所述动物具有降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性(例如单一 Vh基因区段，或者具有作为单一 Vh基因区段多态性变体的有限数量的Vh基因区段)，其中所述降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性表征为存在单一 Vh基因区段或者多个作为单一 Vh基因区段多态性形式的Vh基因区段(例如在人体内与高拷贝数和/或多态性相关的Vh基因区段)，并且其中所存在的重链可变基因可操作地与人源或非人源恒定区序列连接。在多种实施方式中，所述存在的重链可变基因可操作地与非人动物种系中的一个或多个D和/或一个或多个J基因区段连接。
[0012]本申请提供了一种非人动物，所述动物包含免疫球蛋白重链可变基因座(例如在内源性非人动物重链可变基因座的转基因上或作为其插入或取代)，其中免疫球蛋白重链可变基因座包括可操作地与D和/或J基因区段连接的单一 Vh区段。在多种实施方式中，在所述非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变基因基因座上，所述单一 ％基因区段可操作地与一个或多个D和/或一个或多个J基因区段连接。
[0013]本申请提供了一种非人动物，所述动物在其免疫球蛋白重链可变区基因座被修饰以缺失全部或基本上全部(例如全部功能性区段，或几乎全部功能性区段)内源性免疫球蛋白Vh区段并且在所述非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变区基因座上包含可操作地与D和J区段或者J区段连接的人源Vh1-69区段(或者人源Vh1-2区段)。
[0014]本申请还提供了一种非人动物，所述动物在其免疫球蛋白重链可变区基因座被修饰以使其内源性可变区基因组不能重排形成包含内源性可变区基因区段的功能性重链；其中在所述非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变区基因座包含可操作地与D和J区段或者J区段连接的单一人源可变基因区段(人源Vh1-2或人源Vh1-69基因区段)。
[0015]本申请提供了一种非人动物，所述动物包含与人源或非人源恒定区序列可操作地连接的具有有限数量的(例如不超过一个或不超过两个)重链基因区段。在一个实施方式中，所述与恒定区序列连接的不超过一个或不超过两个重链基因区段在转基因上，例如在不同于内源性重链基因座的位置上。
[0016]本申请提供了一种在非人动物中制备人源免疫球蛋白序列的方法。在多种实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列来源于免疫球蛋白V序列库，其基本上由单一人源V区段例如νΗ1-69或νΗ1-2以及一个或多个D和J区段或者一个或多个J区段组成。本申请提供了一种在非人动物、组织和细胞中制备人源免疫球蛋白序列的方法，其中所述人源免疫球蛋白序列与病原体结合。
[0017]本申请提供了一种制备特征为具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的方法，其中所述限制针对免疫球蛋白Vh基因区段的数量。在多种方面，所述限制是指一个或不超过两个，或者单一 Vh基因家族成员(例如一个或多个Vh等位基因、其变体或其多态性变体)。在多种方面，所述重链基因座进一步包含一个或多个Dh基因区段和一个或多个Jh基因区段。在多种方面，所述VinD1^P Jh基因区段是人源的。在多种方面，所述VinD1^P Jh基因区段可操作地与非人源恒定区(例如IgM和/或IgG)连接。在多种方面，所述恒定区是小鼠或大鼠恒定区。
[0018]在一个方面，本申请提供了一种制备具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的方法，包括将如本申请所述的核酸构建体引入小鼠胚胎干(ES)细胞，并且分离或鉴定包含所述核酸构建体的小鼠ES细胞。
[0019]在一个实施方式中，所述核酸构建体包含单一人源Vh基因区段、一个或多个人源Dh基因区段以及一个或多个人源Jh基因区段。在一个实施方式中，所述核酸构建体包含一个或多个位点特异性重组位点(例如1xP或Frt位点)。
[0020]在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的靶向载体、核酸序列或细胞制备的小鼠。在不同实施方式中，所述靶向载体、核酸序列或细胞包含含有与非人源恒定基因可操作地连接的单一人源Vh基因区段(或其多态性变体)、一个或多个人源Dh基因区段以及一个或多个人源Jh基因区段的DNA序列。
[0021]在一个方面，本申请提供了一种制备包含受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的方法，包括使用人基因组序列取代小鼠免疫球蛋白重链基因座，所述人基因组序列包含单一人源Vh基因区段(或其多态性变体)、一个或多个人源Dh基因区段以及一个或多个人源JH基因区段，其中所述人源Vh、Dh和Jh基因区段能够重排形成含有可操作地与非人源恒定区连接的人源可变结构域的嵌合重链。在一个实施方式中，所述非人源恒定区是小鼠或大鼠恒定区。
[0022]在多种方面，所述非人动物是啮齿动物。在不同的方面，所述啮齿动物是小鼠和/或大鼠。
[0023]在一个方面，本申请提供了一种经修饰的免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含重链V区段库，该库针对V区段的一致性是受限制的，并且所述基因座包含一个或多个D区段和一个或多个J区段，或者一个或多个J区段。在一个实施方式中，所述重链V区段是人源区段。在一个实施方式中，所述一个或多个D区段是人源D区段。在一个实施方式中，所述一个或多个J区段是人源J区段。在一个实施方式中，所述一个或多个D区段和一个或多个J区段是人源D和人源J区段。
[0024]在一个实施方式中，所述经修饰的基因座是非人源基因座。在一个实施方式中，所述非人源基因座具有至少一个人源免疫球蛋白序列被修饰的。
[0025]在一个实施方式中，所述限制是针对一种V区段家族成员的。在一个实施方式中，所述一种V区段家族成员存在于两个或多个拷贝中。在一个实施方式中，所述一种V区段家族成员以两种或多种变体形式存在(例如V区段家族成员的两种或多种多态性形式)。在一个实施方式中，所述一种V区段是一个人源V区段家族成员。在一个实施方式中，所述一种V区段家族成员存在于在针对该变体的人群中所观察到的多种变体中。在一个实施方式中，所述V区段家族成员选自表1。在一个实施方式中，所述V区段家族成员存在于所示的多种变体中，对于各V区段而言，其存在于在由I个等位基因至表1的右栏所显示的等位基因数量的多个等位基 因中。
[0026]在一个实施方式中，所述限制是针对人源VH1_69基因区段的。在一个实施方式中，所述人源Vh1-69基因区段存在于两个或多个拷贝中。在一个实施方式中，所述人源Vh1-69基因区段以两种或多种变体形式存在(例如人源Vh1-69基因的两种或多种多态性形式)。在一个实施方式中，所述人源Vh1-69基因区段存在于在具有人源Vh1-69基因区段的人群中所观察到的多种变体中。在一个实施方式中，所述人源VHl-69基因区段选自表2。在一个实施方式中，所述人源VHl-69基因区段存在于所示的多种变体中，对于各￥111-69基因区段而言，在由一个等位基因至表2所示等位基因数量的多个等位基因中。
[0027]在一个实施方式中，所述限制针对人源Vh1_2基因区段。在一个实施方式中，所述人源Vh1-2基因区段存在于两个或多个拷贝中。在一个实施方式中，所述人源Vh1-2基因区段以两种或多种变体形式存在(例如人源Vh1-2基因的两种或多种多态性形式)。在一个实施方式中，所述人源VH1_2基因区段存在于在具有人源VHl-2基因区段的人群中所观察到的多种变体中。在一个实施方式中，所述人源VHl-2基因区段选自表3。在一个实施方式中，所述人源％1-2基因区段存在于所示的多种变体中，对于各VHl-2基因区段而言，在由一个等位基因至表2所示等位基因数量的多个等位基因中。
[0028]在一个方面，本申请提供了一种重链免疫球蛋白基因座，其包含单一功能性人源V区段。在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段选自Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、νΗ1-18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、VH3-16、Vh3-20、VH3_21、VH3_23、VH3_30、VH3_30_3、VH3_30_5、VH3_33、VH3_35、VH3_38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3_49、Vh3_53、Vh3_64、Vh3_66、Vh3_72、Vh3_73、Vh3_74、Vh4_4、Vh4_28、Vh4-30-1、Vh4-30-2、VH4_30_4、VH4_31、VH4_34、VH4_39、VH4_59、VH4_61、VH5_51、VH6_ 1、VH7_4_ I和Vh7-81区段。在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段是Vh1-69区段；在一个特定实施方式中，在人群中发现的所述单一功能性人源V区段存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12或13中多态性形式。在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段是Vh1-2区段；在一个特定实施方式中，在人群中发现的所述单一功能性人源V区段存在1、2、3、4或5种多态性形式。
[0029]在一个实施方式中，所述重链免疫球蛋白基因座是非人动物的一个经修饰的基因座。在一个实施方式中，所述经修饰的非人源免疫球蛋白重链基因座在非人动物中存在于野生型非人动物基因组中相应的未经修饰的非人源基因座的位置。在一个实施方式中，所述经修饰的非人源免疫球蛋白重链基因座存在于非人动物的转基因上。
[0030]在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段是Vh1_69基因区段。在一个实施方式中，所述VHl-69基因区段包含SEQ ID NO:340在一个实施方式中，所述VH1_69基因区段来源于SEQ ID NO:34。在一个实施方式中，所述VH1_69基因区段与SEQ ID NO:34具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。
[0031]在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段由SEQ ID NO:34所述的核苷酸序列编码。
[0032]在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段是VH1_2基因区段。在一个实施方式中，所述VHl-2基因区段包含SEQ ID NO:60o在一个实施方式中，所述VH1_2基因区段来源于SEQ ID NO:60o在一个实施方式中，所述VH1_2基因区段与SEQ ID NO:60具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的一致性。
[0033]在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段由SEQ ID NO:60所述的核苷酸序列编码。
[0034] 在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段可操作地与一个或多个D区段及一个或多个J区段，或者一个或多个J区段连接。在一个实施方式中，所述V区段与一个或多个D和/或J区段可操作地与免疫球蛋白重链恒定区序列连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区序列选自CH1、铰链、CH2、CH3序列及其组合。在一个实施方式中，所述CH1、铰链、Ch2、Ch3或其组合均是非人源内源性恒定序列。在一个实施方式中，所述CH1、铰链、Ch2、Ch3或其组合中的至少一个是人源序列。在一个特定实施方式中，所述ChI和/或铰链是人源序列。
[0035]在一个方面，本申请提供了一种经修饰的内源性非人源免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含用单一人源V基因区段(或者以多种多态性形式或拷贝数存在的单一人源V基因区段)取代全部功能性V基因区段，其中所述非人源免疫球蛋白重链基因座不能重排形成来源于单一人源V基因区段(或者多态性形式或拷贝中的一种)以外的V基因区段的重链可变基因。
[0036]在一个实施方式中，所述单一人源V基因区段是Vh1_69。在一个实施方式中，所述单一人源V基因区段是νΗ1-2。
[0037]在一个实施方式中，所述基因组包含至少一个人源或非人源Dh基因区段，以及一个人源或非人源Jh基因区段。在一个特定实施方式中，所述基因座包含人源Dh基因区段和人源Jh基因区段。在一个特定实施方式中，所述基因座包含人源Jh基因区段。在另一个特定实施方式中，所述基因座包含人源％1-69基因区段(以单一拷贝或不同多态性形式的多重拷贝形式存在)、全部功能性人源Dh基因区段以及全部功能性人源Jh基因区段。在另一个特定实施方式中，所述基因座包含人源％1-2基因区段(以单一拷贝或不同多态性形式的多重拷贝形式存在)、全部功能性人源Dh基因区段以及全部功能性人源Jh基因区段。在一个实施方式中，在内源性小鼠重链基因座位置所述人源V、D和J基因区段(或者V和J基因区段)可操作地与小鼠恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述小鼠重链基因座包含野生型小鼠免疫球蛋白恒定区序列库。
[0038]在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物单一功能性免疫球蛋白重链V基因区段选自人源Vh1_2、Vh1_3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1_24、Vh1_45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-2 1、VH3-23、VH3_30、VH3_30_3、VH3_30_5、VH3_33、VH3_35、VH3_38、VH3_43、VH3_48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3_66、Vh3_72、Vh3_73、Vh3_74、Vh4_4、Vh4_28、Vh4_30_1、Vh4_30_2、Vh4-30-4、Vh4-31、Vh4-34、Vh4_39、Vh4_59、Vh4_61、Vh5_51、Vh6_1、Vh7_4_1 和 VH7_81 基因区段。在一个实施方式中，所述重链V基因区段是人源％1-69基因区段。在一个实施方式中，所述重链V基因区段是人源Vh1-2基因区段。
[0039]在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物包含单一功能性人源Vh基因区段(以单一拷贝或不同多态性形式的多重拷贝形式存在)，并且其中所述非人动物基本上不能形成缺乏单一功能性人源Vh基因区段(或者多态性形式或拷贝中的一种)的重排的免疫球蛋白重链可变结构域基因。
