用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌的方法

用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌的方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶(水解广谱头孢菌素的β-内酰胺酶)的细菌的方法，所述方法包括步骤：a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液；b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β-内酰胺酶底物，pH颜色指示剂，当反应混合物的pH为6.4-8.4时，所述pH颜色指示剂将改变颜色，其中步骤b)后的颜色变化指示所述测试样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌。本发明还涉及试剂盒、微量滴定板和它们在检测测试样品中存在广谱β-内酰胺酶产生菌中的用途。
【专利说明】用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于检测临床样品中或来自培养细菌中存在广谱β_内酰胺酶（水解 广谱头孢菌素的β-内酰胺酶）的方法。

【背景技术】
[0002] 革兰氏阴性菌是医院和社区获得性感染的重要原因，其中大肠杆菌是最重要 的人病原体。多重耐药肠杆菌科细菌（大肠杆菌（Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumonia)、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis)，粘质沙雷氏菌（Serratia marscescens)，肠杆菌属（Enterobacter spp). ··)假单胞菌属（Pseudomonas sp.)和鲍曼 不动杆菌（A. baumannii)经常与有限的治疗选择相关。那些多药耐药分离株主要表达针对 广谱头孢菌素（诸如头孢噻肟、和/或头孢他啶、和/或头孢吡肟、和/或氨曲南）具有广 谱活性的β-内酰胺酶。那些广谱β-内酰胺酶的产生菌可能难以使用常规抗生素敏感性 试验来检测，并且最初可能似乎对几种广谱头孢菌素分子敏感。产生广谱β-内酰胺酶的 细菌的不准确和/或延迟鉴定已导致抗生素治疗的相关不当选择和治疗失败。因此，广谱 β-内酰胺酶产生菌的产生菌的快速和最佳检测在临床环境中具有主要重要性。
[0003] β -内酰胺酶通常根据两种不同的总体方案分类；Ambler分子分类和 Bush-Jacoby-Medeiros功能分类。Ambler方案根据酶的蛋白同源性将β-内酰胺酶分为 四类，Α类、C类和D类β -内酰胺酶是丝氨酸-β -内酰胺酶，Β类酶是金属β -内酰胺 酶。第二种分类是基于酶的功能特性的Bush-Jacoby-Medeiros功能功能方案。术语"广 谱β-内酰胺酶（ESBL)最初应用于可以水解氧亚氨基头孢菌素的TEM和SHV衍生物，其在 1980年代用Bush-Jacoby-Medeiros功能方案分类在2be组中。那些酶属于β -内酰胺酶 的Ambler Α类组，且其活性受Α类抑制剂诸如他唑巴坦、克拉维酸和舒巴坦抑制。已经描 述了超过700种不同的β-内酰胺酶，它们中的许多水解广谱头孢菌素，且属于酶的Ambler 组的每种类型。此外，那些广谱酶中的几种不仅可以水解头孢菌素，而且可以水解作为具有 最广谱活性的β_内酰胺的碳青霉烯。
[0004] 因此，广谱β -内酰胺酶可以如下分组在酶的每种Ambler类内。
[0005] 1-Ambler A类酶；它们受克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制。这些酶（ESBL)主要 是SHV、TEM和CTX-M组。尽管在作为基于医院的感染源的肠杆菌科细菌（肺炎克雷伯菌、 肠杆菌属）中主要报道了 SHV和TEMESBLS，但CTX-MS也正成为社区患者的主要威胁。它 们可以在世界的某些地区，诸如在亚洲的高达60至80%的大肠杆菌分离株中鉴定到。它们 不仅在尿路感染（这是由于大肠杆菌导致的感染的主要来源）中鉴定到，而且在严重得多 的感染诸如肺炎和败血症中鉴定到。CTX-Ms酶主要在可转移质粒上肠杆菌科细菌中鉴定 至IJ。此外，该类的一些酶，诸如KPC酶可以水解碳青霉烯。
[0006] 2-Ambler B类酶。这些酶具有所有额外特性来水解碳青霉烯，其不仅受克拉维酸、 他唑巴坦和舒巴坦抑制，而且受添加锌的螯合剂（EDTA)抑制。这些金属β-内酰胺酶主要 在医院获得性病原体诸如肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼 不动杆菌中鉴定到。它们主要是頂P、ViM和NDM类型。
