用于降低重组蛋白的降解的方法和材料的制作方法
【专利摘要】本文中描述了用于降低真菌细胞诸如耶氏酵母中重组蛋白降解的方法和材料。
【专利说明】用于降低重组蛋白的降解的方法和材料
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年12月30日提交的美国临时申请流水号61/581，859的优先权权益，其内容通过提及完整并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及用于降低真菌细胞中的重组蛋白降解的方法和材料，更具体而言，涉及具有两种不同yapsin肽酶活性缺陷的遗传工程化耶氏酵母细胞。
[0004]发明背景
[0005]需要高效表达系统来生产目前开发下的大多数生物药物(例如，重组蛋白)。基于酵母的表达系统组合易于遗传操作与具有分泌并修饰蛋白质的能力的微生物生物体的发酵。然而，重组蛋白经常被胞内蛋白酶及胞外蛋白酶降解。如此，需要具有降低的重组蛋白降解的基于酵母的表达系统。
[0006]发明概述
[0007]本文件至少部分基于如下的发现，即重组蛋白的降解在具有两种不同yapsin肽酶活性YPSl蛋白(pYPSl)和YPS2蛋白(pYPS2)缺陷的耶氏酵母细胞中降低。本文中描述的遗传工程化耶氏酵母菌株可用于生成未降解的重组蛋白(例如抗体)。
[0008]在一个方面，本文件特征在于一种分离的耶氏酵母(Yairowia)细胞(例如解脂耶氏酵母细胞)，其遗传工程化改造为包含pYPSl活性缺陷和PYPS2活性缺陷。在一些实施方案中，所述细胞不生成可检测水平的功能性PYPSl或功能性pYPS2。在一些实施方案中，所述细胞不生成可检测的编码功能性PYPSl和功能性pYPS2的mRNA分子。在一些实施方案中，所述YPSl和YPS2基因在所述细胞中被破坏。在一些实施方案中，所述YPSl和YPS2可读框被删除。
[0009]在另一个方面，本文件特征在于解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量的所述解脂耶氏酵母细胞被遗传工程化改造为包含pYPSl活性缺陷和PYPS2活性缺陷。
[0010]本文件特征还在于一种用于降低耶氏酵母中生成的靶蛋白的降解的方法。所述方法包括在本文中描述的耶氏酵母细胞中表达编码所述靶蛋白的核酸。
[0011]在另一个方面，本文件特征在于一种用于生成靶蛋白的方法。所述方法包括提供遗传工程化改造为包含pYPSl活性缺陷，PYPS2活性缺陷，和编码所述靶蛋白的核酸的耶氏酵母细胞；并13)在使得所述细胞生成所述靶蛋白的条件下培养所述细胞。
[0012]本文中描述的任何细胞可以进一步是OCHl活性缺陷的。
[0013]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码alpha-1，2甘露糖苷酶的核酸。alpha-1, 2甘露糖苷酶可以包含祀向序列以将所述alpha-1, 2甘露糖苷酶祀向至胞内区室。
[0014]本文中描述的任何细胞可以进一步是ALG3活性缺陷的。
[0015]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码alpha-1，3-葡萄糖基转移酶的核酸。
[0016]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码葡糖苷酶的alpha和beta亚基的核酸。
[0017]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码GlcNAc-转移酶I的核酸。GlcNAc-转移酶I可以包含靶向序列以将所述GlcNAc-转移酶I靶向至胞内区室。
[0018]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码GlcNAc-转移酶II的核酸。GlcNAc-转移酶II可以包含靶向序列以将所述GlcNAc-转移酶II靶向至胞内区室。
[0019]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码半乳糖基转移酶的核酸。半乳糖基转移酶可以包含靶向序列以将所述半乳糖基转移酶靶向至高尔基体。
[0020]本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码靶蛋白(例如溶酶体蛋白、病原体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段的一条或两条多肽链、或融合蛋白)的核酸。所述抗体可以选自下组:结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、结合CD3的抗体、结合肿瘤坏死因子(TNF)的抗体、结合TNF受体的抗体、结合CD20的抗体、结合糖蛋白Ila/IIb受体的抗体、结合IL2受体的抗体、结合⑶52的抗体、结合⑶IIa的抗体、和结合HER2的抗体。所述抗原结合片段可以选自下组:Fab、F(ab’)2、Fv、和单链 Fv (scFv)片段。