[0040]在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中仅在非人动物中表达的免疫球蛋白重链可变区来源于选自人源Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1_24、Vh1_45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-2 1、VH3-23、VH3_30、VH3_30_3、VH3_30_5、VH3_33、VH3_35、VH3_38、VH3_43、VH3_48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3_66、Vh3_72、Vh3_73、Vh3_74、Vh4_4、Vh4_28、Vh4_30_1、Vh4_30_2、Vh4-30-4、Vh4-31、Vh4-34、Vh4_39、Vh4_59、Vh4_61、Vh5_51、Vh6_1、Vh7_4_1 和 VH7_81 基因区段的人源区段之一。在一个实施方式中，所述人源区段是Vh1-69区段。在一个实施方式中，所述人源区段是Vh1-2区段。在一个实施方式中，由小鼠表达的唯一的免疫球蛋白重链可变区来源于单一 V区段家族成员，并且在一个实施方式中，所述唯一的免疫球蛋白重链可变区来源于单一 V区段家族成员的多态性变体。
[0041]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的免疫球蛋白重链V基因区段库的非人动物，其中所述非人动物进一步包含一个或多个人源免疫球蛋白K轻链可变区段(Vk)0在一个实施方式中，所述一个或多个V K区段可操作地与一个或多个人源J区段连接。在一个特定实施方式中，所述J区段是人源J K区段。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不表达免疫球蛋白λ轻链。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不包含功能性人源或功能性内源性免疫球蛋白λ轻链可变基因座。
[0042]在一个实施方式中,所述非人动物是哨齿动物。在一个实施方式中，所述哨齿动物是小鼠。
[0043]在一个实施方式中，所述非人动物包含用一个或多个功能性人源V K区段取代内源性非人源免疫球蛋白Vk基因座的全部或基本上全部功能性内源性VK区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Vk区段。
[0044]在一个实施方式中，所述非人动物包含在内源性非人免疫球蛋白Vk基因座用选白 Vk 4-1、Vk 5-2, Vk 7-3, Vk 2-4, Vk 1-5、Vk 1-6、Vk 3-7, Vk 1-8、Vk 1-9、Vk 2-10,Vk 3-11、Vk 1-12、Vk 1-13、Vk 2-14, Vk 3-15, Vk 卜16、Vk 1-17、Vk 2-18, Vk 2-19,Vk 3-20、Vk 6-21、Vk 1-22, Vk 1-23, Vk 2-24、Vk 3-25、Vk 2-26、Vk 1-27, Vk 2-28、Vk 2-29、Vk 2-30、Vk 3-31、Vk 1-32, Vk 1-33, Vk 3-34、Vk 卜35、Vk 2-36、Vk 1-37,Vk 2-38,V K 1_39、V κ 2_40及其组合的人源V κ基因区段取代全部或基本上全部的功能性内源性V K基因区段。
[0045]在一个实施方式中，所述非人动物包含在内源性非人源免疫球蛋白Jk基因座用一个或多个功能性人源免疫球蛋白Jk区段取代全部或基本上全部的功能性内源性非人源免疫球蛋白Jk区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代是使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Jk区段。
[0046]在一个实施方式中，所述非人动物包含在内源性非人源免疫球蛋白Jk基因座用选自Jk 1、J K 2、Jk 3、Jk 4、Jk 5及其组合的人源Jk基因区段取代全部或基本上全部的功能性内源性非人源免疫球蛋白Jk基因区段。
[0047]在一个特定实施方式中，所述非人动物包含免疫球蛋白重链可变区基因座，其包含基本上由单一 V区段和/或其多态性变体组成的V区段库。在一个实施方式中，所述单一免疫球蛋白重链V区段是人源νΗ1-69区段，并且所述非人动物进一步包含用全部功能性人源Dh区段取代全部功能性非人源Dh区段，并且进一步包含用全部功能性人源Jh区段取代全部功能性非人源Jh区段，并且其中所述免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地与人源或非人源恒定区基因序列连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因序列是内源性非人源恒定区基因序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物在非人免疫球蛋白重链基因座重排区段以形成编码包含人源Vh1-69序列、人源Dh序列、人源Jh序列和小鼠恒定区序列的重链可变区的基因。
[0048]在一个特定实施方式中，所述非人动物包含免疫球蛋白重链可变区基因座，其包含基本上由单一 V区段和/或其多态性变体组成的V区段库。在一个实施方式中，所述单一免疫球蛋白重链V区段是人源νΗ1-2区段，并且所述非人动物进一步包含用全部功能性人源Dh区段取代全部功能性非人源Dh区段，并且进一步包含用全部功能性人源Jh区段取代全部功能性非人源Jh区段，并且其中所述免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地与人源或非人源恒定区基因序列连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因序列是内源性非人源恒定区基因序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物在非人免疫球蛋白重链基因座重排区段以形成编码包含人源Vh1-2序列、人源Dh序列、人源Jh序列和小鼠恒定区序列的重链可变区的基因。
[0049]在一个实施方式中，本申请提供了一种包含所述重排的基因的B细胞。在一个特定实施方式中，所述B细胞来源于用所关注的抗原免疫的所述小鼠，并且所述B细胞编码与所关注的抗原特异性结合的抗体。在一个实施方式中，所关注的抗原是病原体。在一个特定实施方式中，所述病原体选自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在一个特定实施方式中，所述B细胞编码体细胞突变的、高亲和性(例如约KT9Kd或更低)抗体，所述抗体包含与所关注抗原特异性结合的人源轻链可变区(例如人源K轻链可变区)。
[0050]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的免疫球蛋白重链V区段库的非人动物，其中所述非人动物包含一个或多个人源化λ轻链可变(V λ)区段。在一个实施方式中，所述一个或多个人源Vλ区段可操作地与一个或多个人源J区段连接。在一个特定实施方式中，所述J区段是人源JX区段。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不表达K轻链。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不包含功能性人源或非人源K轻链可变基因座。
[0051]在一个实施方式中，所述非人动物包含用一个或多个功能性人源免疫球蛋白V λ区段取代全部或基本上全部的功能性非人源免疫球蛋白V λ区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代使用全部或基本上全部的功能性人源免疫球蛋白νλ区段。
[0052]在一个实施方式中，所述非人动物包含用人源λ轻链基因座簇A的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段。在一个特定实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇A的片段包含人源V λ基因区段V λ 3-27至V λ 3-1。
[0053]在一个实施方式中，所述非人动物包含用人源λ轻链基因座簇B的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段。在一个特定实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇B的片段包含人源V λ基因区段νλ 5-52至νλ 1-40。
[0054]在一个实施方式中，所述非人动物包含用人源λ轻链基因座簇A的片段和簇B的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段，其中所述取代所得的产物包含人源νλ基因区段νλ5-52至νλ3-1。 [0055]在一个实施方式中，所述非人动物包含用至少12个人源V λ基因区段、至少28个人源V λ基因区段或至少40个人源V λ基因区段取代全部或基本上全部功能性非人源V λ区段。
[0056]在一个实施方式中，所述非人动物包含用一个或多个功能性人源免疫球蛋白JA基因区段取代全部或基本上全部功能性非人源免疫球蛋白JX基因区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白JX基因区段。在不同实施方式中，所述功能性人源JA基因区段包括JA 1、JA2、JA3和JA7。
[0057]在一个特定实施方式中，所述非人动物包含包括单一 Vh区段的免疫球蛋白重链可变(Vh)区的基因座，其中所述单+Vh区段是人源Vh1-69区段或人源Vh1-2区段，并且其进一步包含用全部功能性人源Dh区段取代全部功能性非人源Dh区段，以及进一步包含用全部功能性人源Jh区段取代全部功能性非人源Jh区段，并且其中所述Vh区基因座可操作地与人源或非人源恒定区基因序列连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因序列是非人源恒定区基因序列，例如内源性非人源恒定基因序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物在非人源免疫球蛋白重链基因座重排区段以形成编码包含Vh1-69序列(或人源Vh1-2序列)、人源Dh序列、人源Jh序列和内源性非人源恒定区序列的人源免疫球蛋白重链可变区的基因。
[0058]在一个实施方式中，本申请提供了一种包含所述重排基因的B细胞。在一个特定实施方式中，所述B细胞来源于己使用所关注的抗原免疫的所述非人动物，并且所述B细胞编码与所关注的抗原特异性结合的抗体。在一个实施方式中，所述抗原是选自配体、细胞表面受体和胞内蛋白的人源蛋白。在一个实施方式中，所关注的抗原是病原体。在一个特定实施方式中，所述病原体选自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在一个特定实施方式中，所述B细胞编码体细胞突变的、高亲和性(例如约KT9Kd或更低)抗体，所述抗体包含与所关注抗原特异性结合的人源轻链可变区(例如人源λ轻链可变区)。
[0059]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的免疫球蛋白Vh区段库的非人动物，其中所述非人动物在转基 因上包含人源Vh1-69区段(或人源Vh1-2区段)，其中所述人源Vh1-69区段可操作地在转基因上与人源或非人源Dh区段和/或人源或非人源J区段连接，并且所述转基因进一步包含人源或非人源恒定区基因，或者人源/非人源嵌合恒定区(例如CH1、铰链、Ch2、Ch3或其组合，其中至少一个序列是非人源的，例如选自铰链、Ch2和Ch3和/或铰链)。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠或大鼠并且所述非人源D、J和/或恒定区基因是小鼠或大鼠基因或者嵌合的人源/小鼠或大鼠基因。
[0060]在一个实施方式中，所述非人动物包含转基因，所述转基因包含免疫球蛋白轻链可变区基因座，其包含一个或多个人源免疫球蛋白νλ基因区段和基因区段，或者一个或多个人源免疫球蛋白V K基因区段和J K基因区段，以及人源免疫球蛋白K或λ轻链恒定区，以使得所述转基因在非人动物中重排形成重排的免疫球蛋白K或λ轻链基因。在多种实施方式中，所述人源V K和】!^基因区段是此处所描述的那些。在多种实施方式中，所述人源V λ和基因区段是此处所描述的那些。
[0061]在一个特定实施方式中，所述非人动物包含具有免疫球蛋白重链可变基因座的转基因，所述免疫球蛋白重链可变基因座包含单一 V区段，其为人源νΗ1-69区段(或人源Vh1-2区段)、一个或多个人源D区段、一个或多个人源J区段，并且人源恒定基因可操作地与所述重链可变基因座连接，以使得所述小鼠由转基因表达来源于Vh1-69区段(或Vh1-2区段)的全人源抗体。在一个实施方式中，所述非人动物不包含功能性内源免疫球蛋白重链可变区基因座。在一个特定实施方式中，所述非人动物包含非功能性内源免疫球蛋白重链可变区基因座，所述基因座包含内源性非人源D1^P /或内源性非人源Jh区段缺失，以使得所述非人动物不能重排内源性免疫球蛋白重链可变区基因座以形成重排的非人源抗体基因。在一个特定实施方式中，所述非人动物包含可操作地与内源性小鼠重链恒定区连接的开关序列的缺失。在一个特定实施方式中，所述开关序列是非人源(例如小鼠)μ开关序列。在另一个实施方式中，所述非人动物进一步包含功能性内源轻链可变基因座的缺失，所述功能性内源轻链可变基因座选自免疫球蛋白K基因座和免疫球蛋白λ基因座。在一个特定实施方式中，所述非人动物包含J K和/或JX序列缺失，以使得所述非人动物不能重排内源性非人源免疫球蛋白K轻链和/或内源性非人源免疫球蛋白λ轻链可变区以形成重排的内源性非人源免疫球蛋白K轻链和/或重排的内源性非人源免疫球蛋白λ轻链基因。
[0062]在一个实施方式中，所述非人动物包含内源性非人源免疫球蛋白K轻链序列的缺失，其导致内源性非人源免疫球蛋白K轻链的功能性敲除。在一个实施方式中，所述非人动物包含内源性非人源免疫球蛋白λ轻链序列的缺失，其导致内源性非人源免疫球蛋白λ轻链的功能性敲除。
[0063]在一个方面，所述非人动物包含被功能性沉默的内源免疫球蛋白重链可变基因基因座，并且包含受限制的人源重链可变基因区段库(例如不超过一个或者不超过两个)。在一个实施方式中，所述功能性沉默包含内源性非人源重链可变基因基因座的修饰，所述修饰选自缺失、插入、反转及其组合。
[0064]在一个方面，本申请提供了一种啮齿动物，所述啮齿动物包含免疫球蛋白Vh库，其来源于不超过一个人源Vh区段或其一个或多个多态性变体，和来源于选自一个或多个D区段库的D区段以及来源于来自一个或多个J区段库的J区段。在一个实施方式中，所述啮齿动物重排所述人源Vh区段、人源D区段和人源J区段并且形成与人源或啮齿动物恒定区序列可操作地连接的重排的人源重链序列。在一个实施方式中，所述人源和/或啮齿动物恒定区序列选自CH1、铰链、Ch2、Ch3及其组合。在一个实施方式中，所述啮齿动物表达包含人源可变结构域的免疫球蛋白轻链，其中所述轻链与来源于重排的人源重链序列的人源重链结构域是同源的。在一个实施方式中，所述啮齿动物不表达选自非人源重链可变结构域、非人源轻链可变结构域及其组合的多肽序列。
[0065]在一个实施方式中，所述人源Vh 区段以 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18或19或者更多种多态性变体形式存在，其中各多态性变体可操作地与D和/或J区段连接以使得各多态性变体能够重排和形成具有任意一个或多个D区段和任意一个或多个J区段的重排的重链可变结构域。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。在一个实施方式中，所述D区段库包含两个或多个D区段。在一个实施方式中，所述J区段库包含两个或多个J区段。在一个实施方式中，所述D和/或J区段是人源区段。
[0066]在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包含编码单一人源免疫球蛋白Vh区段和/或其多态性变体的序列以及一个或多个Dh和一个或多个J序列，其中所述构建体包含至少一个与非人源免疫球蛋白重链可变基因座同源的同源臂，或重组酶识别位点(例如1x位点)。在一个实施方式中，所述V区段是VHl-69区段或VHl-2区段。
[0067] 在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体；所述构建体包含编码单一人源免疫球蛋白重链V区段的核酸序列，其中所述单一VH区段是νΗ1-69(*νΗ1-2)区段。在一个实施方式中，所述构建体包含位点特异性重组酶识别位点。在一个实施方式中，所述构建体包