[0007] 3-Ambler C类酶或通常已知为"头孢菌素酶"以不同程度水解广谱头孢菌素。它 们的活性受氯唑西林和其它甲氧西林相关分子以及受硼酸抑制。它们在许多肠细菌种（肠 杆菌属，沙雷氏菌属，弗氏朽 1檬酸杆菌（Citrobacter freundii)...)、铜绿假单胞菌和鲍曼 不动杆菌中鉴定到。这些染色体编码的酶在那些野生型菌种中以低水平表达，这解释了为 什么它们仍然对许多广谱头孢菌素（特别是头孢他定）敏感。当以高水平表达时，它们赋 予针对那些头孢菌素的获得性耐药性表型。此外，那些头孢菌素酶基因可以在许多其它肠 杆菌种（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、沙门氏杆菌（Salmonella))中的质粒上 鉴定到，这解释了针对头孢菌素的获得性耐药性的性状。从临床观点来看，获得性质粒介导 的头孢菌素比CTX-Ms (它们在相同分离株中可以与其相关）较不频繁。
[0008] 4-具有水解头孢菌素的广谱能力的Ambler D类酶已经主要在铜绿假单胞菌 (0XA-10衍生物）中报道。它们的活性既不受克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制，也不受 EDTA抑制。
[0009] 考虑到ESBL在任何临床环境（急性护理设施、长期护理设施、社区）中的重要性， 检测一直聚集于那些ESBL。
[0010] 推荐至少所有临床重要的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌应当接受针对ESBL的筛选。 推荐应当使用表型验证性测试来研究对于头孢泊肟具有MIC > 8mg/L或针对头孢他啶、头 孢噻肟、头孢曲松或氨曲南具有MIC > 2mg/L的那些菌种。在那些表型测试中，比较针对单 独的头孢噻肟、头孢他啶或其与A类β-内酰胺酶抑制剂的敏感性。为此目的首先建议双 纸片协同测试（double disk synergy test)。该测试在琼脂平板上进行，所述琼脂平板具 有一个含有头孢噻肟（30 μ g)的纸片和一个含有阿莫西林/克拉维酸（分别20 μ g/ΙΟ μ g) 的纸片，所述纸片分开30mm放置（中心到中心）。围绕朝向阿莫西林/克拉维酸纸片的头 孢噻肟纸片的抑制圈的延伸表示ESBL的产生。含有其它氧亚氨基-β-内酰胺（头孢曲松、 头孢他啶或氨曲南）的纸片可以取代头孢噻肟纸片。"Etest?"技术还用于检测ESBL。它 是一种测定许多微生物的抗菌敏感性的定量技术。该系统包含用于测定抗微生物的不同的 抗菌剂的最低抑菌浓度（MIC，mg/L)的预定义的抗生素梯度，所述最低抑菌浓度在琼脂培 养基上采用过夜培养来测试。在ESBL检测的情况下，E-测试条可以浸渍，其中一侧含有头 孢他啶的浓度梯度，另一侧含有头孢他啶的浓度梯度加上克拉维酸的恒定浓度。已经开发 了浸渍有头孢噻肟/克拉维酸或头孢吡肟克拉维酸的类似条。当在克拉维酸存在的情况下 观察到测试药物的MIC值降低超过3倍时，Etest ESBL的结果被解释为阳性。双纸片测试 和E-测试的灵敏度和特异性是相当好的，范围为80%至95%。
[0011] 在产生ESBL的生物体的检测中使用细菌鉴定和敏感性试验的自动化方法。 BD Phoenix系统（Becton-Dickinson)使用其专业软件来解释含或不含克拉维酸的情 况下针对头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和头孢泊肟的生长应答。类似地，Vitek2系统 (bioM6rieux)使用含有单独的头孢他陡和头孢噻|亏或其与克拉维酸的组合的卡片。头 孢他陡、头孢噻厢加上β -内酰胺酶抑制剂也用于MicroScan Walkaway-96系统（Dade Behring)中。那些系统的性能不同，并且与经研究具有比特异性（50%至80%)高得多的 灵敏度（80%至99%)的菌种不同。
[0012] 基于PCR和其它分子技术也可有助于鉴定ESBL基因，但它们是耗时且昂贵的。那 些基于PCR的技术需要在敏感性试验和表型鉴定之前从临床样品中分离细菌。因此，那些 结果最快可以在获得临床样品之后48小时获得。它们通常不在常规实验室中进行，但限于 流行病学目的。
[0013] 因为患有由于产生ESBL的肠杆菌导致的感染的患者倾向于具有与感染不产生 ESBL的病原体的那些患者相比不那么令人满意的结果，所以尽可能早地检测那些ESBL产 生菌是重要的。
[0014] 为促进临床微生物学领域内广谱β -内酰胺酶（特别是ESBL)产生菌的检测，申 请人开发了一种基于简单的酸比色技术的新方法。该方法基于以下概念：通过水解广谱头 孢菌素底物的β内酰胺环，该酶产生羧基，其反过来酸化介质。然后，由该水解产生的酸性 通过pH颜色指示剂的颜色变化来鉴定。
[0015] 该方法有助于从不是产生菌中的那些中区分广谱β -内酰胺酶产生菌。
[0016] 可解释的结果在非常短的时间内获得，当设计处理产生菌时，这是关键的。其消除 了使用以上提及的表型技术的需要。
[0017] 该方法提供了一种检测广谱β -内酰胺酶产生菌（特别是ESBL产生菌）的快速、 可靠和可负担的方法。它也可以经历产业化过程，使得其可在全世界任何临床微生物学实 验室中实施，而实验室技术人员无需大量额外的工作量。其可以直接与临床样品一起使用， 还可以在菌落阶段生长的细菌上使用。
