用于干细胞增殖和诱导的培养基的制作方法
【专利摘要】本申请公开了用于细胞生长、维持和诱导回复至较不成熟状态的包含MUC1*激活配体的细胞培养基。
【专利说明】用于干细胞增殖和诱导的培养基
【技术领域】
[0001]本申请涉及干细胞生长培养基。本申请还涉及用于诱导成熟细胞或体细胞回复(revert)至较不成熟状态(lessmature state)的培养基。
【背景技术】
[0002]干细胞疗法持有不仅能够治疗而且能够治愈许多后天疾病、可遗传症状以及创伤损伤后果的前景。然而，在干细胞疗法的前景能够变为现实之前，在目前的科学知识以及需要克服的技术和监管障碍中存在许多差距。首要问题涉及监管问题。FDA将施加方针政策以确保在针对传统药物需要的那些之后期望被模型化的患者安全和产品再现性。这将意味着将需要从第I天使用确定的、可以计量的试剂并且在可再现性条件下生成开始作为干细胞的任何治疗细胞。在干细胞衍生的细胞用于治疗的情况下，这已经不可能。传统上，使用大量不确定组分的复杂混合物，人胚胎干(ES)细胞以及人诱导多能性干(iPS)细胞已经体外繁殖。尽管也已经使用人类饲养细胞，现行方法仍是在通常为鼠源(小鼠胚胎成纤维细胞:MEF)的成纤维细胞饲养细胞层上培养ES和iPS细胞。许多人认为使用来自另一物种的细胞是不安全的。除了不同动物物种的问题之外，需要饲养细胞层将另一非再现性层引入系统；干细胞的生长需要由成纤维细胞饲养细胞分泌的因子。这些需要的因子尚未确定或量化。在远离使用饲养细胞的尝试中，干细胞已经在基质胶层上生长，所述基质胶层是获得自小鼠肉瘤细胞的未确定和不可量化因子的混合物。然而，只有加入来自饲养细胞的条件培养基时，干细胞才能够在基质胶层上生长。因此，基质胶方法不能提供用于产生细胞的确定条件。
[0003] 通常已知的能够使人类干细胞生长的生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也称为FGF-2或简单的FGF)。在开发能够满足针对人类干细胞治疗的期望的FDA监管的干细胞生长条件的努力中，近来的研究文章报导使用称为“ES”且不包含动物组分但包含极高水平的bFGF(与标准4 ng/mL相比的100 ng/mL)加TGF-β的确定的培养基，人胚胎干细胞和iPS细胞能够生长。该培养基和所有其他基于FGF的培养基的主要问题在于称为“基”态或“原始(naive) ”态细胞的真正多能性干细胞在FGF中不稳定(J.Hanna, A.ff.Cheng, K.Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A107 (20), 9222 (2010), JacobH.Hanna, Krishanu Saha, and Rudolf Jaenisch, Celll43(4), 508(2010),J.NicholsandA.Smith, Cell Stem Cell4 (6)，487 (2009))。这些报导总结:使用FGF或bFGF驱动人类干细胞从原始状态进入“致敏(始发，primed)”状态。“致敏”是误称。尽管致敏干细胞已经进行了一定程度的分化，然而这不会“致敏”它们或设置它们以分化成功能的人细胞。与此相反的是正确的。目前，科学研究表明致敏干细胞不能够分化成针对使用干细胞用于大多数(如果不是所有)治疗应用需要的人体内的任何细胞(FGF信号抑制人胚胎干细胞中的神经诱导° Boris Greber, Philippe Coulon, Miao Zhang, Soren Moritz, Stefan Frank, ArnoldoJose MuIler—MoI ina, Marcos J Arauzo-Bravo, Dong Wook Han, Hans-Christian Pape andHans RScholer0 EMBO期刊(2011)30,4874-4884)。例如，FGF生长干细胞不能够分化成针对治疗神经变性疾病如Parkinson' s或Alzheimer' s或治疗外伤性脊髓损伤需要的所有类型的神经元细胞。此外，研究者还不能够使人类干细胞以协调方式分化，因此，它们随机分化为许多细胞类型而用于疗法，人类想要针对那种治疗需要的单一类型的细胞。由于小鼠干细胞处于原始状态，当使用它们工作时研究者没有这些问题。ES培养基的另一问题是不被认为是生理相关的bFGF和TGF-β的异常高水平，因此，引起质疑的是生长因子的这些不自然的高水平是否将会引起另外的无法预料的问题。
[0004]总之，对于致敏和原始或基态干细胞之间的区别的近期研究的主体概括为FGF不是使得真正多能性人类干细胞生长的天然生长因子。在FGF存在下，不能够维持处于真正多能性状态(基态或原始态)的人类干细胞的事实表明在本领域中存在鉴别和使用支持真正的多能性人类原始干细胞生长的真正的生长因子用于产生或维持用于人类治疗法的人类干细胞的需要。用于原始干细胞的真正生长因子应该能够在多种培养基和培养条件下起作用，包括期望药物监管机构要求的那些。
【发明内容】
[0005]在一个方面，本发明旨在用于细胞生长、维持和诱导回复至较不成熟状态且包含MUC1*激活配体(activating ligand)的细胞培养基。在其中期望细胞增殖而不发生分化的情况下，细胞可以 是干细胞或祖细胞，或细胞可以是体细胞、成熟细胞或祖细胞，其中期望成熟细胞或祖细胞被诱导为多能性细胞。优选地，细胞可以是人细胞。优选地，培养基可以不含bFGF、TGF-13、或两者。进一步地，在另一个方面，培养基可以不含血清。培养基可以进一步包含胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸或非必需氨基酸。
[0006]在另一个方面，MUC1*配体可以是NME家族蛋白。优选地，NME家族蛋白可以是NMEl0 NMEl可以以二聚或设计(engineer)为具有两个亚基(subunit)的单链的两种单体存在。可替换地，NME家族蛋白可以是NME7或NME6。
[0007]在另一个方面，细胞培养基可以包含rho相关激酶抑制剂。细胞培养基可以包含鸟嘌呤交换因子抑制剂。鸟嘌呤交换因子抑制剂可以是六聚体形式的NMEl或获得自(衍生自)NME1的肽。
[0008]在进一步的其他方面，细胞培养基可以进一步包含其他生长因子，如但不限于FGF-2 或 TGF- β。
[0009]在另一个方面，本发明旨在包括使细胞与NME家族蛋白的细胞培养基接触以刺激干细胞或祖细胞生长或诱导细胞回复至较不成熟状态的方法。
[0010]在该方法中，在其中期望细胞增殖而不发生分化的情况下，细胞可以是干细胞或祖细胞，或细胞可以是体细胞、成熟细胞或祖细胞，其中期望成熟细胞或祖细胞被诱导为多能性。优选地，细胞可以是人细胞。优选地，培养基可以不含bFGF、TGF-β、或两者。进一步地，在另一个方面，培养基可以不含血清。培养基可以进一步包含胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸或非必需氨基酸。
[0011]优选地，NME家族蛋白可以是NMEl。NMEl可以以二聚或设计为具有两个亚基的单链的两种单体存在。可替换地，NME家族蛋白可以是ΝΜΕ7或ΝΜΕ6。
[0012]在本发明方法的另一个方面，细胞培养基可以包含rho相关激酶抑制剂。细胞培养基可以包含鸟嘌呤交换因子抑制剂。鸟嘌呤交换因子抑制剂可以是六聚体形式的NMEl或获得自NMEl的肽。在进一步的其他方面，细胞培养基可以进一步包含其他生长因子，如但不限于FGF-2或TGF- β。
[0013]在又一个方面，本发明涉及NME家族蛋白加上用于生长或维持干细胞或诱导为成熟细胞多能性的基础培养基和非必需氨基酸的细胞培养基。