区段上游的第一小鼠同源臂区段下游的第二小鼠同源臂，并且其中所述第一小鼠同源臂与小鼠染色体上小鼠免疫球蛋白重链可变区上游紧邻的区域具有同源性但不包括功能性小鼠免疫球蛋白重链可变区段。在一个实施方式中，所述构建体包含SEQ ID NO:3。在一个实施方式中，所述构建体包含SEQ ID NO:70。
[0068]在一个方面，所述受限制的单一 Vh区段在非人动物中，或者所述受限制的Vh区段在非人源免疫球蛋白重链基因座(例如在原位或在转基因中)，并且所述非人动物或非人源免疫球蛋白重链基因座选自小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类动物(例如绒猴、猕猴)基因座或动物。在一个特定实施方式中，所述非人动物或基因座是小鼠或大鼠基因座。
[0069]在一个方面，本申请提供了一种细胞或组织，其中所述细胞或组织来源于如本申请所述的非人动物，并且包含受限制的Vh区段库。在一个实施方式中，所述Vh区段库被限制为单一 Vh区段家族成员和/或其多态性变体。在一个特定实施方式中，所述单一 Vh区段是人源Vh1-69区段或人源Vh1-2区段。在一个实施方式中，所述细胞或组织来源于非人动物的脾脏、淋巴结或骨髓。
[0070]在一个实施方式中,所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中,所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是生殖细胞。
[0071]在一个实施方式中，所述组织选自结缔、肌肉、神经和上皮组织。在一个特定实施方式中，所述组织是生殖组织。
[0072]在一个实施方式中，分离来源于如本申请所述小鼠的所述细胞和/或组织用于一项或多项体外检测。在多种实施方式中，所述一项或多项体外检测包括物理、热、电、机械或光学性质检测，外科手术，不同组织类型相互作用检测，影像技术显影或其组合。
[0073]在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0074]在一个方面，本申请提供了一种非人动物胚胎，所述胚胎包括如本申请所述的受限制的重链Vh区段。在一个实施方式中，所述胚胎包含包括受限制Vh区段的ES供体细胞，以及宿主胚胎细胞。
[0075]在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0076]在一个方面，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述非人动物细胞 包含核转移得到的染色体或其片段。
[0077]在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的来源于非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述细胞核来自非B细胞的二倍体细胞。
[0078]在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的非人动物的多能性、诱导多能性或全能性细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
[0079]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的Vh区段库的非人源的诱导多能性细胞。在一个实施方式中，所述诱导多能性细胞来源于如本申请所述的非人动物。
[0080]在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的非人动物细胞的杂交瘤或四价体瘤。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠或大鼠。
[0081]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物的淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。
[0082]在一个方面，本申请提供了一种小鼠细胞和小鼠胚胎，其包括但不限于包含如本申请所述的基因修饰的ES细胞、多能行细胞以及诱导多能性细胞。本申请提供了 XX细胞和XY细胞。本申请还提供了包含具有如本申请所述的修饰的细胞核的细胞,例如通过前核显微注射将修饰引入细胞。
[0083]在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的非人动物中制备的抗体可变结构域序列。
[0084]在一个方面，本申请提供了一种人用治疗剂，所述治疗剂包括包含来源于如本申请所述的非人动物序列的抗体可变结构域。
[0085]在一个方面，本申请提供了一种从非人动物中获得抗体可变区序列的方法，其中所述抗体可变区序列来源于人源Vh1-69区段或Vh1-2区段，其中所述方法包括(a)使用所关注的抗原免疫非人动物，其中所述非人动物包含用单一人源可变区段在内源性免疫球蛋白重链基因座取代全部或基本上全部的非人源可变区段，其中所述单一人源可变区段是Vh1-69区段或Vh1-2区段，并且其中所述非人动物基本上不能形成非来源于人源Vh1-69区段或Vh1-2区段的免疫球蛋白重链可变区序列；(b)使所述非人动物发生针对所关注抗原的免疫应答；以及(c)鉴定或分离所述非人动物的免疫球蛋白重链可变区序列，其中所述抗体与所关注抗原结合。
[0086]在一个实施方式中，所述单一人源可变区段是Vh1_69区段。
[0087]在一个实施方式中，所述抗体可变区序列来源于SEQ ID NO:34。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与SEQ IDNO:34相同。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列包含SEQ IDNO:34。
[0088]在一个实施方式中，所述单一人源可变区段是Vh1_2区段。
[0089]在一个实施方式中，所述抗体可变区序列来源于SEQ ID NO:60。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与SEQ IDNO:60的相同。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列包含SEQ IDNO:60。
[0090]在一个实施方式中，针对抗原的免疫应答的特征为在ELISA检测中测定的抗体的滴度比本底的两倍高约6xW4至约5x10s倍。在一个特定实施方式中，根据在ELISA检测中测定的结果抗体的滴度比本底的两倍高约1.5xl05倍。在一个实施方式中，所述抗原是人细胞表面受体。
[0091]在一个方面，本申请提供了一种在非人动物中生成人源抗体可变区库的方法，其中所述人源重链可变区库来源于同一 Vh基因家族成员和多个Dh区段之一和多个Jh区段之一，其中所述库的特征为具有来自单一 Vh基因家族成员的重链免疫球蛋白FRl (框架I)、⑶Rl、FR2、⑶R2和FR3序列。在一个实施方式中，所述库进一步的特征为具有多个不同的CDR3+FR4 序列。
[0092]在一个实施方式 中，所述单一 Vh基因家族选自Vh家族1、2、3、4、5、6和7。在一个特定实施方式中，所述单一 Vh基因家族是Vh家族I。在一个实施方式中，所述单一 Vh基因家族成员选自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2_70和VH3_23。在一个特定实施方式中，所述单一Vh基因家族成员是Vh1-69。在一个特定实施方式中，所述单一 Vh基因家族成员是Vh1-2。
[0093]在一个实施方式中，所述库包含来源于Vh1_69区段的重链FRUCDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含来源于SEQ ID NO:35的重链FR1、CDR1、FR2、⑶R2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含SEQ ID NO:35的重链FR1、⑶R1、FR2、CDR2 和 FR3 序列。
[0094]在一个实施方式中，所述库包含来源于Vh1_2区段的重链FRl、CDRl、FR2、CDR2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含来源于SEQ IDNO:61的重链FR1、CDR1、FR2、⑶R2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含SEQ ID NO:61的重链FR1、⑶R1、FR2、CDR2 和 FR3 序列。
[0095]在一个方面，本申请提供了一种用于生成多种不同人源CDR3序列的生物(即体内)系统，所述序列反映了单一人源Vh基因区段与多种人源D和J区段的多种重排，其中该系统生成的人源重链可变结构域的特征为具有与人源FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3 —致但具有体细胞高突变的序列，其中所述重链可变结构域的特征为具有特异性高突变并且来源于单一人源Vh基因区段和多个人源D和J区段；其中所述系统包含如本申请所述的基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。
[0096]在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段选自Vh1_2、Vh1_69、Vh2_26、Vh2_70和\^3-23。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段是Vh1-69。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段是Vh1-2。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段列于表I中。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段列于表2中。在一个实施方式中,所述单一人源Vh基因区段列于表3中。
[0097]在一个方面，本申请提供了一种用于在体内产生多种重链CDR序列的方法，所述序列来源于单一人源Vh基因区段与多个人源D和J区段的重排，其中所述方法产生的人源重链可变结构域的特征为具有与人源FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3 —致但具有体细胞高突变的序列，其中所述重链可变结构域的特征为具有体细胞突变并且来源于单一人源Vh基因区段和多个人源D和J区段；其中所述系统包含如本申请所述的基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。
[0098]在一个实施方式中，所述方法包括将如本申请所述的非人动物与所关注的抗原接触，使得所述非人动物产生针对所述抗原的免疫应答，其中所述免疫应答生成多个来源于单一人源Vh基因区段与人源D区段之一和人源J区段之一重排的重链CDR序列，以及鉴定一系列与所述抗原结合的重链CDR。在一个实施方式中，所述方法包括从所述动物的核酸序列中分离编码包含重链CDR的人源Vh结构域。
[0099]在一个实施方式中，所述重链⑶R序列来源于人源Vh1_69基因区段的重排。在一个实施方式中，所述重链CDR序列来源于人源Vh1-2基因区段的重排。
[0100]在一个方面，本申请提供了一种在非人动物中产生多个不同的CDR3和FR4序列的方法，所述方法包括将非人动物与所关注的抗原接触，所述非人动物包含具有限定为单一Vh区段家族成员的Vh区段库的免疫球蛋白重链可变基因基因座，使得所述非人动物产生针对所述抗原的免疫应答，其中所述免疫应答生成重链可变结构域均来源于单一 Vh区段家族成员且包含多种不同的⑶R3和FR4序列的B细胞库。
[0101]在一个实施方式中，所述单一 VHg段家族成员是人源的。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和家兔。在一个实施方式中，所述所关注的抗原选自配体、受体、细胞内蛋白和分泌蛋白。在一个实施方式中，所述所关注的抗原是如本申请所述的人病原体。
[0102]在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因家族成员选自Vh1_2、Vh1_69、Vh2_26、￥112-70和￥113-23。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因家族成员是VH1_69。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因家族成员是Vh1-2。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因家族成员列于表1中。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因家族成员列于表2中。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因家族成员列于表3中。
[0103]本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的编码免疫球蛋白可变区的核苷酸序列。
[0104]在一个方面，本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的抗体的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列。
[0105]在一个方面，本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列编码的抗体的可变区。
[0106]在一个方面，本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F (ab) 2、scFv)。
[0107]在一个方面，本申请提供了一种具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其特征为存在单一人源Vh基因区段、一个或多个人源Dh基因区段以及一个或多个人源Jh基因区段，其中所述单一人源Vh基因区段在内源性小鼠基因座并且所述Vh基因区段可操作地与一个或多个人源011基因区段、一个或多个人源Jh基因区段以及内源性免疫球蛋白重链恒定区连接。
[0108]在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含一个或多个人源\基因区段以及一个或多个人源I基因区段，其中所述人源'基因区段和人源I基因区段可操作地与非人动物免疫球蛋白轻链恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述人源\和I基因区段在内源性小鼠轻链基因座，并且其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因是小鼠基因。
[0109]在一个实施方式中，所述人源化免疫球蛋白轻链基因座在转基因上，并且所述恒定区基因选自小鼠、大鼠和人。
[0110]在一个实施方式中，所述人源'和叉基因区段是VK和】!^基因区段。在一个实施方式中，所述人源'和叉基因区段是νλ和基因区段。
[0111]在一个方面，本申请提供了一种非人动物，其中所述非人动物具有B细胞库，其表达来源于单一V区段家族成员的免疫球蛋白重链可变结构域。在一个实施方式中，在B细胞库中表达的非人动物免疫球蛋白重链可变结构域B细胞库的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90或至少95%来源于同一 V区段家族成员。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由外周(血液)Β细胞组成。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由脾脏B细胞组成。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由骨髓B细胞组成。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由外周B细胞、脾脏B细胞和骨髓B细胞组成。