[0021]本文件特征还在于一种分离的耶氏酵母细胞，其遗传工程化改造为包含(i)pYPSl活性缺陷和(ii)pYPS2活性缺陷，以及下列一项或多项:(iii)ALG3活性缺陷，(iv)OCHl活性缺陷，(V)编码alpha-1，2甘露糖苷酶的核酸，(vi)编码GlcNAc-转移酶I的核酸，(vii)编码GlcNAc-转移酶II的核酸，(viii)编码甘露糖苷酶II的核酸，(ix)编码α-1，3_葡萄糖基转移酶的核酸，(x)编码半乳糖基转移酶的核酸，和(xi)编码葡糖苷酶的α和β亚基的核酸。例如，此类细胞可以包含(i)pYPSl活性缺陷；(ii)pYPS2活性缺陷；(iii)ALG3活性缺陷；(iv)OCHl活性缺陷；(V)编码alpha-1，2甘露糖苷酶的核酸；(vi)编码GlcNAc-转移酶I的核酸；(vii)编码GlcNAc-转移酶II的核酸；(viii)编码甘露糖苷酶II的核酸；(ix)编码α-1，3-葡萄糖基转移酶的核酸；(X)编码半乳糖基转移酶的核酸；和(xi)编码葡糖苷酶的α和β亚基的核酸。此类细胞进一步可以包含编码如本文中描述的靶蛋白的核酸。
[0022]除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中所描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以在本发明的实施或测试中使用，但是下文描述了例示性的方法和材料。通过提及而完整收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、Genbank?登录号、和其它参考文献。在矛盾的情况中，应当以本申，包括定义为准。所述材料、方法和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性的。
[0023]本发明的其它特征和优点从以下发明详述及权利要求书看会是显而易见的。
[0024]附图简述
[0025]图1A是轻链表达构建体(SEQ ID NO:1)和重链表达构建体(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列的描绘。
[0026]图1B是pYPSl(SEQ ID NO: 3)和pYPS2蛋白(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的描绘。
[0027]图1C是编码抗HER2抗体的轻链(LC)的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的描绘，和LC(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的描绘，其中LIP2前原前导序列加下划线(LIP2前原前导序列)，vL域序列用两条线加下划线(?域);且CK域用虚线加下划线(gag*.)。
[0028]图1D是编码抗HER2抗体的重链(HC)的核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)的描绘，和HC(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的描绘，其中LIP2前原前导序列加下划线(LIP2前原前导序列)，Vh域序列用两条线加下划线(Yii域);CH域用虚线加下划线(^_1^1_域);且yapsin切割位点用“/”标记。
[0029]图2是为了 alphaHER2重链和轻链的单一靶向拷贝整合构建的菌株的系统学的示意图。
[0030]图3是解脂耶氏酵母菌株Pold中表达的抗HER2抗体的western印迹的照片。分开检测轻链和重链。轻链以25kDa的正确分子量存在，但是显示二聚化的趋势。重链也以50 kDa的正确分子量检出，但是大部分以具有约32kDa的分子量的降解产物存在。
[0031]图4是用于破坏YPS基因的构建体的示意图。
[0032]图5是从单一 yapsin缺失菌株的培养物上清液获得的重链的两个western印迹的照片。在上部小图中，对于Ayps2缺失，Ayps3缺失，Ayps5缺失，Ayps7缺失,和Aypsx缺失菌株,和对照菌株(ctrl, yapsin未缺失)，重链在两个时间点(48h和96h)检出。在下部小图中，对于Aypsl缺失和Δ yps4缺失菌株各自的两个克隆和对照菌株,重链在96h时间点检出。
[0033]图6是从Δ ypsl缺失菌株,URA-营养缺陷型Δ ypsl缺失菌株，Δ ypsl Δ yps2双重缺失菌株，Δ ypsl Δ yps3双重缺失菌株，Δ ypsl Δ yps4双重缺失菌株,和对照菌株(yapsin未缺失)的培养物上清液获得的重链的western印迹的照片。