[0014]在另一个方面，本发明旨在包括使细胞与处于无血清最小培养基(基本培养基，minimal media)的NME家族蛋白细胞培养基接触以刺激干细胞或祖细胞生长或诱导细胞回复至较不成熟状态的方法。
[0015]在又一个方面，本发明旨在包含干细胞群的组合物，其中，组合物进一步包含含有NME家族蛋白的无血清培养基。
[0016]在又一个方面，本发明涉及在其上是结合至祖细胞或干细胞的配体的表面上生长干细胞的方法，包括使细胞与包含NME家族蛋白的培养基接触。
[0017]在另一个方面，本发明旨在制造原始干细胞的纯群体(pure population)的方法，包括:(i)使细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的单集落(single colony) ； (ii)分离原始干细胞的单集落；以及(iii)使集落与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的纯群体。在以上步骤(i)中，可以获得约25%至60%、或30%至50%的原始状态的细胞。在以上方法中，在步骤(iii)中，原始干细胞群体的纯度可以是至少约80%、90%、99%或100%。
[0018]在另一个方面，本发明旨在由诱导多能性干细胞制造原始干细胞的纯群体的方法，包括:(i)使成熟细胞或祖细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的单集落；(ii)分离原始干细胞的单集落；以及(iii)使群体与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的纯群体。步骤(i)中成熟细胞可以用多能性基因转染。成熟细胞或祖细胞可以是体细胞、成真皮细胞(dermablast)或成纤维细胞。在以上步骤(i)中，可以获得约25%至60%、或30%至50%的原始状态的细胞。在以上方法中，在步骤
(iii)中，原始干细胞群体的纯度可以是至少约80%、90%、95%、99%或100%。
[0019]在一个方面，细胞培养基和使用以上指出的细胞培养基的方法可以包括含具有约25kDa或约30kDa的分子量的NME7的细胞培养基。NME7蛋白可以是NME7-AB。细胞培养基可以包含rho相关激酶抑制剂、在PI3K或RAC通路中并且优选不存在rho激酶抑制剂下的信号蛋白的激活剂。或，细胞培养基可以进一步包含抑制NMEl或NME2表达的核酸。
[0020]在又一个方面，本发明旨在产生人胚胎干细胞系的方法，包括:(i)使获得自胚泡的细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触；(ii)分离具有干细胞样(stem-like)形态的长出物(outgrowth) ；(iii)使分离的长出物与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触；以及(iv)以及分离具有期望核型以及表明细胞是多能性的多能性基因和原始基因(na'ivegene)的表达水平(express level)的克隆。在该方法中,NME家族成员可以是NME7。NME7可以是NME7-AB。优选地，包含NME家族成员的培养基可以不含FGF。以上方法可以包括抑制细胞中的NMEl和NME2的步骤。
[0021] 在另一个方面，本发明旨在产生人诱导多能性干细胞系的方法，包括:(i)使获得自供体或患者的细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触；(ii)使细胞与诱导表达多能性基因0CT4、S0X2、NANOG, KLF4、c-Myc或LIN28的试剂接触；(iii)分离具有干细胞样形态的细胞；(iv)使分离的细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触；(V)分离具有期望的核型以及表明细胞是多能性的多能性基因的表达水平的克隆(克隆，clone);以及(vi)以及在包含NME家族成员的培养基中繁殖克隆。在该方法中，NME家族成员可以是NME7。NME7可以是NME7-AB。包含NME家族成员的培养基优选不包含FGF。以上方法可以包括抑制细胞中的NMEl和NME2的步骤。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]由本文中以下给出的详细描述以及仅通过说明给出而并非限制本发明的附图，将更充分地理解本发明，并且，其中:
[0023]图1示出了在匪23作为唯一的生长因子加上如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂，Y27632的最小(基本，minimal)干细胞培养基“MM”中培养的完全融合(汇合，confluent)的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0024]图2示出了在匪23作为唯一的生长因子而不存在如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂，Y27632的最小干细胞培养基“MM”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0025]图3示出了具有bFGF、来自人类饲养细胞的50%条件培养基、HS27，加上如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的最小干细胞培养基“MM”中培养的完全融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0026]图4示出了具有bFGF、来自人类饲养细胞的50%条件培养基、HS27，而不存在如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的最小干细胞培养基“MM”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0027]图5示出了具有匪23作为唯一的生长因子加上如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的完全确定的干细胞培养基(completely defined stem cellmedia) “MN6”中培养的融合的未分化人类干细胞放大的照相图像。
[0028]图6示出了具有匪23作为唯一的生长因子而不存在如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的完全确定的干细胞培养基“MN6”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0029]图7示出了具有匪23作为唯一的生长因子加上如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的最小的完全确定的干细胞培养基“MN2”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0030]图8示出了具有匪23作为唯一的生长因子而不存在如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的最小的完全确定的干细胞培养基“MN2”中培养的较差连接并分化的人类干细胞的放大的照相图像。