[0112]在一个方 面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中表达重链免疫球蛋白可变结构域的非人动物不超过10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或高于90%的B细胞表达来源于单一 Vh基因区段家族成员的重链免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中,表达重链免疫球蛋白可变结构域的非人动物至少75%的B细胞表达来源于单一Vh基因区段家族成员的重链免疫球蛋白可变结构域。在一个特定实施方式中，所述百分率为至少90%。在一个实施方式中，全部表达重链结构域的B细胞均来源于单一 Vh基因家族成员。
[0113]在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其制备对所关注抗原的免疫产生应答的抗原特异性B细胞群，其中所述抗原特异性B细胞群的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或高于90%表达来源于同一￥11基因区段的免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，所述至少75%的抗原特异性B细胞群表达来源于同一乂11基因区段的免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，全部抗原特异性B细胞表达的重链均来源于同一 Vh基因区段。
[0114]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的Vh基因区段库的非人动物，其中所述限制针对人源％1-69基因区段或与Vh1-69*01基因区段具有至少约75.5%、76.5%、86.7%,87.8%,94.9%、96.9%、98%或99%同一性的VH1_69基因区段。在一个特定实施方式中，所述受限制的库选自图15中的一个或多个Vh1-69变体。
[0115]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的Vh基因区段库的非人动物，其中所述限制针对人源Vh1-2基因区段或与Vh1-2基因区段具有至少约94.9%、95.9%、96.9%,98%或99%同一性的￥111-2基因区段。在一个特定实施方式中，所述受限制的库选自图18中的一个或多个Vh1-2变体。
[0116]在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0117]在一个实施方式中，所述小鼠表现出具有与野生型小鼠相比更高的成熟B细胞与未成熟B细胞比率特征的免疫表型。在一个特定实施方式中，所述比率根据从脾脏中收集的B细胞计算。在一个实施方式中，所述小鼠表现出的成熟B细胞群为约lxlO7。在一个实施方式中，所述小鼠表现出的未成熟B细胞群为约0.5xl07。在一个实施方式中,所述小鼠表现出在小鼠脾脏中的成熟B细胞与未成熟B细胞的比率比野生型小鼠显示出的比率高约
1.5倍至约2倍。
[0118]在一个实施方式中，所述比率根据从骨髓中收集的B细胞计算。在一个特定实施方式中，所述小鼠表现出的成熟B细胞群为约3xl05。在一个实施方式中，所述小鼠表现出的未成熟B细胞群为约7xl05。在一个实施方式中，所述小鼠表现出在小鼠骨髓中的成熟B细胞与未成熟B细胞的比率比野生型小鼠显示出的比率高约3倍或约3.3倍。
[0119]在一个实施方式中，所述小鼠表现出具有与野生型小鼠相比骨髓中更高原B细胞数量的特征的免疫表型。在一个特定实施方式中，所述小鼠表现出的小鼠骨髓中的原B细胞群与野生型小鼠骨髓中表现出的相比高约2.5倍至约3倍。在一个特定实施方式中，所述小鼠表现出的小鼠骨髓中的原B细胞群与野生型小鼠骨髓中表现出的相比高约2.75倍。
[0120]在一个实施方式中，所述小鼠表现出具有选自下组特征的免疫表型:约80%野生型B细胞的CD19+脾脏B细胞群、与野生型小鼠大致相同的CD3+脾脏T细胞群及其组合。 [0121]在一个实施方式中，所述小鼠包含淋巴细胞群，其脾脏中⑶19+B细胞百分比大致与野生型小鼠相同。在一个实施方式中，每只小鼠脾脏中CD19+B细胞的数量为野生型小鼠脾脏中⑶19+B细胞数量的至少约50%。
[0122]在一个实施方式中，与野生型小鼠相比所述非人动物在骨髓中包含至少约75%至约80%的CD19+B细胞。
[0123]在一个实施方式中，所述小鼠股骨中CD19+骨髓细胞的总数不超过野生型小鼠中CD19+骨髓细胞总数的约30%、40%、50%、60%或75%。
[0124]在一个实施方式中，所述小鼠表达的IgD和IgM与在野生型小鼠中观察到的具有大致相同的水平。
[0125]在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的人源Vh区段库的小鼠，所述小鼠进一步包含人源化的免疫球蛋白轻链可变区段基因座，其中在所述小鼠中表达的λ与K轻链的比率与在野生型小鼠中大致相同。
[0126]在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包含受限制的免疫球蛋白重链基因座，其特征为存在单一 ％基因区段、一个或多个Dh基因区段以及一个或多个Jh基因区段，其中所述单一 Vh基因区段是多态性Vh基因区段。
[0127]在一个实施方式中，所述多态性Vh基因区段是在人群中与较高拷贝数相关的人源Vh基因区段。在一个实施方式中，所述人源Vh基因区段选自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-23或其多态性变体。在一个特定实施方式中，所述人源Vh基因区段是VHl-69基因区段。在另一个特定实施方式中，所述人源Vh基因区段是VHl-2基因区段。
[0128]在一个实施方式中，所述单一 Vh基因区段可操作地与人源、小鼠或人源/小鼠嵌合免疫球蛋白恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白恒定基因包含选自人源Ch1、人源铰链、人源CH2、人源Ch3及其组合的人源序列。在一个实施方式中，所述小鼠恒定基因位于内源性免疫球蛋白重链基因座。
[0129]在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含可操作地与J基因区段和轻链恒定基因连接的人源免疫球蛋白\基因区段。在一个特定实施方式中，所述\基因区段和/或J基因区段选自人源K基因区段和人源λ基因区段。在一个实施方式中，所述'和/或J基因区段是人源K基因区段。
[0130]在多种实施方式中，所述小鼠包含全部或基本上全部内源性Vh基因区段的缺失。
[0131]在多种实施方式中，所述非人动物包含灭活的内源性重链可变基因基因座。在多种实施方式中，所述灭活的内源性重链可变基因基因座未可操作地与内源性重链恒定区基因连接。
[0132]在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中所述小鼠的特征为表达血清免疫球蛋白，其中80%以上的血清免疫球蛋白包含人源重链可变结构域和同源的人源轻链可变结构域，其中所述人源重链可变结构域来源于基本上由单一人源Vh基因区段和/或其多态性变体组成的Vh基因区段库。
[0133]在一个实施方式中，所述单一人源￥11基因区段是人源￥111_69基因区段和/或其多态性变体。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段是人源Vh1-2基因区段和/或其多态性变体。
[0134] 在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其种系中包含用单一人源Vh基因区段和/或其多态性变体区段取代内源性免疫球蛋白重链基因座的全部或基本上全部内源性Vh基因区段。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段是人源Vh1-69基因区段和/或其多态性变体。在一个实施方式中，所述单一人源Vh基因区段是人源Vh1-2基因区段和/或其多态性变体。
[0135]在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含用一个或多个人源'基因区段取代内源性免疫球蛋白轻链基因座的全部或基本上全部内源性'基因区段。在一个特定实施方式中，所述小鼠进一步包含可操作地与人源性\区段连接的一个或多个人源I基因区段。
[0136]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备免疫球蛋白可变区核苷酸序列的用途。在一个实施方式中，所述序列包含重排的VHl-69基因区段。在一个实施方式中，所述序列包含重排的Vh1-2基因区段。
[0137]在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与人源Vh1-69基因区段相同。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与SEQ IDNO:34相同。在不同实施方式中，所述人源VH1_69基因区段列于表2中。
[0138]在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与SEQ IDNO:35相同。
[0139]在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与人源Vh1-2基因区段相同。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与SEQ IDNO:60相同。在不同实施方式中，所述人源VH1_2基因区段列于表3中。[0140]在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%与SEQ ID NO:61相同。
[0141]在一个方面，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠在制备全人Fab或全人F (ab) 2中的用途。在一个实施方式中，所述全人Fab或全人F (ab) 2包含包括重排的人源Vh1-69基因区段的重链可变区。在一个实施方式中，所述全人Fab或全人F (ab) 2包含包括重排的人源Vh1-2基因区段的重链可变区。
[0142]在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠制备永生化细胞系的用途。
[0143]在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠制备杂交瘤或四价体瘤的用途。
[0144]在一个方面，本申请提供了使用如本申 请所述的小鼠制备含有人源重链可变区和人源轻链可变区的噬菌体文库的用途。
[0145]在一个实施方式中，所述人源重链可变区来源于人源VH1_69基因区段，其包含选自下述的序列:SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42,SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56 和 SEQ ID NO:58。
[0146]在一个实施方式中，所述人源重链可变区来源于人源VH1_69基因区段，其包含选自下述的序歹Ij:SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43,SEQID NO:45, SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57 和 SEQ ID NO:59。
[0147]在一个实施方式中，所述人源重链可变区均来源于人源￥111_2基因区段，其包含选自下述的序列:SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:68。
[0148]在一个实施方式中，所述人源重链可变区来源于人源Vh1_2基因区段，其包含选自下述的序列:SEQ ID NO:6U SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67 和 SEQ ID NO:69。
[0149]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离淋巴细胞，(C)将淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定能够与所关注的抗原结合的淋巴细胞，以及(e)扩增一个或多个来自于淋巴细胞的可变区核酸序列以产生可变区序列。
[0150]在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的脾脏。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的淋巴结。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的骨髓。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的血液。
[0151]在一个实施方式中，所述标记抗体是荧光团偶联的抗体。在一个实施方式中，所述一种或多种荧光团偶联的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
[0152]在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。
[0153]在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含轻链可变区序列。在一个特定实施方式中，所述轻链可变区序列是免疫球蛋白K轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链和K轻链可变区序列。
[0154]在一个实施方式中，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的重链和K轻链可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离脾脏，(C)将来自于脾脏的B淋巴细胞与一种或多种标记的抗体接触，(d)鉴定(C)中能够与所关注的抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和K轻链可变区核酸序列以产生重链和K轻链可变区序列。
[0155]在一个实施方式中，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的重链和K轻链可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离一个或多个淋巴结，将来自于B淋巴细胞的一个或多个淋巴结与一种或多种标记的抗体接触，鉴定(C)中能够与所关注的抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和K轻链可变区核酸序列以产生重链和K轻链可变区序列。
[0156]在一个实施方式中，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的重链和K轻链可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离骨髓，(C)将来自于骨髓的B淋巴细胞与一种或多种标记的抗体接触，(d)鉴定(C)中能够与所关注的抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和K轻链可变区核酸序列以产生重链和K轻链可变区序列。在不同实施方式中，所述一种或多种标记的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