[0018] 此外，在流行病学领域，当想要快速选择应该通过PCR测试并测序从而鉴定广谱 β_内酰胺酶基因的菌株时，使用该方法可能是进一步有用的。
[0019] 发明概述
[0020] 本发明涉及一种用于检测样品中存在产生广谱β -内酰胺酶的方法，所述方法包 括步骤：
[0021] a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液；
[0022] b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含
[0023] -作为底物的广谱头孢菌素或氨曲南
[0024] -pH颜色指示剂，当反应混合物的pH为6. 4-8. 4时，所述pH颜色指示剂将变色，
[0025] 其中步骤b)后的颜色变化指示所述测试样品中存在产生ESBL-或非ESBL广谱 β-内酰胺酶的细菌。
[0026] 本发明还涉及试剂盒，其包含选自头孢菌素和头霉素的广谱头孢菌素或氨曲南或 头孢菌素酶（cephalosporinase)底物和pH颜色指示剂，以及所述试剂盒在检测测试样品 中存在产生ESBL-和或非ESBL广谱β -内酰胺酶的细菌的用途。
[0027] 本发明还涉及包含含有选自头孢菌素或氨曲南的碳青霉烯酶底物的孔或一系列 孔的微量滴定板，其在检测测试样品中存在产生ESBL和/或非ESBL广谱β -内酰胺酶的 细菌的用途，和其在最终测定测试样品中存在的产生广谱β_内酰胺酶的细菌的特定种类 的用途。
[0028] 发明详述 [0029]定义：
[0030] 如本文所使用，"测试样品"是指可包含产生ESBL-或非ESBL广谱β-内酰胺酶的 细菌的待测试的任何液体或固体材料。通常，细菌菌落可与这种材料分离。优选的"测试样 品"是生物样品。
[0031] 如本文所使用，"生物样品"是指从受试者获得的任何生物样品。这种"生物样品" 的实例包括体液、组织、细胞样品等。优选的"生物样品"是全血、血清、血浆或尿。
[0032] 如本文所使用，"受试者"表示哺乳动物，诸如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵 长类动物。优选根据本发明的"受试者"是人。
[0033] 如本文所使用，"pH颜色指示剂"是齒色化化合物（halochromic chemical compound),其以少量添加至溶液中，使得溶液/介质的pH可以肉眼测定。指示剂引起溶液 /介质的颜色基于pH而改变。
[0034] 如本文所使用，"酶悬液"是指根据本发明方法的细胞裂解步骤（步骤a)促进存在 于所述测试样品的细胞内的酶释放，从而获得"酶悬液"。
[0035] 如本文所使用，"部分"是指采用根据本发明方法的步骤a)中获得的酶悬液的全部 或部分以与步骤b)的试剂盒反应。通常，根据本发明的"部分"是一部分酶悬液。优选地， 根据本发明的"部分"是10 μ L至50 μ L。
[0036] 如本文所使用，"试剂盒"是指包含多种不同的组分作为组合产品用于在本发明 方法中单独、同时或连续使用的产品。优选地，所述组分是选自头孢菌素和氨曲南的产生 ESBL-或非ESBL广谱β -内酰胺酶的细菌底物、pH颜色指示剂，任选地ESBL抑制剂。
[0037] 检测方法：
[0038] 如之前所提及，早期检测产生ESBL和非ESBL广谱β-内酰胺酶的细菌已成为为 了防止其扩散并迅速适应抗生素治疗来治疗严重感染的临床微生物学领域中的一个重大 问题。
[0039] 作为该问题的一种解决方案， 申请人:开发了一种检测任何类型的产生广谱β -内 酰胺酶的细菌产生菌的快速、可靠和可负担的方法。
[0040] 因此，本发明涉及一种用于检测样品中存在产生ESBL-和或非ESBL广谱β-内酰 胺酶的细菌的方法，所述方法包括步骤：
[0041] a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液；
[0042] b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含 [0043]-选自头孢菌素和氨曲南的产生广谱内酰胺酶的细菌，
[0044] -pH颜色指示剂，当反应混合物的pH为6. 4-8. 4时，所述pH颜色指示剂将变色，
[0045] 其中步骤b)后的颜色变化指示所述测试样品中存在产生广谱β -内酰胺酶的细 菌。
[0046] 本发明的方法基于以下概念：通过由产生广谱内酰胺酶的细菌底物水解 β_内酰胺，其产生羧基，其反过来酸化介质，通常为无缓冲介质。然后，由该水解产生的酸 性通过pH颜色指示剂的颜色变化来鉴定。颜色变化表明存在产生广谱β-内酰胺酶的细 菌。
[0047] 通常，培养基用测试菌株（由测试样品获得）接种，并在旋转振荡器上培养。然 后，将培养物离心并将沉淀重悬于裂解缓冲液中，涡旋并进一步培养（类似地，可采用在固 体培养基上生长的细菌菌落应用本领域技术人员已知的直接裂解方案）。充分培养之后， 将悬液（即酶悬液）离心，去除上清液并置于冰上。将一小部分该上清液与包含产生广谱 β -内酰胺酶的细菌底物和pH颜色指示剂的试剂盒混合。将由试剂盒和测试的酶悬液组成 的混合物进一步在某温度下培养足量时间，使得观察到颜色变化。颜色变化表明存在产生 广谱β-内酰胺酶的细菌。颜色变化可早在开始培养后的5分钟获得。在大多数情况下， 30分钟的培养时间足以获得广谱β -内酰胺酶产生菌的明显的颜色变化。