[0031]图9示出了为MN6加100ng/mL下的bFGF和TGF-β加如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的完全确定的干细胞培养基“E8”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0032]图10示出了为MN6加100ng/mL下的bFGF和TGF- β而不存在如描述的玻连蛋白表面上的Rho激酶 抑制剂Υ27632的完全确定的干细胞培养基“Ε8”中培养的较差连接且分化的人类干细胞的放大的照相图像。
[0033]图11A-11D示出了均具有匪23作为唯一的生长因子加抗-MUC1*抗体表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的最小干细胞培养基“MM”、A、C或MN6培养基B、D中培养的完全融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0034]图12A-12D示出了具有均具有抗-MUC1*抗体表面上的Rho激酶抑制剂Y27632的匪23B、D的mTeSRA、C或MN6培养基中培养的完全融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。
[0035]图13A-13D示出了与饲养细胞、基质胶(Matrigel)、玻连蛋白或抗-MUC1*涂覆的表面上的基于NME的培养基相比,用于基于FGF的培养基中培养的干细胞的多能性基因以及原始和致敏(始发态，primed)基因的RT-PCR测量结果的曲线图。
[0036]图14A-D示出了其中来自人类 干细胞和癌细胞的NME7结合至具有PSMGFR肽序列的合成肽的拉下试验(pull-down assay)的蛋白质印迹。
[0037]图15是以二价或一价抗体浓度的函数测定的癌细胞生长的曲线图，表明刺激生长的MUC1*受体的二聚。MUCl阳性乳腺癌细胞ZR-75-30的生长通过加入二价(Ab)抗-MUC1*刺激并且通过加入一价Fab抑制。二价抗体的加入产生表明生长因子受体二聚化的特征钟形生长曲线。MUCl阴性HEK 293细胞的生长不受二价或一价Fab抗-MUC1*的影响。当过量加入二价抗体时，存在结合至每一个受体的一个二价抗体而不是二聚每两个受体的一个二价抗体，从而抑制生长。
[0038]图16示出了 FPLC迹线的叠加(overlay)，其表征野生型NM23 (WT)或突变体匪23-S120G的三种不同制剂的不同多聚化状态。野生型匪23示出了相应于六聚体的分子量的单峰和相应于较高阶多聚体的肩(shoulder)。没有复性(再折叠)的匪23-S120G(标记为“混合的”)的一种制剂具有相应于二聚体的主峰和四聚体的次峰。也没有复性的匪23-S120G( “六聚体”)的另一种制剂具有具备较高阶多聚体的肩的六聚体的主峰。NM23-S120G( “二聚体”)的复性制剂主要由二聚体组成。
[0039]图17A 示出了 NM23-WT、混合的 NM23-S120G、NM23-S120G-六聚体和匪23-S120G- 二聚体的非还原性凝胶的照片，示出了野生型蛋白和S120G突变体的三种不同制剂的多聚化状态。图17B示出了结合连接至SPR芯片表面的MUC1*胞外结构域肽(PSMGFR)的不同的匪23多聚体的表面等离子体共振(SPR)测量结果。图17C示出了表明仅匪23 二聚体结合至同源受体MUC1*的纳米颗粒实验的照片。MUC1*胞外结构域肽固定在金纳米颗粒上。图17D-G示出了针对它们支持多能性干细胞生长的能力测试的不同匪23-H1多聚体。
[0040]图18示出了表明匪23-WT的多聚化状态对重组NM23-S120G的三种不同制剂的天然非变性凝胶。
[0041]图19示出了 A)NM23野生型(WT)和B)产生60%二聚体的“混合”NM23-S120G的制剂的SPR测量结果。
[0042]图20示出了基质胶(a、b、d、e)以及用抗-MUC1*抗体、MN_C3 (C、f)涂覆的细胞培养板上的最小干细胞培养基中的8nM的匪23变体中培养的人类ES细胞、BGOlv/hOG系的照片，(a-c)变体是P96SAC2，(d_f)变体是P96SAC6。这些变体不能复性或纯化，表明在使用之前它们不需要复性或纯化。
[0043]图21示出了 NM23-S120G(复性的，“RS”)的主要群体以FPLC迹线(a)中示出并且通过非还原PAGE (b)验证的二聚体存在。混合并且以8nM在最小干细胞培养基下使用仅通过FPLC纯化部分的二聚体以生长人ES细胞、BGOlv/hOG系。人类干细胞的(c_e)照片示出:在8nM的匪23变体中培养，是否在基质胶(c、f)或在用抗-MUC1*抗体、丽-C3 (e)涂覆的细胞培养基板上产生多能性干细胞。
[0044]图22示出已经在用m LIF或NM23-S120G-RS补充的小鼠ES细胞最小培养基中的失活的MEF饲养细胞层上培养两天的小鼠胚胎干(ES)细胞的照片。图像表明在具有mLIF作为碱性生长因子的标准小鼠干细胞培养基中小鼠ES细胞与使用匪23 二聚体作为唯一的生长因子一样生长。
[0045]图23示出检测匪23-S120G 二聚体中培养、MEF上的bFGF中培养的人类干细胞或人类乳腺癌细胞中NME1(A、D)、NME6(B、E)或NME7(C、F)的存在或MUC1*拉下试验中的NME同种型的存在的蛋白质印迹的照片。
[0046]图24示出了针对NME7特异性的抗体所探测的人胚胎干细胞溶解产物的蛋白质印迹的照片。
[0047]图25示出了在大肠杆菌中表达的NME7-1⑷和NME7-2⑶的SDS-PAGE的照片。
[0048]图25.1是来自NME7-1和NME7-2表达并且通过NTA-Ni柱纯化的非还原SDS-PAGE凝胶，表明在~40kDa的期望分子量下有很少或没有蛋白表达。
[0049]图25.2是通 过NTA-Ni柱的NME7-1和NME7-2纯化的洗脱物的蛋白质印迹，表明在~40kDa的期望分子量下有一些NME7-1和NME7-2表达。
[0050]图26是来自NME7-AB和NME7-A表达并且通过NTA-Ni柱纯化的非还原SDS-PAGE凝胶，表明对于NME7-AB在~30kDa的期望分子量下有良好表达(A)，但对于NME7-A在~14kDa的期望分子量下没有良好表达(B)。
[0051]图27 (A)是NME7-AB的尺寸排阻色谱法纯化的洗脱曲线；⑶是来自NME7-AB峰部分的非还原SDS-PAGE凝胶；(C)是纯化的NME7-AB的尺寸排阻色谱法的洗脱曲线。
[0052]图28A-28D是涂板后(接种后，post-plating) I天的重组NME7-AB或重组匪23 (NMEl)纯化二聚体中培养的人类iPS干细胞的放大的照片。
[0053]图29A-29D是涂板后2天的重组NME7-AB或重组匪23 (NMEl)纯化二聚体中培养的人类iPS干细胞的放大的照片。
[0054]图30A-30D是涂板后3天的重组NME7-AB或重组匪23 (NMEl)纯化二聚体中培养的人类iPS干细胞的放大的照片。
[0055]图31A-31G示出了在基于FGF的培养基或基于NME的培养基中进行多能性诱导的体细胞的曲线图和照片。A-C是示出多能性诱导过程的第4天和第20天下的多能性标记的RT-PCR测量结果的曲线图。D-G示出了使用利用标准FGF培养基或省去一个多能性基因并且在NMEl 二聚体培养基中培养细胞的标准方法将代表性细胞诱导至多能性的共焦显微镜图像的照片。
[0056]图32A-32E示出了由癌细胞和干细胞的MUC1*拉下试验导致的蛋白质印迹，其中，用针对NME1、NME6和NME7的抗体探测由MUC1*抗体拉下(pull down)的物种。
[0057]图33A-33C示出了纳米颗粒结合试验的照片，其中，将MUC1*胞外结构域肽固定至SAM涂覆的纳米颗粒上并且将NME蛋白以游离态添加至溶液中。由粉红色至蓝色的颜色变化表明溶液中的游离蛋白能够同时结合至两种不同纳米颗粒的两种肽上。