[0157]在多种实施方式中，所关注的抗原是危害人主体的病原体包括例如病毒抗原。示例性病毒病原体包括例如主要是腺病毒、细菌小核糖核酸病毒、疱疹病毒、肝脱氧核糖核酸病毒、黄病毒、逆转录病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、多瘤病毒、弹状病毒和披膜病毒家族的病原体。这些示例性病毒通常的长度范围为20-300纳米。在多种实施方式中，所关注的抗原是选自肝炎 病毒(例如HCV、HBV等)、人免疫缺陷病毒(HIV)或流感病毒(例如H1N1)的病毒抗原。
[0158]在多种实施方式中，本申请提供了如本申请所述的小鼠生成用于人源抗体的重链和K轻链可变区序列的用途，其进一步包括将经扩增的重链和轻链可变区序列与人源重链和轻链恒定区序列融合，在细胞中表达融合的重链和轻链序列，并且回收所表达的重链和轻链序列以生成人源抗体。
[0159]在多种实施方式中，所述人源重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在多种的特定实施方式中，所述IgG选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在多种实施方式中，所述人源重链恒定区包含CH1、铰链、Ch2、Ch3、Ch4或其组合。在多种实施方式中，所述重链恒定区是免疫球蛋白K恒定区。在多种实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7 细胞、MDA-MB-438 细胞、PC3 细胞、T47D 细胞、THP-1 细胞、U87 细胞、SHSY5Y (人神经母细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细胞(例如PER.C6?细胞)和MC3T3细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
[0160]在一个方面，本申请提供了一种生成特异性针对所关注抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的方法，所述方法包括步骤:使用所述抗原免疫如本申请所述的小鼠，从针对所关注抗原生成特异性反向嵌合小鼠-人源抗体的小鼠中分离至少一个细胞，培养针对所关注抗原生成特异性反向嵌合小鼠-人源抗体的至少一个细胞，以及获得所述抗体。
[0161]在一个实施方式中，所述反向-嵌合小鼠-人源抗体包含与小鼠或大鼠重链恒定基因融合的人源重链可变结构域，以及与小鼠或大鼠或人源轻链恒定基因融合的人源轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述人源重链可变结构域含有重排的人源Vh1-69或人源VHl-2基因区段。
[0162]在一个实施方式中，对至少一个针对所关注抗原生成特异性反向嵌合哨齿动物-人源抗体的细胞的培养是针对从小鼠分离的至少一个细胞产生的至少一个杂交瘤细胞上进行。
[0163]在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
[0164]在一个方面，本申请提供了一种用于产生特异性针对所关注抗原的全人源抗体的方法，所述方法包括步骤:使用所述抗原免疫如本申请所述的小鼠，从产生特异性针对所述抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠中分离至少一个细胞，产生至少一个生产来源于特异性针对所述抗原的反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的全人源抗体的细胞，并且培养至少一个生产所述全人源抗体的细胞，以及获得所述全人源抗体。
[0165]在多种实施方式中，分离自针对所述抗原生成特异性反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠的至少一个细胞是脾细胞或B细胞。
[0166]在多种实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
[0167]在多种实施方式中，所述抗体包含重链可变结构域，其含有重排的人源Vh1_69或人源VHl-2基因区段。
[0168]在多种实施方式中，针对所关注抗原实施的免疫是使用蛋白、DNA、DNA和蛋白的组合或者表达所述抗原的细胞。在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
[0169]在一个方面，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠用于制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人源抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自下述的抗原结合蛋白:抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性scFv、二体、三体、四体、V-NAR、Vhh、'、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白)或者双特异性T细胞卡合体(BiTE)。
[0170]在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗原-结合蛋白的方法，所述方法包括将如本申请所述的基因修饰的非人动物与所关注的抗原接触，使得所述基因修饰的非人动物对所述抗原产生免疫应答，从所述基因修饰的非人动物获得编码与所关注的抗原特异性结合的人源重链可变结构域的重链可变结构域核酸序列，将所述重链可变结构域核酸序列克隆至人源恒定区序列，并且在哺乳动物细胞中表达包含人源重链可变结构域序列和人源恒定区序列的抗体。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物包含人源Vh基因区段库，其基本上由单一人源Vh基因区段组成，其任选地以其两种或多种多态性变体形式存在，其可操作地与一个或多个人源D和/或J区段连接。在一个实施方式中，所述人源Vh基因区段库在内源性非人源Vh区段基因座。在一个实施方式中，所述人源Vh基因区段库在不是内源性VHg段基因座的基因座。在一个实施方式中，所述人源Vh基因区段与人源D区段和人源J区段重排以形成可操作地与恒定区序列连接的重排的人源VDJ基因，其中所述恒定区序列选自人源序列和啮齿动物序列(例如小鼠或大鼠或仓鼠序列)。在一个实施方式中，所述恒定区序列包含选自CH1、铰链、Ch2、CH3及其组合的序列；在一个特定实施方式中，所述恒定区序列包含(^1、铰链、(^和^。在一个实施方式中，所述人源可变结构域和所述恒定序列在具有同源人源轻链可变结构域的来自同一小鼠的哺乳动物细胞中表达(例如来自与人源可变结构域序列相同的B细胞的序列)；在一个实施方式中，然后将从小鼠中获得的编码人源轻链可变结构域的序列与编码人源轻链恒定序列的序列融合，并且在所述哺乳动物细胞中表达所述轻链序列和所述重链序列。
[0171]在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
[0172]在一个方面，本申请提供了一种用于制备与所关注的抗原结合的抗体重链可变结构域的方法，所述方法包括在单一细胞中表达(a)经过免疫的如本申请所述的非人动物的第一 Vh序列，其中所述第一 Vh序列与Ch基因序列融合；以及(b)经过免疫的如本申请所述的非人动物的'基因序列，其中所述'基因序列与人源Q基因序列融合；将所述细胞维持在足以表达抗体的条件下；并且分离所述抗体的重链可变结构域。在一个实施方式中，所述Vl基因与所述第一 Vh序列是同源的。
[0173]在一个实施方式中，所述细胞包含经过免疫的如本申请所述的非人动物的第二 Vh基因序列，其中所述第二 Vh基因序列与Ch基因序列融合，其中所述第一 Vh基因序列编码特异性结合第一表位的Vh结构域，以及所述第二 Vh基因序列编码特异性结合第二表位的Vh结构域，其中所述第一表位和所述第二表位是不同的。
[0174]在一个实施方式中，所述恒定区序列均是人源恒定区序列。在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
[0175]在一个方面，本申请提供了一种制备人源双特异性抗体的方法，包括使用如本申请所述非人动物B细胞的 人源可变区基因序列制备所述双特异性抗体。
[0176]在一个实施方式中，所述方法包括(a)鉴定所述非人动物克隆选定的淋巴细胞，其中所述非人动物己经与所关注的抗原接触并且己出现针对所关注抗原的免疫应答，并且其中所述淋巴细胞表达与所关注抗原特异性结合的抗体，(b)从所述淋巴细胞或抗体获得编码与所关注抗原特异性结合的人源重链可变区的核苷酸序列，以及(C)在制备双特异性抗体中引入编码与所关注抗原特异性结合的人源重链可变区的核苷酸序列。在一个特定实施方式中，所述人源重链可变区包含重排的Vh1-2或Vh1-69基因区段。
[0177]在一个实施方式中，步骤(a)至(C)在第一时间用于第一所关注抗原以生成第一人源重链可变区序列，和步骤(a)至(C)在第二时间用于第二所关注抗原以生成第二人源重链可变区序列，并且其中所述第一重链可变区序列与第一人源重链恒定区融合表达以形成第一人源重链，所述第二人源重链可变区序列与第二人源重链恒定区融合表达以形成第二人源重链，其中所述第一和第二人源重链在由重排的人源Vk 1-39或人源Vk 3-20基因区段表达的单一人源轻链存在时表达。在一个特定实施方式中，所述单一人源轻链包含种系序列。
[0178]在一个实施方式中，所述方法包括(a)从己经与所关注的第一抗原接触的如本申请所述的非人动物，以及从己经与所关注的第二抗原接触的同一非人动物或者基因相同的不同非人动物的B细胞中克隆重链可变区；以及(b)在细胞中表达具有相同重链恒定区的(a)的重链可变区以及相同的轻链以制备双特异性抗体。
[0179]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于获得编码人源重链可变结构域的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VHl-2和Vh1-69的重排的人源Vh基因区段。
[0180]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于获得编码人源重链可变结构域的细胞的用途。在一个实施方式中，所述重链可变结构域包含选自￥111-2和￥111-69的重排的人源Vh基因区段。
[0181]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于制备人源抗体可变结构域的用途。在一个实施方式中，所述可变结构域包含选自Vh1-2和Vh1-69的重排的人源Vh基因区段。
[0182]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于制备人源抗体的用途，包括使用如本申请所述的非人动物B细胞中的人源可变区基因序列制备所述抗体。在一个实施方式中，所述人源抗体是人源双特异性抗体。在一个特定实施方式中，所述双特异性抗体包含来源于重排的人源Vh1-2或Vh1-69基因区段的一个重链可变结构域。在一个实施方式中，所述人源可变区基因序列包含重排的人源VHl-2或VHl-69基因区段。
[0183]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于选择人源免疫球蛋白重链可变结构域的用途。在一个实施方式中，所述重链可变结构域包含选自￥111-2和￥111-69的重排的人源Vh基因区段。 [0184]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备治疗人类疾病或病变的药物(例如抗原结合蛋白)或用于制备编码药物(例如抗原结合蛋白)可变序列的序列的用途。在一个实施方式中，所述药物的可变序列包含多态性人源Vh基因区段。在一个实施方式中，所述药物的可变序列包含人源VHl-69基因区段。在一个实施方式中，所述药物的可变序列包含人源Vh1-2基因区段。
[0185]在一个方面，本申请提供了编码在如本申请所述的小鼠中制备的免疫球蛋白可变结构域的核酸构建体。在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含选自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70 *Vh3-23的重排的人源％基因区段。在另一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源Vh1-2基因区段。在另一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源Vh1-69基因区段。
[0186]在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述可变结构域是K轻链可变结构域，其与包含重排的人源￥111-69基因区段的人源重链可变结构域具有同源性。在一个特定实施方式中，所述可变结构域是K轻链可变结构域，其与包含重排的人源Vh1-2基因区段的人源重链可变结构域具有同源性。
[0187]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备编码人源免疫球蛋白可变结构域的核酸构建体的用途。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述可变结构域是K轻链可变结构域，其包含选自下述的重排的人源Vk 基因区段:V K 4-1、V K 5-2, Vk 7-3, Vk 2-4, Vk 1-5, Vk 1-6, Vk 3-7, Vk 1-8, Vk 1-9、Vk 2-10、Vk 3-11, Vk 1-12、Vk 卜13、Vk 2-14, Vk 3-15, Vk 1-16、Vk 卜 17、Vk 2-18,Vk 2-19、Vk 3-20、Vk 6-21、Vk 卜22、Vk 卜23、Vk 2-24、Vk 3-25、Vk 2-26、Vk 卜27、Vk 2-28、Vk 2-29、Vk 2-30、Vk 3-31、Vk 卜32、Vk 卜33、Vk 3-34、Vk 1-35, Vk 2-36、
VK 1-37、V K 2-38、V κ 1-39 和 V κ 2-40 ?[0188]在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含选自Vh1-2、Vh1-69, Vh2-26、Vh2_70或VH3_23的重排的人源Vh基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源Vh1-69基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源Vh1-2基因区段。
[0189]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备人源免疫球蛋白可变结构域的用途。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述可变结构域是κ轻链可变结构域，其包含选自下述的重排的人源Vk基因区段:V κ 4-1、Vk 5-2、Vk 7-3, Vk 2-4, Vk 1-5、Vk 1-6、Vk 3-7, Vk 1-8、Vk 1-9、Vk 2-10,Vk 3-11、Vk 卜12、Vk 1-13、Vk 2-14, Vk 3-15, Vk 1-16、Vk 卜 17、Vk 2-18, Vk 2-19,Vk 3-20、Vk 6-21、Vk 1-22, Vk 卜23、Vk 2-24、Vk 3-25、Vk 2-26、Vk 卜27、Vk 2-28、Vk 2-29、Vk 2-30、Vk 3-31、Vk 1-32, Vk 卜33、Vk 3-34、Vk 1-35, Vk 2-36、Vk 卜37、
Vκ 2-38、V κ 1-39 和 V κ 2-40 ?