[0048] 通常，当想要快速选择应该通过PCR测试并测序从而鉴定产生广谱β -内酰胺酶 的细菌的菌株时，使用该方法可能是进一步有用的。因此，一旦通过本方法确定存在产生 广谱β_内酰胺酶的细菌，本领域技术人员已知的其他鉴定技术可用于进一步表征酶。
[0049] 通常，一旦产生广谱内酰胺酶的细菌由本发明的方法检测到，则该产生广谱 β-内酰胺酶的细菌的活性可以进一步用于发现或评估对产生广谱β-内酰胺酶的细菌的 活性有抗性的新型抑制剂或新型分子。在后一种情况下，待评价的新分子可以替换试剂盒 中所包含的广谱内酰胺酶底物分子。
[0050] 通常，根据本发明的方法可用于检测任何或者选自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 的产生广谱β-内酰胺酶的细菌。优选地，产生广谱β-内酰胺酶的细菌选自临床重要的 细菌，甚至更优选地选自临床重要的革兰氏阴性菌。
[0051] 如本文所使用，"临床重要"的细菌是指参与医院和社区获得性感染的细菌。
[0052] 通常，产生广谱β-内酰胺酶的细菌选自不动细菌属（Acinetobacter)、产气 单抱菌属（Aeromonas)、杆菌属（Bacillus)、拟杆菌属（Bacteriodes)、朽 1樣酸杆菌属 (Citrobacter)、肠杆菌属、埃希氏菌属（Escherichia)、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella)、 摩根氏菌属（Morganella)、Pandoreae属、变形杆菌属（Proteus)、普罗菲登菌属 (Providencia)、假单胞细菌属、雷尔氏菌属（Ralstonia)、兰奥尔菌属（Raoultella)、沙门 氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属（Serratia)、希瓦氏菌属（Shewanella)、志贺氏杆菌属 (Shigella)和寡养单胞菌属（Strenotrophomonas)。
[0053] 通常，产生广谱内酰胺酶的细菌选自鲍氏不动杆菌、嗜水气单胞菌 (Aeromonasjunii)、錯状芽胞杆菌（Bacillus cereus)、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis)、无丙二酸朽1檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus)、弗氏朽1檬酸杆 菌（Citrobacter freundii)、杨氏朽1 樣酸杆菌（Citrobacter youngae)、产气肠杆 菌（Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae)、阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)、大肠杆菌、奥克西托克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca)、 肺炎克雷伯氏杆菌、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii)、潘多拉菌（Pandoraea pnomenusa)、奇异变形杆菌、雷特格氏变形杆菌（Proteus rettgeri)、普通变形杆菌 (Proteus vulgaris)、斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuartii)、铜绿假单胞菌、肠道沙 门氏菌（Salmonella enterica)、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)、弗氏志贺氏杆菌 (Shigella flexneri)、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)、皮氏罗尔斯 顿菌（Ralstonia picketti)和海藻希瓦氏菌（Shewanella algae)。
[0054] 根据本发明，产生广谱内酰胺酶的细菌优选选自：不动细菌属、肠杆菌属、埃 希氏菌属、克雷伯氏杆菌属、假单胞细菌属，并且甚至更优选地选自鲍氏不动杆菌、大肠杆 菌、克雷伯氏杆菌和铜绿假单胞菌。
[0055] 如本文所使用，根据本发明，广谱内酰胺酶底物是选自头孢菌素、氨曲南和头 霉素的一种底物。
[0056] 通常，头孢菌素选自头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢匹罗和氨曲 南。
[0057] 通常，头霉素选自拉氧头孢和头孢西丁。在检测几种类型的非ESBL广谱β-内酰 胺酶中，头霉素是特别值得注意的。
[0058] 优选地，广谱β -内酰胺酶底物是头孢噻肟。