[0034]图7是Δ ypsl Δ yps2和野生型(ctrl)菌株中表达的重组抗HER2抗体的银染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶的照片。显示了还原性(左侧)和非还原性(右侧)条件。重链衍生的降解产物用星号标记。在非还原性条件下，重链蛋白水解产物在对照菌株中以单体和二聚体两者存在。在还原性条件下，观察到重链的糖基化的和未糖基化的型式两者。H2L2:完全装配的Ab ；HC:重链；LC:轻链。
[0035]发明详述
[0036]一般地，本文件提供了使用具有两种不同yapsin肽酶YPSl蛋白(pYPSl)和YPS2蛋白(pYPS2)缺陷的遗传工程化细胞降低真菌细胞诸如耶氏酵母(例如解脂耶氏酵母)或双态性酵母的其它相关物种中重组蛋白的降解的方法和材料。yapsin是具有受限制的底物特异性并且在细胞表面上定位的糖磷脂酰肌醇(GPI)连接的天冬氨酸内肽酶。yapsin能在成对的碱性残基(例如赖氨酸-精氨酸和精氨酸-精氨酸)的C端；在单碱性位点(相对于赖氨酸，对精氨酸没有偏爱)的C端；及在碱性残基之间切割。参见例如Gagnon-Arsenault等，FEMS Yeast Res6:966 - 978 (2006)。
[0037]可以使用本文中描述的遗传工程化细胞生成重组靶蛋白。在一些实施方案中，重组靶蛋白能够通过解脂耶氏酵母(或双态性真菌的其它相关物种)分泌途径的一个或多个步骤被运输，导致其被宿主细胞装置进行N-糖基化。
[0038]可以重组生成的合适的靶蛋白包括病原体蛋白质、溶酶体蛋白质(例如，葡糖脑苷脂酶、脑苷酯酶、或半乳糖脑苷脂酶)(glucocerebrosidase, cerebrosidase, orgalactocerebrosidase)、胰岛素、胰高血糖素、生长因子、细胞因子、趋化因子、能够结合Fe受体的蛋白质、抗体或其片段、或任何蛋白质与抗体或抗体片段的融合物(例如，蛋白质-Fe)。病原体蛋白质的非限制性例子包括破伤风类毒素；白喉类毒素；和病毒表面蛋白(例如，巨细胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII ;人免疫缺陷病毒I(HIV-1)包膜糖蛋白；劳斯肉瘤病毒(RSV)包膜糖蛋白；单纯疱疹病毒(HSV)包膜糖蛋白；埃巴病毒(EBV)包膜糖蛋白；水痘-带状疱疹病毒(VZV)包膜糖蛋白；人乳头瘤病毒(HPV)包膜糖蛋白；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原)。生长因子包括例如，血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF);神经营养因子、血小板衍生的生长因子(TOGF)、促红细胞生长素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、筒箭毒碱(Myostatin)(⑶F-8)、生长分化因子-9 (GDF9)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、表皮生长因子(EGF)Jf细胞生长因子(HGF)。细胞因子包括白介素(例如，IL-1至IL-33诸如IL_1，IL-2, IL-3,IL-4, IL-5, IL-6, IL-T, IL-8，IL-9，IL-10, IL-12，IL-13 或 IL-15)和干扰素(例如，干扰素β 或干扰素 Y )。趋化因子包括例如 1-309，TCA-3, MCP-1, MIP-1 a，MIP-1 β，RANTES, C1,MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1y，Eotaxin, MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ckβ 10，HCC-1,嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)，MCP-5，MCP-4，NCC-1，Ck β 10，HCC-1，白细胞诱素(Leukotactin)-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC或嗜酸细胞活化趋化因子_2。还包括肿瘤糖蛋白(例如，肿瘤相关抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu、和前列腺特异性抗原(PSA)[Henderson and Finn, Adv in Immunology, 62，pp.217-56 (1996)]。