[0190]在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含选自Vh1-2、Vh1-69, Vh2-26、Vh2_70或VH3_23的重排的人源Vh基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源Vh1-69基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源Vh1-2基因区段。
[0191]在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的非人动物制备编码人源重链可变结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述人源重链可变结构域的特征为具有来源于多态性人源Vh基因区段的人源FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3序列。在一个特定实施方式中，所述人源Vh基因区段选自人源 Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2_70或VH3_23基因区段。在一个实施方式中，所述人源Vh基因区段是人源Vh1-69基因区段。在一个实施方式中，所述人源Vh基因区段是VH1_2基因区段。
[0192]在一个方面，本申请提供了一种制备编码人源Vh结构域的核酸序列的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物对所关注的抗原产生免疫应答，并且从中获得编码与所关注抗原结合的人源Vh结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述方法进一步包括制备与人源Vh结构域具有同源性的编码人源\结构域的核酸序列，包括分离编码人源Vh结构域和人源\结构域的B细胞，并且从中获得重链和轻链可变结构域的序列。在不同实施方式中，所述人源Vh结构域来源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因区段。在不同实施方式中，所述人源八结构域选自人源Vk或人源νλ结构域。
[0193]在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于制备人用治疗剂的用途，包括使用所关注的抗原免疫非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从所述动物中获得编码与所关注的抗原结合的免疫球蛋白可变结构域的核酸序列，以及将所述免疫球蛋白可变结构域引入人用治疗剂。在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域来源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因区段。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述轻链可变结构域来源于重排的人源Vκ或人源Vλ基因区段。
[0194]在一个方面，本申请提供了一种制备人用治疗剂的方法，包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从所述动物获得编码与所关注抗原结合的免疫球蛋白可变结构域的核酸序列，以及将所述免疫球蛋白可变结构域引入人用治疗剂。在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域来源于重排的人源νΗ1-69或人源νΗ1-2基因区段。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述轻链可变结构域来源于重排的人源Vκ或人源Vλ基因区段。
[0195]在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗原结合蛋白的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述动物产生免疫应答，获得编码与所关注抗原特异性结合的免疫球蛋白可变结构域的小鼠核酸序列，在适于表达所述核酸的载体中克隆所述核酸序列，其中将所述核酸序列克隆至具有编码人源免疫球蛋白恒定区或其功能性片段的核酸序列的框架中，将所述载体引入哺乳动物细胞中，并且将细胞维持在适于表达包含免疫球蛋白可变结构域和免疫球蛋白恒定区或其功能性片段的抗原结合蛋白的条件下。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源抗体。在一个特定实施方式中，所述抗体包含来源于如本申请所述小鼠的重链可变结构域和轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述抗体包含来源于如本申请所述小鼠的重链可变结构域。在不同实施方式中，所述重链可变结构域来源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因区段。
[0196]在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的非人动物中制备的编码人源抗原结合结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列编码人源免疫球蛋白Vh结构域。在一个实施方式中，所述核酸序列编码人源免疫球蛋白Vh结构域以及同源的人源\结构域。在不同实施方式中，所述人源Vh结构域来源于重排的人源Vh1-69或人源Vh1-2基因区段。
[0197] 在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗体的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从免疫的动物中收集淋巴细胞(例如B细胞)，将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞中获得编码人源Vh结构域和人源\结构域的核酸序列，将所述核酸序列克隆至具有人源恒定区序列的框架中(即在可操作的键中)以形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，并且在能够表达全人抗体的细胞中表达所述重链和轻链。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在不同实施方式中，所述人源Vh结构域来源于重排的人源Vh1-69基因区段或人源VHl-2基因区段。
[0198]在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗体的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从免疫的动物中收集淋巴细胞(例如B细胞)，从淋巴细胞获得编码人源Vh结构域和人源\结构域的核酸序列，将所述核酸序列克隆至具有人源恒定区序列的框架中(即在可操作的键中)以形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，并且在能够表达全人抗体的细胞中表达所述重链和轻链。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于所述非人动物的脾脏。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在不同实施方式中，所述人源Vh结构域来源于重排的人源Vh1-69基因区段或人源VH1_2基因区段。
[0199]在不同的方面，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。在不同的方面，所关注的抗原是能够感染人的病毒。能够在本申请所述的方法和用途中使用的示例性抗原包括微生物如病毒、细菌、朊病毒或真菌或者在人体内导致疾病的任意其他病原体。本领域技术人员在阅读了本公开后将知晓将适用于本申请所述的方法和用途的那些人病原体。除非明确指出或者上下文明确禁止一同使用，否则能够将不同的方面和实施方式一同使用。
[0200]附图的简要说明
[0201]图1为构建具有经修饰的重链基因座的靶向载体的靶向和分子改造的一系列步骤的未按照比例的通用图示，，所述经修饰的重链基因座在内源性免疫球蛋白重链基因座含有单一人源Vh1-69基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段。
[0202]图2为构建具有经修饰的重链基因座的靶向载体的靶向和分子改造步骤的未按照比例的通用图示，所述经修饰的重链基因座在内源性免疫球蛋白重链基因座含有单一人源Vh1-2基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段。
[0203]图3显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的脾细胞门控单一淋巴细胞以及CD19 (B细胞)和CD3(T细胞)染色的等值线图。
[0204]图4A中的左图显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的脾脏中收集的CD19+B细胞的百分率。右图显示了野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(lhVH HO)的各脾脏的CD19+B细胞数量。
[0205]图4B中的左图显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区 段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的骨髓中收集的CD19+B细胞的百分率。右图显示了野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(lhVH HO)各股骨的CD19+B细胞数量。
[0206]图5显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的脾细胞门控⑶19+B细胞以及针对Ig λ +和Ig κ +表达染色的等值线图。
[0207]图6显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的脾细胞门控CD19+B细胞以及针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的等值线图。
[0208]图7显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座(的单一人源Vh基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠IhV11 HO)的脾脏中收集的过渡性B细胞(CD19+IgMhiIgDint)、成熟B细胞(CD19+IgMintIgDhi)的总数，以及成熟与未成熟B细胞的比率。
[0209]图8显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓门控单峰的等值线图。
[0210]图9显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源％基因区段、27个人源D1^pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的股骨分离的骨髓中未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞的总数。[0211]图10显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)的骨髓门控⑶19+B细胞以及ckit+和⑶43+染色的等值线图。
[0212]图1lA显示了在从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)收集的骨髓中原B(CD19+CD43+ckit+)和前B (CD19+CD43-ckit_)细胞群中CD19+细胞的百分率。
[0213]图1lB显示了在从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座(lhVHHO)的单一人源Vh基因区段、27个人源D1^P 6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠收集的骨髓中原B(CD19+CD43 +ckit+)和前B (CD19+CD43-ckit_)细胞群中各股骨的绝对细胞数。
[0214]图12显示了在使用人源Vh、Dh、Jh、Vk和Jk基因区段(HO取代内源性重链VH、DH、Jh和区段内源性轻链V κ和Jk基因区段为纯合子的小鼠，野生型小鼠(WT)，在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源Vh基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段的小鼠杂合子(IhV11HET)以及在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源Vh基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO)中使用特异性针对人源Vh1-69基因区段的探针在定量PCR检测中测定的经纯化的脾脏B细胞的来源于Vh1-69的重链相对mRNA的表达情况(y-轴)。将信号归一化至小鼠C κ的表达情况。
[0215]图13显示了人源VH1_69基因中13个己报道的等位基因各第二外显子的核苷酸比对情况。小与喊基表不在等位基因之间的种系核昔酸差异。序列中的框表不互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。VH1-69*01 (SEQ IDNO:34) ;VH1_69*02 (SEQID NO:36) ;Vh1-69*03(SEQ ID NO:38) ;VH1_69*04(SEQ ID NO:40) ;VH1_69*05(SEQ IDNO:42) ;Vh1-69*06(SEQ ID NO:44) ;VH1_69*07(SEQ ID NO:46) ;VH1_69*08(SEQ ID NO:48) ;Vh1-69*09(SEQ ID NO:50) ;VH1_69*10 (SEQ ID NO:52) ;VH1_69*11 (SEQ ID NO:54)；Vh1-69*12 (SEQ ID NO:56) ;VH1_69*13 (SEQ ID NO:58)。
[0216]图14显示了人源VH1_69基因中13个己报道的等位基因各成熟重链可变基因序列的蛋白比对情况。小写氨基酸表示在等位基因之间的种系差异。序列中的框表示互补性决定区(⑶R)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。Vh1-69*01(SEQID NO:35) ;Vh1-69*02(SEQ ID NO:37) ;VH1_69*03 (SEQ ID NO:39) ;VH1_69*04 (SEQ IDNO:41) ;Vh1-69*05(SEQ ID NO:43) ;VH1_69*06(SEQ ID NO:45) ;VH1_69*07(SEQ ID NO:47) ;Vh1-69*08(SEQ ID NO:49) ;VH1_69*09(SEQ ID NO:51) ;VH1_69*10(SEQ ID NO:53)；Vh1-69*11(SEQ ID NO:55) ;VH1_69*12 (SEQ ID NO:57) ;VH1_69*13 (SEQ ID NO:59)。