[0059] 通常，用于试剂盒的β -内酰胺酶底物的浓度为0· lmg/ml-10mg/ml，更优选lmg/ ml-5mg/ml，甚至更优选 3mg/ml-4mg/ml。
[0060] 根据本发明，当反应混合物的pH为6. 4-8. 4,优选6. 6-7. 5时，pH颜色指示剂将改 变颜色。
[0061] 通常，用于试剂盒的pH颜色指示剂的浓度为0· 01 %-1 %，更优选0· 03%-0· 08%， 甚至更优选〇· 05 % -0· 06 %。
[0062] 通常，本领域技术人员能够选择用于该水解反应的合适的pH颜色指示剂。可 用于本发明的pH指不剂的列表可以在CRC Handbook of Chemistry and Physics: A Ready-reference Book of Chemical and Physical Data,91stRevised ed. (June lst2010)，CRC Press Inc中发现。例如，用于本发明的pH指示剂可以选自：6,8-二硝基-2， 4-(1H)喹唑啉二酮（pH :6· 4-8. 0)、亮黄（pH :6· 6-7. 8)、酚红（pH :6· 6-8. 0)和中性红（pH : 6. 8-8· 0)。
[0063] 优选地，用于本发明的pH颜色指示剂是酚红，且当使用它时，从红到黄的颜色变 化指示测试样品中存在产生ESBL或非ESBL广谱β -内酰胺酶的细菌。
[0064] 通常，步骤b)的反应在足以观察到颜色变化的时期内进行。优选地，在5分钟-120 分钟，优选在10-60分钟，更优选在20-40分钟的时期内肉眼观察到颜色变化。或者，颜色 变化的鉴定例如通过使用光度计来自动化。
[0065] 通常，步骤b)的反应在15°C -40°C、优选18°C -37°C、更优选20°C -37°C的温度下 进行。
[0066] 基于分子研究，根据Ambler分类，可以将ESBL或非ESBL广谱β-内酰胺酶进一 步分为四种类型：
[0067] Ambler Α 类酶（"ESBL"）
[0068] Ambler B类酶（金属-β -内酰胺酶）
[0069] Ambler C类酶（"头孢菌素酶"）
[0070] Ambler D类酶（"苯唑西林酶"）
[0071] 通常，培养基用测试菌株（由测试样品获得）接种，并在旋转振荡器上培养。然 后，将培养物离心并将沉淀重悬于裂解缓冲液中，涡旋并进一步培养。充分培养之后，将悬 液（即酶悬液）离心，去除上清液并置于冰上。将一小部分该上清液与包含广谱β_内酰 胺酶底物、pH颜色指示剂的试剂盒混合。将由试剂盒和测试的酶悬液组成的混合物进一步 在某温度下培养足量时间，使得观察到颜色变化。颜色变化表明存在产生广谱β_内酰胺 酶的细菌。颜色变化可早在开始培养后的5分钟获得。在大多数情况下，30分钟的培养时 间足以获得至少ESBL产生菌的明显的颜色变化。
[0072] 在优选实施方案中，提供了一种用于检测生物样品中存在产生广谱β-内酰胺酶 的细菌的方法，所述方法包括步骤：
[0073] a)在生物样品上进行细胞裂解以获得酶悬液；
[0074] b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含
[0075] -头孢噻肟作为广谱β -内酰胺酶底物，和
[0076] -酚红作为pH颜色指示剂，
[0077] 其中步骤b)后颜色从红变成黄指示所述生物样品中存在产生广谱β -内酰胺酶。
[0078] 根据一种实施方案，为了特异性鉴别存在于测试样品中的产生广谱内酰胺酶 的细菌的种类，不管Ambler A、B、C、D类β-内酰胺酶，可以使用β-内酰胺酶抑制剂。
[0079] 通常，β -内酰胺酶抑制剂对于一种类型的β -内酰胺酶而言可以是单特异性的。 例如，Ambler Α类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶抑制剂选自克拉维酸、他唑巴坦、舒巴坦和 氨基苯基硼酸，Ambler C类β -内酰胺酶的β -内酰胺酶抑制剂选自Μ组青霉素。
[0080] 在优选的实施方案中，Ambler Α类β -内酰胺酶的单特异性抑制剂是他唑巴坦。
[0081] 在优选的实施方案中，Ambler Β类β -内酰胺酶的单特异性β -内酰胺酶抑制剂 是或多或少与贫锌相关的EDTA。
[0082] 在优选的实施方案中，Ambler C类β -内酰胺酶的单特异性β -内酰胺酶抑制剂 是氯唑西林或苯唑西林。
[0083] 通常，对于一种以上的酶，碳青霉烯酶抑制剂可以是双特异性的，诸如例如 NXL-104,其对于Ambler Α类和D类碳青霉烯酶而言是双特异性的。
[0084] 通常，Ambler A类β -内酰胺酶的单特异性β -内酰胺酶抑制剂（诸诸如例如他 唑巴坦）的浓度为 〇· lmg/ml-10mg/ml，更优选 lmg/ml-5mg/ml，甚至更优选 2mg/ml-4mg/ml。
[0085] 通常，Ambler B类碳青霉烯酶的单特异性碳青霉烯酶抑制剂（诸诸如例如EDTA) 的浓度为〇. 001M-0. 5M，更优选0. 001M-0. 01M，甚至更优选为0. 005M。