[0058]图34A-34F示出了在标准FGF培养基或NME7培养基中生长，然后针对DAP1、0CT4和H3K27me3染色(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活X染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)的人胚胎干(ES)细胞的照片。
[0059]图35示出了在NME1(NM23-S120G 二聚体)培养基中生长，然后针对DAP1、0CT4和H3K27me3(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活X染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)细胞的照片。
[0060]图36A-36H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚体)培养基中生长，然后针对DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活X染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)细胞的照片。
[0061]图37A-37D示出了在NME1(NM23-S120G 二聚体)培养基中生长，然后针对DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活X染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)细胞的照片。
[0062]图38A-38H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚体)培养基中生长，然后针对DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活X染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)细胞的照片。
[0063]图39A-39H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚体)培养基中生长，然后针对DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活X染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)细胞的照片。
[0064]图40示出了前X染色体失活(pre-X-1nactivation)作为传代数和细胞是否在NMEl或NME7中培养的函数的自动计数的细胞百分数的条形图。
[0065]图41A示出了来自其中起于1，000,3, 000或5，000单个接种细胞的离散群体用表明在基于NME的培养基中培养的干细胞具有~20%的克隆效率的碱性磷酸酶染色的克隆效率(克隆效率，cloning efficiency)试验的人胚胎干细胞的照片。
[0066]图41B示出了来自其中起于1，000,3, 000或5，000单个接种细胞的离散群体用表明在基于FGF的培养基中培养的干细胞具有~I %的克隆效率的碱性磷酸酶染色的克隆效率试验的人胚胎干细胞的照片。
[0067]图41C示出了用于克隆效率试验的细胞数计数的表格。
[0068]图42示出了用抗-MUC1*抗体(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NMEl 二聚体(“^23-RS”)中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第2天的照片(4X)。
[0069]图43示出了用抗-MUC1*抗体(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NMEl 二聚体(“^23-RS”)中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第2天的照片(IOX)。
[0070]图44示出了用抗-MUC1*抗体(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NME7中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第2天的照片(4X)。
[0071] 图45示出了用抗-MUC1*抗体(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NME7中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第2天的照片(IOX)。
[0072]图46示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NME7中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第2天的照片(4X)。
[0073]图47示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NME7中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第2天的照片(IOX)。
[0074]图48示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NME7中培养的6孔组织培养板上接种的人类iPS细胞第4天的照片(IOX)。
[0075]图49示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NME7中培养的6孔组织培养板上接种的人胚胎干(ES)细胞第3天的照片(IOX)。
[0076]图50示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在最小干细胞培养基(MM)或甚至更小的称为MN6的培养基中的NMEl 二聚体(“^23-RS”)中培养的6孔组织培养板上接种的人胚胎干(ES)细胞第3天的照片(10X)。
[0077]图51示出了在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，用于接种在基于FGF的培养基(MM或E8中的标准bFGF)、或添加至MM培养基的NME7、或MN6培养基中培养的基质胶上的干细胞的多能性基因以及原始和致敏(primed)基因的RT-PCR测量结果的曲线图。
[0078]图52示出了用于接种在用识别MUC1*胞外结构域(MN-C3)的抗体涂覆并且在向其加入匪23 二聚体(NME1 S120G 二聚体)或NME 7的丽最小培养基中培养的塑料制品(plasticware)上的人胚胎干细胞的原始和致敏基因的RT-PCR测量结果的曲线图。
[0079]图53示出了用于接种在用抗-MUC1*抗体(C3)、MEF饲养细胞涂覆的塑料制品或基质胶上的人类ES细胞的多能性基因以及原始和致敏基因的RT-PCR测量结果的曲线图。在最小培养基(MM)加NM23 (NMEI 二聚体)或NME7-AB中培养VITA/C3抗体表面上的细胞。在MM加FGF中培养通过MEF接种的细胞。在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在MM培养基或MN6培养基中的NME7中培养基质胶上的细胞用于单次传代。