[0217]图15显示了人源VH1_69基因中13个己报道的等位基因各成熟可变基因经比对蛋白序列的同一性百分率/相似性百分率矩阵。VHl-69等位基因的同一性百分率以阴影框以上的方框表示和相似性百分率以阴影框以下的方框表示。同一性百分率和相似性百分率评分由使用 MacVector 软件(MacVector, Inc.,North Carolina)的 ClustalW(vl.83)比对工具获得。
[0218]图16显示了人源Vh1_2基因中5个己报道的等位基因各第二外显子的核苷酸比对情况。小与喊基表不在等位基因之间的种系核昔酸差异。序列中的框表不互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。Vh1-2*01(SEQ ID NO:60) ;VH1_2*02 (SEQID NO:62):Vh1-2*03 (SEQ ID NO:64) ;VH1_2*04 (SEQ ID NO:66) ;VH1_2*05 (SEQ ID NO:68)。[0219]图17显示了人源VH1_2基因中5个己报道的等位基因各成熟重链可变基因序列的蛋白比对情况。小与氣基酸表不在等位基因之间的种系差异。序列中的框表不互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。VH1-2*01 (SEQ IDNO:61) ;VH1_2*02 (SEQID NO:63) ;Vh1-2*03 (SEQ ID NO:65) ;VH1_2*04 (SEQ ID NO:67) ;VH1_2*05 (SEQ ID NO:69)。
[0220]图18显示了人源VH1_2基因中5个己报道的等位基因各成熟可变基因经比对蛋白序列的同一性百分率/相似性百分率矩阵。VHl-2等位基因的同一性百分率以阴影框以上的方框表示和相似性百分率以阴影框以下的方框表示。同一性百分率和相似性百分率评分由使用 MacVector 软件(MacVector, Inc.,North Carolina)的 Clustalff (vl.83)比对工具获得。
[0221]图19显示了使用人细胞表面受体(抗原A)免疫的针对人源重链和人源κ轻链可变基因基因座为纯合子的小鼠(Ηκ ；n = 4)和在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源Vh1-69基因区段、27个人源D1^P 6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO ；n =10)的抗体滴度。
[0222]图20显示了使用两种不同的流感疫苗免疫的针对人源重链和人源κ轻链可变基因基因座为纯合子的小鼠(Ηκ ；n = 5)和在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源Vh1-69基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠(IhV11HO ；n = 5)的抗体滴度。
[0223]图21显示了使用人细胞表面受体(抗原A)免疫的在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源Vh1-69基因区段、27个人源Dh和6个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠和针对使用人源κ轻链可变基因座取代内源性κ轻链可变基因座的纯合子的VHCDR3区(X-轴)具有特定氨基酸长度的IgM激发的重链百分率(y_轴)。 [0224]图22显示了用人细胞表面受体(抗原A)免疫的在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VHl-69基因区段、27个人源D1^Pe个人源Jh基因区段为纯合子的小鼠和针对使用人源κ轻链可变基因座取代内源性κ轻链可变基因座的纯合子的VHCDR3区(X-轴)具有特定氨基酸长度的IgG激发的重链百分率(y_轴)。
[0225]发明详沭
[0226]本发明不限于所描述的特定方法以及实验条件，因为这些方法和条件可以改变。还将理解的是本发明的范围是由权利要求所定义的，因此本申请所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，其并不旨在限定。
[0227]除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。尽管在实施或检验本发明中可以使用与本申请所描述的那些相似或等效的任意方法和材料，但是在本申请中仅描述了特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通过引用并入本申请。
[0228]当使用是短语“基本上的”或“基本上地”指基因区段的数量(例如“基本上全部的” V基因区段)包括功能性和非功能性基因区段并且包括，在不同实施方式中，例如全部基因区段的80%或以上、85%或以上、90%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上或者99%或以上；在不同实施方式中，“基本上全部的”基因区段包括例如至少95%、96%、97%、98%或99%的功能性(即非假基因)基因区段。[0229]术语“取代”包括其中DNA序列以这样一种方式放置于细胞的基因组中，即使在基因组用异源性序列(例如在小鼠中的人源序列)取代基因组中的序列。这样放置的DNA序列可以包括一个或多个调控序列，其为所述被放置的序列的来源DNA的一部分(例如启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区、适宜的重组信号序列等)。例如，在多种实施方式中，所述取代是异源性序列对内源性序列的取代以生成这样放置的DNA序列(包含异源性序列)的基因产物，但是不表达内源性序列；所述取代是具有编码与编码内源性基因组序列(例如编码免疫球蛋白基因或结构域的内源性基因组序列，以及编码一个或多个人源免疫球蛋白基因或结构域的DNA片段)的蛋白具有相似功能的蛋白的DNA序列的内源性基因组序列。在多种实施方式中，使用相应的人源基因或其片段取代内源性基因或其片段。相应的人源基因或其片段是被取代的内源性基因或其片段的直系同源物、同源物或与其在结构和/或功能上基本相等或相同的人源基因或其片段。
[0230]使用受限制的人源免疫球蛋白重链基因座精确地在原位取代小鼠重链免疫球蛋白基因座(Vh-Dh-Jh)可变区的6百万个碱基，但是在杂合基因座中保留翼侧小鼠序列的完整和功能，包括全部小鼠的恒定链基因和基因座转录对照区(图1和图2)。特别地，使用VELOCIGENE⑩基因工程技术通过嵌合BAC靶向载体将单一人源VH、27DH和6个Jh基因区段引入小鼠ES细胞(参见例如美国专利号6，586，251和ValenzueIa等，2003，High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis, Nat Biotechnol21:652-659)。
[0231]具有受限制的免疫球蛋白Vh基因区段的非人动物
[0232]本申请提供了一种包含免疫球蛋白基因座的非人动物，所述基因座包含受限制的数量的Vh基因以及一个或多个D基因和一个或多个J基因，以及制备和使用其的方法。当使用所关注的抗原免疫时，所述非人动物产生具有仅来源于受限制的预先选定的Vh基因或Vh基因集合(例如预先选定的Vh基因及其变体)的抗体可变区的B细胞群。在不同实施方式中，本申请提供了一种产生表达人源抗体可变结构域的B细胞群的非人动物，所述人源抗体可变结构域是人源重链可变结构域以及同源的人源轻链可变结构域。在不同实施方式中，所述非人动物在经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白基因座重排人源重链可变基因区段和人源轻链可变基因区段，所述基因座包含用人源未经重排的可变区序列取代或插入非人源未经重排的可变区序列。
[0233]对免疫球蛋白基因的组织、结构和功能的早期工作部分在具有缺陷的内源性基因座并且工程化改造为具有部分人免疫球蛋白基因的转基因基因座(随机设置)的小鼠中进行，例如在存在或不存在人源轻链转基因的情况下，将部分人源重链基因库与人源恒定基因连接，随机插入基因座。尽管这些小鼠用于制备有用的高亲和性抗体不是十分理想，但是其有助于对免疫球蛋白基因座进行某些功能性分析。这些小鼠中的一些具有少至两种或三种，或者甚至单一的重链可变基因。
[0234]己报道了表达来源于在随机插入的转基因上的单一人源VH5_51基因以及10个人源Dh基因和6个人源Jh基因，且具有人源μ和Y I恒定基因的全人免疫球蛋白重链(并且具有存在缺陷的内源性免疫球蛋白基因座)的小鼠(Xu和avis，2000，Diversity in theCDR3Region of Vh Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunityl3:37-45)。这些小鼠的全人源免疫球蛋白重链主要仅表达来源于内源性小鼠λ轻链基因座的两种全小鼠λ轻链之一(仅V λ 1-J λ I或V λ 2-J λ 2)，并且能够不表达K轻链(所述小鼠是IgK +的)。这些小鼠在B细胞发育和抗体表达方面显示出严重异常的功能障碍。据报道其B细胞数为野生型的5-10%、IgM水平为野生型的5-10%以及IgGl水平仅为野生型的0.1-1%。所观察到的IgM库显示出高度受限制的连接多样性。所述全人源重链针对所有抗原展示出基本相同的CDR3长度，相同的Jh(Jh2)使用情况以及起始连接Q残基，因此反映了一定程度的⑶R3多样性缺失。全小鼠λ轻链在J λ I几乎均具有W96L取代作为起始连接残基。据报道所述小鼠不能产生针对细菌多糖的任何抗体。由于人源可变结构域与小鼠轻链偶联，因此所述人源可变区的利用受到了极大的限制。
[0235]仅具有单一人源乂113_23基因、人源DdP Jh基因以及小鼠轻链基因的其他小鼠己被报导，但是部分由于在人源Vh与小鼠'结构域之间存在错配的可能，所述小鼠显示出受限的多样性(因此使用情况受限)(参见例如Mageed等,2001, Rearrangement of thehuman heavy chain variable region gene V3_23in transgenic mice generates antibodiesreactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3and residues intrinsic tothe heavy chain Variable region, Clin.Exp.Tmmunol.123: 1-5)。类似地，在含有人源 μ恒定基因的转基因中携带两个Vh基因(3-23和6-1)以及人源D1^P Jh基因(Bruggemann等，1991, Human antibody production in transgenic mice:expression fromlOOkb of thehuman IgH locus, Eur.J.1mmmuno1.21:1323-1326)并且在具有小鼠轻链的人 IgM 链中表达该转基因的小鼠通过错配可以显示出受限制的库(Mackworth-Young等,2003, The roleof antigen in the selection of the human V3-23immunoglobulin heavy chain Variableregion gene, Clin.Exp.Tmmunol.134:420-425)。 [0236]表达来自随机插入基因组中的人转基因的Vh-受限制的全人源重链，具有来自全人源随机插入转基因的受限制的人源λ库的小鼠亦己被报导(参见例如Taylor等，1992，Αtransgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chainimmunoglobulins, Nucleic Acids Res.20(23):6287-6295 ；ffagner 等，1994, Antibodiesgenerated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic AcidsRes.22(8):1389-1393)。然而，表达来自随机插入小鼠基因座的转基因的全人源抗体并且包含受损的内源性基因座的小鼠己知与野生型小鼠相比显示出免疫应答上的巨大差异，这些差异影响了从这种小鼠获得的抗体的可变结构域多样性。
[0237]能够产生表达来自受限制的Vh基因库以及一个或多个D基因和一个或多个J基因的人源抗体可变结构域的多样性B细胞群的有用的非人动物可产生，优选地在一些实施方式中，具有足够多样性的重排的可变区基因库。在不同实施方式中，多样性包括连接多样性、体细胞高突变和在Vh基因序列中的多态性多样性(对于Vh基因以多态性形成存在的实施方式而言)。组合多样性发生在所述Vh基因与多种同源的人源轻链可变结构域之一的配对中(其在不同实施方式中包括结合多样性和/或体细胞高突变)。
[0238]包含受限制的人源Vh基因库和完全或基本上完全人源的Vh基因库的非人动物将在不同实施方式中产生反映多种多样性来源的B细胞群，如连接多样性(例如VDJ、VJ连接、P附加、N附加)、组合多样性(例如同源的Vh-受限制的人源重链，人源轻链)和体细胞高突变。在包含将Vh库限制为一种人源Vh基因的实施方式中，所述的一种人源Vh基因能够以两种或多种变体形式存在。在不同实施方式中，Vh基因两种或更多多态性形式的存在将丰富B细胞群可变结构域的多样性。
[0239]在种系序列基因区段(例如V基因)中的变体有助于在人中抗体应答的多样性。其对多样性的相对贡献是由于V基因序列在V基因之间的差异导致的。在不同基因家族之间多态性的程度不同，并且根据所观察到的在人群中相关和不相关个体之间Vh单倍体存在的差异，其反映了多种单倍体(具有共遗传多态性的序列的延伸)产生更多多样性的能力(参见例如 Souroujon 等,1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes fromthe VhIII Gene Family, J.1mmunol.143(2):706-711)。依据从特定多态性人源 Vh 基因家族中得到的数据，一些人提出在种系中单倍体的多样性是Vh基因在人群中呈现异质性的主要因素，这反映在人群中不同的种系Vh基因具有较大的多样性(参见Sasso等，1990，Prevalence and Polymorphism of Human VH3Genes, J.Tmmunol.145(8):2751-2757)。
[0240]尽管由于普遍存在的多态性人群中对于Vh基因库显示出了较大的单倍体多样性，但是某些多态性反映在在人群中观察到的普遍(即保守的)的等位基因上(Sasso等，1990)。可将Vh的多态性描述为两种主要形式。第一种变体由与相同基因区段的等位基因之间核苷酸序列的差异相关的等位基因变体产生。第二种由发生在免疫球蛋白重链基因座的众多的复制、插入和/或缺失产生。这就造成了独特的情况，其中从相同基因经复制得到的Vh基因与其各自的等位基因相比有一个或多个核苷酸取代的差异。这也直接影响了在重链基因座Vh基因的拷贝数。