[0086] 通常，Ambler C类β -内酰胺酶的单特异性β -内酰胺酶抑制剂（诸如例如氯唑 西林和苯唑西林）的浓度为〇· lmg/ml-10mg/ml，更优选lmg/ml-5mg/ml，甚至更优选2mg/ ml-4mg/ml〇
[0087] 通常，Ambler A和D类β -内酰胺酶的双特异性β -内酰胺酶抑制剂（诸如例如 NXL-104)的浓度为 0· 05mg/ml-10mg/ml，更优选 lmg/ml-8mg/ml，甚至更优选 3mg/L-5mg/ ml〇
[0088] 通常，为了鉴别广谱β_内酰胺酶的类型，可以使用96孔微量滴定板并将板分成 四个部分。在第一部分，产生广谱β-内酰胺酶的细菌的存在可根据之前描述的本发明方 法来检测。在第二部分，Ambler Α类的ESBL可通过添加 Α类β -内酰胺酶的β -内酰胺 酶抑制剂来检测。在第三部分，Ambler Β类的金属-β -内酰胺酶可通过添加 Β类β -内 酰胺酶的β-内酰胺酶抑制剂来检测。在第四部分，Ambler C类的头孢菌素酶可通过添加 C类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶抑制剂来检测。最后，在第五部分，Ambler D类β-内酰 胺酶可通过添加 D类碳青霉烯酶的β-内酰胺酶抑制剂来检测。基于所使用的β-内酰胺 酶抑制剂，然后本领域技术人员能够通过简单推导来建立存在于测试样品中的广谱β_内 酰胺酶的具体的Ambler类型。
[0089] 通常，β -内酰胺酶抑制剂可以是试剂盒本身的一部分，因此同时添加广谱β -内 酰胺酶底物、pH颜色指示剂。
[0090] 或者，β -内酰胺酶抑制剂可以与试剂盒分开，因此同时或相继添加至试剂盒和/ 或测试样品（部分酶悬液）。
[0091] 一旦，根据本发明的方法在所有四个部分中进行，也就是说，含或不含β-内酰胺 酶抑制剂，在进行如上所述的方法后获得的结果和在进行进一步添加 β-内酰胺酶抑制剂 的相同方法后获得的结果之间建立比较。
[0092] 试剂盒：
[0093] 根据本发明的另一个方面，提供一种试剂盒，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉 素的产生广谱β-内酰胺酶的细菌底物和pH颜色指示剂。
[0094] 根据本发明的一个实施方案，试剂盒可以包含广谱内酰胺酶底物、pH颜色指 示剂。
[0095] 根据本发明的一个实施方案，试剂盒还可以包含β -内酰胺酶抑制剂。因此，试剂 盒可以包含广谱β-内酰胺酶底物、pH颜色指示剂和β-内酰胺酶抑制剂。
[0096] 广谱β -内酰胺酶底物、pH颜色指示剂和广谱β -内酰胺酶抑制剂如本专利申请 之前所定义。
[0097] 通常，所述试剂盒用于检测根据本发明方法的样品中广谱β -内酰胺酶的存在。 [0098] 通常，当具体的β -内酰胺酶抑制剂存在于试剂盒中时，可以测定相应的β -内酰 胺酶的具体种类，不管是Ambler A、B、C或D类。
[0099] 微量滴定板：
[0100] 根据本发明的另一个方面，提供一种微量滴定板，包含含有选自头孢菌素、氨曲南 和头霉素的广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶底物的孔或一系列孔。
[0101] 通常，所述微量滴定板可以进一步包含：
[0102] -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β-内酰胺酶底物 和Ambler Α类β -内酰胺酶抑制剂；
[0103] -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β-内酰胺酶底物 和Ambler Β类β -内酰胺酶抑制剂；
[0104] -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱内酰胺酶底物 和Ambler C类β -内酰胺酶抑制剂；和
[0105] -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱内酰胺酶和 Ambler D类β -内酰胺酶抑制剂。
[0106] 微量滴定板还可以包含可以分析并与测试样品比较的对照孔或一系列对照孔。
[0107] 通常，微量滴定板是96孔微量滴定板。
[0108] 除了微量滴定板的其他装置可用于该目的。例如，可以使用其中结合了试剂盒 (即广谱β -内酰胺酶底物和pH颜色指示剂）的吸墨水纸。将酶悬液添加至吸墨水纸后，可 以观察该纸是否改变颜色。类似地，可以使用塑料槽（plastic galleries)。事实上，试剂 盒可以容纳在这些塑料槽中，然后，将酶悬液加入这些槽后，可以观察是否存在颜色变化。
[0109] 为了进行本发明方法，将pH颜色指示剂和一部分待测试酶悬液添加至微量滴定 板的各孔。随后，提供使用微量滴定板检测根据本发明方法的测试样品中产生广谱β_内 酰胺酶的细菌的存在，由此向各孔添加至少pH颜色指示剂和一部分待测试酶悬液。所述微 量滴定板尤其非常适合于测定存在于测试样品中的广谱β_内酰胺酶的具体种类。