[0080]图54示出了用于接种在用抗-MUC1*抗体(C3)、MEF饲养细胞涂覆的塑料制品或基质胶上的人类ES细胞的多能性基因以及原始和致敏基因的RT-PCR测量结果的曲线图。在最小培养基(MM)加NM23 (NMEI 二聚体)或NME7-AB中培养VITA/C3抗体表面上的细胞。在MM加FGF中培养通过MEF接种的细胞。在存在或不存在rho激酶抑制剂(ROCi)的情况下，在MM培养基或MN6培养基中的匪23 (NMEI 二聚体)中培养基质胶上的细胞用于单次传代。
[0081]图55A-55C示出了表明NME7物种在干细胞溶解产物(A、C)和干细胞条件培养基(B)中表达的蛋白质印迹的照片。
[0082]图56示出了探测其中一些0CT4、NME1、NME6或NME7被抑制而细胞在包含NME7的培养基中被培养的人类干细胞中的NME7物种的蛋白质印迹的照片。
[0083]图57示出了其中由NME7拉下试验获得的蛋白质在凝胶、离体带上分离并且通过质谱分析的SDS-PAGE凝胶的照片。质谱表明由NME7抗体拉下的低分子量(~23kDa)物种也是NME7，但是NME7物种中的肽序列均映射至NME7的NDPK A结构域。
[0084]图58示出了来自表明NME7-AB使MUCI*胞外结构域肽二聚化的ELISA夹心式试验的HRP信号的曲线图。
[0085]图59A-59B示出了表明NME6在大肠杆菌中表达和纯化的SDS-PAGE凝胶的照片。
【具体实施方式】
[0086]定义
[0087]主要通过PSMGFR 序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQID NO:6))定义MUC1*胞外结构域。由于MUCl裂解的确切部位取决于修剪其的酶，并且裂解酶根据细胞类型、组织类型或细胞进化的时间变化，MUC1*胞外结构域的准确序列可以在
N-端变化。
[0088]为数1-10个的NME家族蛋白是由于它们均具有至少一个NDPK (核苷二磷酸激酶)结构域而分组在一起的蛋白。在一些情况下，NDPK结构域在能够催化ATP转化为ADP方面不起作用。NME蛋白被正式称为匪23蛋白、编号H1、H2等。在此，术语匪23和NME可互换。在此，术语NMEl、NME2、NME6和NME7用于指原始蛋白以及NME变体(变异体)。在一些情况下，这些变体在大肠杆菌中更易溶解、表达更好或比原始序列蛋白更易溶解。例如，如在说明书中使用的NME7可以指原始蛋白或变体，如由于变异使得可溶解、适当复性的蛋白在大肠杆菌中高产率表达的具有优越的商业应用的NME7-AB。如本文中论及的“NME1”可与“匪23-H1”互换。还预期的是本发明不受限于NME蛋白的确切序列。贯穿本申请，可互换地使用也称为匪23-S120G的突变体NME1-S120G。由于它们对于二聚体(但本文中可论及的是作为匪23 二聚体或NMEl 二聚体)形成的优先性，优选S120G突变体和P96S突变体。
[0089]如在本文中所论及的NME7旨在指原始NME7或增加产率、可溶解性或使得NME7更有效或商业更可行的其他性能的变体。
[0090]如在本文中使用的，FGF、FGF_2、或bFGF是指成纤维细胞生长因子。
[0091] 如在本文中使用的，Rho相关激酶抑制剂可以是小分子肽或蛋白(Rath N，OlsonMF.Rho-associated kinases in tumorigenesis: re-considering ROCK inhibition forcancer therapy.EMBO Rep.2012 ；13(10):900-8)。rho 相关激酶抑制剂的实例是 Y27632、HA-1077 (也称为法舒地尔)、H-1152 和 thiazovivin (Olson MF.(针对 ROCK 激酶抑制剂的应用)Application for ROCK kinase inhibition.Curr Opin Cell Biol.2008 ；20(2):242-8 ;Watanabe K，Ueno M，Kamiya D，et al.(ROCK 抑制剂允许相关人胚胎干细胞的生存)A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stemcells.Nat Bio techno 1.2007 ；25 (6): 681-6 ;Brei ten lechner C，Gassel M，Hidaka H，etal.Protein kinase A in complex with Rho-kinase inhibitors Y—27632，Fasudil，andH-1152P:structural basis of selectivity.Structure.2003 ； 11 (12):1595-607 ；LinT，Ambasudhan R，Yuan X，et al.A chemical platform for improved induction of humaniPSCs.Nat Methods.2009 ；6(11):805-8)。除了 Rho激酶抑制剂之外，本发明想象使用代替Rho激酶抑制剂的相关路径的抑制剂。例如，在相同路径中，鸟嘌呤交换因子(GEF)是Rho激酶的上游。GEF活化Rho激酶。因此，代替使用rho激酶抑制剂，本发明想象使用GEF抑制剂。由于当结合至GDP时，rho激酶处于失活状态，可以使用增加存在于细胞如RAD、GEM、和RhoE以及其他中的GDP的量的任何试剂代替rho激酶抑制剂以帮助干细胞生长、存活和连接至它们所在位置处的表面(Riento K, Guasch RM, Garg R, Jin B, Ridley AJ (2003)(RhoE 结合至 ROCKI 并抑制下游信号)RhoE binds to ROCKI and inhibits downstreamsignaling.Mol Cell Biol 23:4219-4229 ；Komander D, Garg R, Wan PT, Ridley AJ, BarfordD (2008)来自ROCK-1:RhoE复合物结构的多位憐酸化机理(Mechanism of mult1-sitephosphorylation from a ROCK-1:RhoE complex structure).EMBO J27:3175-3185 ；ffardY, Yap SF, Ravichandran V, Matsumura F, Ito M, Spinelli B, Kelly K(2002)GTP 结合蛋白Gem 和 Rad 是 Rho-Rho 激酶路径的隐性调节(The GTP binding proteins Gem and Rad arenegative regulators of the Rho-Rho kinase pathway).J Cell Biol 157:291-302)。肌球蛋白也处于与Rho激酶一样的路径中。肌球蛋白间接地由Rho激酶活化并且因此在相同路径中作为Rho激酶的下游。因此，根据本发明的方法，也可以使用肌球蛋白抑制剂代替rho激酶抑制剂以帮助干细胞存活和/或帮助干细胞连接至表面。Blebbistatin是肌球蛋白抑制剂并且可以用于代替根据本发明的方法使用的任何rho激酶抑制剂(Ohgushi M, MatsumuraM, Eiraku M, Murakami K, Aramaki T, Nishiyama A, et al.负责人类多能性干细胞中的离解-诱导凋亡的分子路径和细胞状态(Molecular pathway and cell state responsiblefor dissociation-1nduced apoptosis in human pluripotent stem cells).Cell StemCell2010 ；7:225-39 ；Ohata H, Ishiguro T, Aihara Y, et al.通过 Rho 激酶抑制剂引入干细胞样细胞调节剂⑶44有助于维持结肠癌症起始细胞(Induction of the Stem-like CellRegulator CD44by Rho Kinase Inhibition Contributes to the Maintenance of ColonCancer-1nitiating Cells).Cancer Res.2012 ；72 (19): 5101-10)。