[0241]人源免疫球蛋白重链可变基因区段(Vh基因)的多态性等位基因基本上是基因区段的插入/缺失以及编码区内单核苷酸的差异导致的，其均对免疫球蛋白分子具有潜在的功能性后果。表1显示了根据人源Vh基因家族和在人源免疫球蛋白重链基因座中各Vh基因经鉴定的等位基因数列出的功能性Vh基因。一些发现提示多态性的Vh基因与对某些疾病的易感性相关例如类风湿性关节炎，而在其他情况下Vh与疾病之间的联系一直不太清楚。这种不确定性己被归因于在不同人群中不同等位基因的拷贝数和存在情况不同。事实上，己证实若干人源Vh基因的拷贝数存在差异(例如Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70和VH3_23)。在不同实施方式中，具有受限制的Vh库的如本申请所述的人源化小鼠包含单个￥11家族成员的多个多态性变体(例如Vh1-2、Vh1-69, Vh2-26、Vh2_70和VH3_23的两个或多个多态性变体，其在内源性小鼠基因座取代全部或基本上全部的功能性小鼠Vh区段)。在一个特定实施方式中，本申请所述小鼠的两个或多个多态性变体的数量可达到和包括表1中对应的Vh家族成员所示的数量(例如针对Vh1-69，13个变体；针对Vh1-2，5个变体等)。
[0242]通常所见的特定人源乂11基因的变体是本领域所公知的。例如在乂11基因座中最复杂的多态性之一是VH1_69基因。所述人源VH1_69基因具有13个己报道的等位基因(Sasso等，1993, A fetally expressed immunoglobulin VaIgene belongs to a complex set of alleles,Journal of Clinical Investigation91:2358-2367 ；Sasso 等，1996, Expression of theimmunoglobulin Vh gene51plis proportional to its germline gene copy number, Journalof Clinical Investigation97 (9):2074-2080)并且存在至少三个携带VH1_69基因副本的单倍体，使得在给定基因座存在Vh基因的多重拷贝。这些多态性等位基因在互补性决定区(CDR)存在差异，这可能会显著影响抗原的特异性。表2中列出了己报道的人源乂111-69的等位基因以及成熟重链可变区的DNA和蛋白序列的SEQ ID NO。表3中列出了己报道的人源Vh1_2的等 位基因以及成熟重链可变区的DNA和蛋白序列的SEQ ID NO。[0243]Vh1-69基因典型的基因组DNA和全长蛋白序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。图13和图14分别显示了 13个己报道的VHl-69等位基因的DNA和蛋白比对情况。VHl-2基因典型的DNA和蛋白序列分别如SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61所示。图16和图17分别显示了 5个己报道的VHl-2等位基因的DNA和蛋白比对情况。图15和图18分别显示了与13个己报道的人源Vh1-69等位基因和5个己报道的人源Vh1-2等位基因对应的经比对的蛋白序列的同一性/相似性百分率矩阵。在不同实施方式中，本发明经修饰的基因座包含选自表1的Vh基因，其存在两个或更多的拷贝数，其中所述拷贝数包括高达和包括表1所示的等位基因数。在一个实施方式中，本发明经修饰的基因座包含选自表2的Vh1-69基因，其存在两个或更多的拷贝数，其中所述拷贝数包括高达和包括表1所示的等位基因数。在一个实施方式中，本发明经修饰的基因座包含选自表3的Vh1-2基因，其存在两个或更多的拷贝数，其中所述拷贝数包括高达和包括表1所示的等位基因数。
[0244]尽管对涉及小鼠中受限制的人源Vh库的实施方式进行了广泛的讨论，但是本申请还提供了表达受限制的人源Vh库的其他非人动物。这种非人动物包括能够被基因修饰以表达如本申请所述的受限制的人源Vh库的任意动物，包括例如小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猴、猕猴)等。例如，对于适宜的基因修饰的ES细胞不易于获得的非人动物而言，可以使用其他方法制备包含基因修饰的非人动物。这种方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能干细胞)以及引入核转移以便将经修饰的基因组转移至适宜细胞例如卵母细胞，并且在适宜条件下在非人动物中使经修饰的细胞(例如经修饰的卵细胞)妊娠以形成胚胎。修饰非人动物基因组(例如猪、母牛、啮齿动物、鸡等的基因组)的方法包括例如引入锌指核酸酶(ZFN)或转录活化 因子样效应物核酸酶(TALEN)以修饰基因组使其包括受限制的人源乂11库。因此，在一个实施方式中，本申请提供了一种编辑非人动物基因组使其包括受限制的人源Vh库的方法，所述方法包括编辑引入了 ZFN或TALEN的基因组以使其包括不超过一个或者不超过两个人源Vh基因区段(或其多态性变体)的步骤，其中所述不超过一个或不超过两个人源Vh基因区段可操作地与免疫球蛋白恒定基因序列连接。在一个实施方式中，所述恒定基因序列选自人源重链恒定序列和非人源重链恒定序列。在一个实施方式中，所述恒定序列是非人源的并且所述不超过一个或不超过两个人源Vh基因区段在内源性非人源免疫球蛋白基因座可操作地与非人源恒定基因序列连接。
[0245]在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述哨齿动物选自鼠科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(例如多刺睡鼠)和廳形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠和黄冠鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠是鼠科家族成员。
[0246]在一个实施方式中，所述非人动物是哨齿动物，其是C57BL品系的小鼠。在一个实施方式中，所述 C57BL 品系选自 C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr 和C57BL/01a。在另一个实施方式中，所述小鼠是129品系。在一个实施方式中，所述129品系选自下组:129P1、129P2、129P3、129X1、129S1 (例如 129S1/SV、129Sl/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如 Festing 等(1999)Revised nomenclature for strainl29mice, Mammalian GenomelO:836,亦参见 Auerbach 等(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-andC57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL品系的混合物(例如C57BL/6品系)。在另一个实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或者前述C57BL/6品系的混合物。在一个实施方式中，所述129品系的混合物是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是129/SvEv-和C57BL/6-来源品系的混合物。在一个特定实施方式中，所述小鼠是Auerbach et al.2000B1Techniques29:1024-1032 描述的 129/SvEv-和 C57BL/6-来源品系的混合物。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系例如BALB/c品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系(例如BALB/c品系)和另一种如述品系的混合物。
[0247]在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar 大鼠、LEA 品系、Sprague Dawley 品系、Fischer 品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合物:Wistar、LEA、SpragueDawley> Fischer> F344、F6 和 Dark Agouti。
[0248]表1
[0249]
【权利要求】
1.一种具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其特征在于，所述受限制的免疫球蛋白重链基因座存在单一人源％基因区段、一个或多个人源Dh基因区段和一个或多个人源Jh基因区段，其中所述单一人源Vh基因区段是多态性的Vh基因区段。
2.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述小鼠包含全部或基本上全部内源性VinD1^PJh基因区段的缺失。
3.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述单一人源Vh基因区段选自Vh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70 和 Vh3-23。
4.根据权利要求3所述的小鼠，其中所述单一人源Vh基因区段是Vh1-69。
5.根据权利要求3所述的小鼠，其中所述单一人源Vh基因区段是Vh1-2。
6.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述单一人源Vh基因区段可操作地与人源或非人源免疫球蛋白恒定区基因连接。
7.根据权利要求6所述的小鼠，其中所述免疫球蛋白恒定区基因是小鼠、大鼠或人恒定区基因。
8.根据权利要求1所述的小鼠，其进一步包含与一个或多个人源Jh基因片段可操作地连接的一个或多个人源免疫球蛋白\基因区段。
9.根据权利要求 8所述的小鼠，其中所述一个或多个人源\基因区段和/或所述一个或多个人源I基因区段选自人K和人λ基因区段。
10.根据权利要求8所述的小鼠，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白\基因区段和一个或多个人源I基因区段可操作地与非人源轻链恒定基因连接。
11.根据权利要求10所述的小鼠，其中所述非人源轻链恒定基因选自小鼠或大鼠K或λ恒定区基因。
12.一种小鼠，其特征在于，所述小鼠在其种系的内源性免疫球蛋白重链基因座中包含用单一人源Vh基因区段和/或其多态性变体、一个或多个人源Dh基因区段和一个或多个人源Jh基因区段取代全部或基本上全部的内源性VH、Dh和Jh基因区段。
13.根据权利要求12所述的小鼠，其进一步包括在内源性免疫球蛋白轻链基因座用一个或多个人源\和一个或多个人源I基因区段取代全部或基本上全部的内源性\和叉基因区段。
14.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述单一人源Vh基因区段选自AVHl-69和人VH1_2基因区段。
15.一种来源于权利要求1或12所述的小鼠的细胞或组织。
16.—种制备编码人Vh结构域的核酸序列的方法，所述方法包括: (a)使用抗原免疫权利要求1或12所述的小鼠； (b)使得所述小鼠产生针对所述抗原的免疫应答；以及， (c)从所述小鼠中获得编码人Vh结构域的核酸序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh区序列与SEQID NO:34,SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:56 或 SEQ ID NO:58 具有至少75%的同一性。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh区序列包含SEQID NO:34、SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQID NO:48, SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58,或其多态性变体。
19.根据权利要求16所述的方法，所述免疫球蛋白Vh区序列编码的蛋白与SEQID NO:.35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:57 或 SEQ ID NO:59 具有至少75%的同一性。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh区序列与SEQID NO:60,SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66 或 SEQ ID NO:68 具有至少 95% 的同一性。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白Vh区序列包含SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，或其多态性变体。
22.根据权利要求16所述的方法，其中免疫球蛋白Vh区序列编码的蛋白与SEQID NO:61，、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67 或 SEQ ID NO:69 具有至少 95% 的同一性。
23.根据权利要求1或12所述的小鼠用于制备编码人重链可变结构域的核酸序列的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述人重链可变结构域的特征为具有来源于多态性人Vh基因区段的人FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3序列。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述人Vh基因区段选自AVh1-2、Vh1-69、Vh2-26、Vh2-70 或 Vh3-23 基因区段。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述人Vh基因片区段是Vh1-2。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述人Vh基因区段是Vh1-69。
28.根据权利要求1或12所述的小鼠用于制备人源抗体的用途，其中所述人源抗体包含来源于经重排的人Vh1-2基因区段、人Vh1-69基因区段或其多态性变体的重链可变结构域。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述重排的人VHl-69基因区段与SEQIDNO:34、SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ IDNO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56 或 SEQ ID NO:58 具有至少75%的同一性。
30.根据权利要求28所述的用途，其中所述经重排的AVHl-2基因区段与SEQID NO:.60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66 或 SEQ ID NO:68 具有至少 95% 的同一性。
【文档编号】C12N15/85GK104024418SQ201280062449
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2011年10月17日
【发明者】L·麦克唐纳, J·麦克沃克, C·古雷尔, K·A·霍西阿瓦, A·J·莫菲 申请人:瑞泽恩制药公司