[0110] 通常，如果pH颜色指示剂是稳定的，在进行本发明方法前，微量滴定板的孔或一 系列孔还可以包含pH颜色指示剂和广谱β-内酰胺酶底物或pH颜色指示剂和广谱β-内 酰胺酶和β-内酰胺酶抑制剂。或者，如果pH颜色指示剂是不稳定的，其可随后添加至孔 或一系列孔。
[0111] 广谱β -内酰胺酶底物、pH颜色指示剂和β -内酰胺酶抑制剂如本专利申请之前 所定义。
[0112] 根据一个实施方案，一些组分诸如例如广谱β-内酰胺酶底物和β-内酰胺酶抑 制剂（当存在时）可以直接结合微量滴定板的固体表面。在这种情况下，将剩余组分（即 pH颜色指示剂）添加至含有测试样品的微量滴定板中的表面结合的广谱β -内酰胺酶底物 和添加至表面结合的β-内酰胺酶抑制剂（当存在时）。
[0113] 根据一种实施方案，可以将用于进行本发明方法的微量滴定板以及每一种组件 装入单个容器内，且将所有多个容器连同用于观察是否可以在测试样品中发现产生广谱 β-内酰胺酶的细菌的说明书一起置于单个包装内。
[0114] 本发明将进一步通过以下附图和实施例来说明。

【专利附图】

【附图说明】
[0115] 图1.ESBL产生菌的检测方法的结果。
[0116] ESBL产生菌（小图Α)如下：大肠杆菌FOR CTX-M-15 (1)、大肠杆菌GUE CTX-M-1 (2)、大肠杆菌DEV CTX-M-3 (3)、大肠杆菌GALCTX-M-14 (4)、肺炎克雷伯氏杆菌ISS CTX-M-14 (5)、肺炎克雷伯氏杆菌DOU CTX-M-15 (6)、阴沟肠杆菌MAZ CTX-M-15 (7)、大肠杆 菌 SHV-2a(8)、大肠杆菌 SHV-12 (9)、大肠杆菌 TEM-52 (10)
[0117] 非ESBL产生菌（小图B)如下：大肠杆菌BG 11066175野生型（1)、大肠杆菌BG 1106 6207野生型（2)、大肠杆菌BG 1106 6301野生型（3)、肠道沙门氏菌BG 11066187野 生型（4)、奥克西托克雷伯氏杆菌BG 11066141野生型（5)、肺炎克雷伯氏杆菌BG 11067725 野生型（6)、肺炎克雷伯氏杆菌BN 1113 0227野生型（7)、大肠杆菌MAC BG 1106 7257青 霉素酶（8)、大肠杆菌BG 1106 5898青霉素酶（9)、大肠杆菌BN 1113 0228青霉素酶（10)、 大肠杆菌BN1113 0231青霉素酶（11)、阴沟肠杆菌BG 11067746野生型（12)、弗氏柠檬酸 杆菌BG 1106 7767野生型（13)、产气肠杆菌BN 11130225野生型（14)、摩氏摩根氏菌BG 1106 5902野生型（15)、阴沟肠杆菌BG 1106 7725野生型（16)。
[0118] 图2.直接来自血液培养物的ESBL产生菌的检测的结果（小图A)和策略（小图 B)。将测试应用于两种阳性血液培养物（小图A)，并且用于在24-36h后获得的β -内酰胺 酶内容物的验证鉴定。测试的使用允许早期检测ESBL产生菌和足够的治疗（小图Β)。

【具体实施方式】
[0119] 实施例1 :根据本发明的方法（酸-比色测试）
[0120] 研究中包括六种β -内酰胺酶的非产生菌、七种没有广谱活性的青霉素酶的产生 菌、五种低水平的头孢菌素酶的产生菌、十三种ESBL产生菌、两种广谱D类酶的产生菌、（F) 三种质粒编码的头孢菌素酶的产生菌、(G)六种染色体头孢菌素酶的过量产生菌和（H)两 种 申请人:菌株收集和全世界来源的B类酶的产生菌（表1)。
[0121] 菌株按照以下进行本发明方法。
[0122] 将之前生长在胰蛋白酶大豆琼脂上一 ose的10μ 1细菌菌株的等价物重悬浮于 Tris-HCL 20mM+Triton X-1002%+Tween 200.5%裂解缓冲液中，涡旋1111丨11，并进一步在室 温培养3011^11。将细菌悬液以10,0008在41：离心5分钟，去除上清液并置于冰上。将5(^1 的该悬液的上清液（即酶悬液）在96孔托盘的孔中与由3mg头孢噻肟、pH7. 5的酚红溶液 组成的lml溶液（即试剂盒）的50 μ 1混合。
[0123] 申请人:所使用的酚红溶液通过以下制备：取2. 2ml ρΗ8的浓缩酚溶液（由0. 5%酚 红在蒸馏水中的混合物制备）， 申请人:向其中添加16. 6ml蒸馏水。然后通过添加 IN NaOH 液滴将pH值调节至7. 5。
[0124] 将试剂盒和测试的酶悬液的混合物在室温下培养1.5h。还根据本发明方法测试产 生或不产生广谱β -内酰胺酶的细菌菌株的悬液（阳性和阴性对照）（表1)。对于产生广 谱β -内酰胺酶的所有测试菌株，孔的颜色从红转为黄，而对应于不产生广谱β -内酰胺酶 的细菌提取物的孔仍然是红色。对于CTX-M-15产生菌而言，从红到黄的颜色变化早在培养 开始后的15分钟获得。在大多数情况下，40min的培养时间足以获得ESBL产生菌的明显的 颜色变化（图1)。对于若干分离株诸如例如若干SHV-型ESBL产生菌而言，颜色变化尽管 仍是阳性的，但较不明显（图1)。该测试作为盲研究通过不知道哪个孔包含ESBL产生菌的 人来进行。所有测试以高度可重复的结果一式三份地进行。
[0125] 直接来自阳性血液培养物的ESBL产生菌的检测的策略和临床有效性显示在图2 中。