[0092]在此处和其他地方，Rho激酶抑制剂简称为ROCi或ROCKi。具体的rho激酶抑制剂的使用旨在示例性的并且可以 替换为任何其他的rho激酶抑制剂。
[0093]序列表自由文本(sequence listing free text)
[0094]关于除a、g、c、t的核苷酸符号的使用，它们遵循WIPO标准ST.25，附录2，表1中列出的规则，其中，k代表t或g ;n代表a、C、t、或g ；m代表a或c ;r代表a或g ;s代表c或g 代表a或t,并且Y代表c或t。
[0095]MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSATQRSSVPSSTE KNAVSMTSSVLSSHSPGSGS STTQGQDVTLAPATEPASGS AATffGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTSASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGffG IALLVLVCVLVALAIVYLIA LAVCQCRRKNYGQLDIFPAR DTYHPMSEYPTYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA
[0096]ASANL(SEQ ID NO:1)描述了全长MUCl受体(粘蛋白I前体，Genbank登录号:P15941)。
[0097]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO:2)
[0098]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO: 3)
[0099]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO: 4) [0100]SEQ ID NOS:2、3和4描述了用于将MUCl受体和截短的同种型指向细胞膜表面的N-端MUC-1信号序列。在由SEQ ID NOS:2、3和4中的变体指明的C-端可以缺失多达3个
氨基酸残基。
[0101]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSRYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 5)描述了在其N-端具有nat-PSMGFR并且包括跨膜和全长MUCl受体的细胞质序列的截短MUCl受体同种型。
[0102]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)描述了 MUCl生长因子受体(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的实例)的天然一级序列(primary sequence)。
[0103]TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:7)描述了 MUCl 生长因子受体(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的实例)的天然一级序列，在SEQ ID NO:6的N-端具
有单一的氨基酸缺失。
[0104]GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:8)描述了具有增强的稳定性的MUCl生长因子受体(var-PSMGFR- “PSMGFR”的实例)的天然一级序列的“SPY”功能变体。
[0105]TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:9)描述了具有增强的稳定性的MUCl生长因子受体(var-PSMGFR- “PSMGFR”的实例)的天然一级序列的“SPY”功能变体，在SEQ ID NO: 8的C-端具有单一的氨基酸缺失。
[0106]tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQ IDNO: 10)描述了 MUCl细胞质结构域核苷酸序列。
[0107]CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 11)描述了 MUCl 细胞质结构域氨基酸序列。
[0108]Gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQ ID NO: 12)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7:GENBANKACCESSIONAB209049)。
[0109]DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO: 13)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7:GENBANK ACCESSION AB209049)。
[0110]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtcca ttctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO: 14)描述了 NM23-H1 核苷酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0111]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAlKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLffFHPEEL VDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO: 15)NM23-H1 描述了氨基酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0112]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO: 16)描述了 NM23-H1 S120G突变体核苷酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSIONAF487339)。
[0113]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHG⑶SVESAEKEIGLWFHPEEL VDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 17)描述了 NM23-H1 S120G 突变体氨基酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0114]atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO: 18)描述了 NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2:GENBANK ACCESSIONAK313448)。
[0115]MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGE11KRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDffVYE(SEQ ID NO: 19)描述了 NM23-H2 氨基酸序列(NM23-H2:GENBANK ACCESSIONAK313448)。
[0116]最佳用于大肠杆菌表达的人匪23-H7-2序列。
[0117](DNA)
[0118]atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:20)
[0119](氨基酸)
[0120]MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAlRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:21)
[0121]人NME7-A:
[0122](DNA)
[0123]Atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO:22)
[0124](氨基酸)
[0125]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIΑΜΕ ILRDDAI CEffKRLLGPANSGVARTDASES IRALFGTDGIR NAAHGPDSFASAAREMELFF- (SEQ ID NO:23)
[0126]人NME7-A1:
[0127](DNA)
[0128]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQ IDNO:24)
[0129](氨基酸)
[0130]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR N A AHGPD SFAS A AREMELFFPS S GGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:25)
[0131]人NME7-A2:
[0132](DNA)
[0133]atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct tttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO: 26)
[0134](氨基酸)
[0135]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:27)
[0136]人NME7-A3:
[0137](DNA)
[0138] atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgt
【权利要求】
1.一种用于细胞生长、维持和诱导回复至较不成熟状态的细胞培养基，包含MUC1*激活配体。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述细胞是成熟细胞、体细胞或祖细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述细胞是人细胞。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述培养基不含bFGF、TGF-β、或两者。
6.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述培养基不含血清。
7.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述培养基进一步包含胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸、或非必需氨基酸。
8.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述MUC1*配体是NME家族蛋白。
9.根据权利要求8所述的细胞培养基，其中，所述NME家族蛋白是NMEl。
10.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，NMEl以二聚化或设计为具有两个亚基的单链的两种单体存在。
11.根据权利要求8所述的细胞培养基，其中，所述NME家族蛋白是ΝΜΕ7。
12.根据权利要求11所述的细胞培养基，其中，所述ΝΜΕ7具有约25kDa或约30kDa的分子量。
13.根据权利要求8所述的细胞培养基，其中，所述NME家族蛋白是NME7-AB。
14.根据权利要求8所述的细胞培养基，其中，所述NME家族蛋白是NME6。
15.根据权利要求1所述的细胞培养基，进一步包含rho相关激酶抑制剂。
16.根据权利要求1所述的细胞培养基，进一步包含在PI3K或RAC通路中并且不存在rho激酶抑制剂下的信号蛋白激活剂。
17.根据权利要求1所述的细胞培养基，进一步包含抑制NMEl或NME2表达的核酸。
18.根据权利要求1所述的细胞培养基，进一步包含其他生长因子。
19.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中，所述其他生长因子是FGF-2和/或TGF- β。
20.一种包括使细胞与含有NME家族蛋白的细胞培养基接触以刺激干细胞或祖细胞生长或诱导细胞回复至较不成熟状态的方法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述细胞是体细胞。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述细胞是人细胞。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基不含bFGF、TGF-β、或两者。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基不含血清。
26.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基进一步包含胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸、或非必需氨基酸。
27.根据权利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NMEl。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，NMEl以二聚化或设计为具有两个亚基的单链的两种单体存在。
29.根据权利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是ΝΜΕ7。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述ΝΜΕ7具有约25kDa或约30 kDa的分子量。
31.根据权利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME7-AB。
32.根据权利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME6。