[0126]

【权利要求】
1. 用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌的方法，所述方法包括步骤： a) 在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液； b) 使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含 -选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β-内酰胺酶底物， -pH颜色指示剂，当反应混合物的pH为6. 4-8. 4时，所述pH颜色指示剂将改变颜色， 其中步骤b)后的颜色变化指示所述测试样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述测试样品是选自血液样品和尿样品的生物样品。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中产生碳青霉烯酶的细菌选自不动细菌属、产气单孢 菌属、杆菌属、拟杆细菌属、朽1檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏杆菌属、摩根氏 菌属、Pandoreae属、变形杆菌属、普罗菲登菌属、假单胞细菌属、雷尔氏菌属、兰奥尔菌属、 沙门氏菌属、沙雷氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏杆菌属和寡养单胞菌属。
4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤b)的反应在15°C -40°C、优选 20°C -37°C的温度下进行。
5. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中步骤b)的反应在足以观察到颜色变化的 时期内进行，优选地，在5分钟-120分钟，优选在10-60分钟，更优选在20-40分钟的时期 内肉眼观察到颜色变化。
6. 根据权利要求1至5中任一项的方法，所述方法包括步骤： a) 在生物样品上进行细胞裂解以获得酶悬液； b) 使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含 -头孢噻肟作为广谱β -内酰胺酶底物， -酚红作为pH颜色指示剂，和 其中步骤b)后颜色从红变成黄指示所述生物样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细 菌。
7. -种试剂盒，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β-内酰胺酶底物和pH 颜色指示剂。
8. 根据权利要求6或7的试剂盒，其进一步包含β -内酰胺酶抑制剂。
9. 权利要求6-8中任一项中定义的试剂盒用于根据权利要求1-5中任一项定义的方法 检测样品中存在产生广谱β_内酰胺酶的细菌的用途。
10. -种微量滴定板，包含孔或一系列孔，所述孔包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素 的广谱β-内酰胺酶底物。
11. 根据权利要求10的微量滴定板，其进一步包含： -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β -内酰胺酶和Ambler A类β-内酰胺酶抑制剂； -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β -内酰胺酶和Ambler B类β-内酰胺酶抑制剂； -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β -内酰胺酶底物和 Ambler C类β -内酰胺酶抑制剂；和 -孔或一系列孔，其包含选自头孢菌素、氨曲南和头霉素的广谱β-内酰胺酶底物和 Ambler D类β -内酰胺酶抑制剂。
12. 权利要求11中定义的微量滴定板用于根据权利要求1-6中任一项定义的方法检测 样品中产生广谱β -内酰胺酶的细菌的存在和/或用于测定样品中存在的ESBL的特定种 类的用途，其中向每个孔添加至少一种pH颜色指示剂和一部分待测试的酶悬液。
13. 根据权利要求1-6中任一项的方法、根据权利要求7-9中任一项的试剂盒及其用途 和根据权利要求10-12中任一项的微量滴定板及其用途，其中头孢菌素选自头孢噻肟、头 孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢匹罗和氨曲南，优选头孢噻肟，并且头霉素选自拉氧头孢 和头孢西丁。
【文档编号】C12Q1/00GK104160034SQ201280063949
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2011年11月18日
【发明者】P·诺德曼, L·多尔泰, L·普瓦雷尔 申请人:国家医疗保健研究所, 巴黎公共救济院, 巴黎第十一大学