33.根据权利要求20所述的方法，进一步包括胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸，使用NaHCO3 调节 pH。
34.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基进一步包含rho激酶抑制剂。
35.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基进一步包含在PI3K或RAC通路中并且不存在rho激酶抑制剂下的信号蛋白激活剂。
36.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基进一步包含抑制NMEl或NME2表达的核酸。
37.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基进一步包含鸟嘌呤交换因子抑制剂。
38.根据权利要求29所述的方法，其中，所述鸟嘌呤交换因子抑制剂是六聚体形式的NMEl0
39.根据权利要求29所述的方法，其中，所述鸟嘌呤交换因子抑制剂是获得自NMEl的肽。
40.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基进一步包含其他生长因子。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述其他生长因子是FGF-2和/或TGF-β。
42.一种细胞培养基，基本上由NME家族蛋白，加上用于生长或维持干细胞的基础培养基和非必需氨基酸组成。
43.一种包括使细胞与基本上由NME家族蛋白组成的细胞培养基接触以刺激干细胞或祖细胞生长或诱导细胞回复至较不成熟状态的方法。
44.一种包含干细胞群的组合物，其中，所述组合物进一步包含含有NME家族蛋白的无血清培养基。
45.一种在其上是结合至祖细胞或干细胞的配体的表面上增殖干细胞或祖细胞的方法，包括使所述细胞与包括NME家族蛋白的培养基接触。
46.一种制造原始干细胞的纯群体的方法，包括: (i)使细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的单集落； (?)分离原始干细胞的所述单集落；以及 (iii)使所述集落与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的纯群体。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，在步骤⑴中，获得约25%至60%的原始状态的细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，获得约30%至50%的所述原始状态的细胞。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，在步骤(iii)中，所述原始干细胞群体的纯度为至少约80%。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述原始干细胞群体的纯度为至少约90%。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述原始干细胞群体的纯度为至少约95%。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述原始干细胞群体的纯度为至少约99%。
53.一种由诱导的多能性干细胞制造原始干细胞的纯群体的方法，包括: (i)使成熟细胞或祖细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的单集落； (?)分离原始干细胞的所述单集落；以及 (iii)使所述集落与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的纯群体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，步骤(i)中，所述成熟细胞用多能性基因转染。
55.根据权利要求53所述的方法，其中，所述成熟细胞或祖细胞是体细胞、成真皮细胞、或成纤维细胞。
56.根据权利要求53所述的方法，其中，在步骤(i)中，获得约25%至60%的原始状态的细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，获得约30%至50%的所述原始状态的细胞。
58.根据权利要求53所述的方法，其中，在步骤(iii)中，所述原始干细胞的群体的纯度为至少约80%。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述原始干细胞的群体的纯度为至少约90%。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述原始干细胞的群体的纯度为至少约95%。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述原始干细胞的群体的纯度为至少约99%。
62.一种生成人胚胎干细胞系的方法，包括: (i)使获得自胚泡的细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触； (?)分离具有干细胞样形态的长出物； (iii)使所述分离的长出物与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触；以及 (iv)并且分离具有期望的核型以及表明所述细胞是多能性的多能性基因和原始基因的表达水平的克隆。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME7。
64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述NME7是NME7-AB。
65.根据权利要求62所述的方法，其中，包含所述NME家族成员的所述培养基不包含FGF。
66.根据权利要求62所述的方法，包括抑制所述细胞中的NMEl和NME2。
67.一种生成人诱导多能性干细胞系的方法，包括: (i)使获得自供体或患者的细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触； (ii)使所述细胞与诱导多能性基因0CT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-Myc或LIN28表达的试剂接触； (iii)分离具有干细胞样形态的细胞； (iv)使所述分离的细胞与包含NME家族蛋白的细胞培养基接触； (v)分离具有期望的核型以及表明所述细胞是多能性的多能性基因的表达水平的克隆；以及 (vi)并且在包含NME家族成员的培养基中繁殖克隆。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME7。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述NME7是NME7-AB。
70.根据权利要求67所述的方法，其中，包含所述NME家族成员的所述培养基不包含FGF。
71.根据权利要 求67所述的方法，包括抑制所述细胞中的NMEl和NME2。
【文档编号】C12N5/00GK103998598SQ201280062509
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2011年10月17日
【发明者】辛西娅·巴姆达德, 贝努瓦·J·斯马格 申请人:米纳瓦生物技术公司