[0039]在一些实施方案中，靶蛋白是与溶酶体贮积病症(LSD)有关。与LSD有关的革巴蛋白的非限制性例子包括例如，alpha-L-艾杜糖苷酸酶(alpha-L_iduronidase)、beta-D-半乳糖昔酶(beta -D-galactosidase)、beta-葡萄糖昔酶、beta-己糖胺酶(beta-hexosaminidase)、beta-D-甘露糖苷酶、alpha-L-岩藻糖苷酶(alpha-L-fucosidase)、芳基硫酸酯酶B (arylsulfatase B)、芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A)、aIpha-N-乙酸基半乳糖胺酶(alpha-N-acetyIgalactosaminidase)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶(aspartylglucosaminidase)、艾杜糖醒酸_2_硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase)、alpha-氨基葡萄糖苷-N-乙酸转移酶(alpha-glucosaminide-N-acety I transferase)、beta-D-葡糖醒酸糖苷酶(beta-D-glucoronidase)、透明质酸酶(hyaluronidase)、alpha-L-甘露糖苷酶、alpha-神经氨酸酶(alpha-neuraminidase)、磷酸转移酶(phosphotransferase)、酸性脂肪酶(acid lipase)、酸性神经酰胺酶(acidceramidase)、鞘憐脂酶(sphingomyelinase)、硫酯酶(th1esterase)、组织蛋白酶K(cathepsin K)、和脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase)。
[0040]在一些实施方案中，靶蛋白是抗体。虽然抗体可以是任何抗体，但是抗体的非限制性例子包括结合⑶3的抗体，诸如0KT3, Teplizumab,或Otelixizumab ；
结合肿瘤坏死因子(TNF)的抗体，诸如阿达木单抗(Adalimumab) (Humira?)或英夫利昔单抗(Infliximab) (Remicade?);结合TNF受体的抗体，诸如依那西普(Etanercept) (EllbreI?)；结合 CD20 的抗体，诸如替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan) (Zevalin?),或利妥昔单抗(Rituximab) (Mabthera?);结合糖蛋白Ila/IIb 受体(GPIIa/IIb-R)的抗体，诸如阿昔单抗(Abeiximab) (Reopro?);结合IL2受体的抗体，诸如巴利昔单抗(Basiliximab) (Simulect?)或达克珠单抗(Daclizumab) (Zenapax?)，结合表皮生长因子受体(EGFR)的抗体，诸如西妥昔单抗(Cetuximab) (ErbitUX?);结合 CD52 的抗体,诸如 Alemtuzamab (Campatll?)；结合 CDl Ia的抗体，诸如依法利珠单抗(Efalizumab) (Raptiva?);结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗(Bevacizumab) (Avastin?)，或结合HER2的抗体,诸如曲妥珠单抗(Trastuzamab) (Herceptill?)。
[0041]靶蛋白还可以是融合蛋白。融合蛋白包括例如，(i)本文中所描述的任何蛋白质或其片段与(ii)抗体或其片段的融合物。它们还可以是(i)和多种异源蛋白质之任一种，例如源自无关蛋白质的信号序列，免疫球蛋白重链恒定区或此类区域的部分，标签氨基酸序列(例如荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白或其变体)，或可用于亲和纯化的序列(例如多聚组氨酸诸如六组氨酸，FLAG标签，或弹性蛋白样多肽(ELP))的融合物。
[0042]也感兴趣的是抗体片段(包括抗原结合抗体片段)。此类片段可以是本文件中公开的任何抗体的。如本文中所使用的，术语“抗体片段”指(a)抗原结合片段或(b)可以与Fe受体相互作用的抗体Fe部分。抗原结合片段可以是例如，Fab、F(ab’)2、Fv、和单链Fv(ScFv)片段。scFv片段是包含scFv来源的抗体的重和轻链可变区的单一多肽链。另外，双抗体[Pol jak (1994) Structure2 (12): 1121-1123 ;Hudson 等(1999) J.Tmmunol.Methods 23 (1-2): 177-189]及胞内抗体(intrabody) [Huston 等(2001) Hum.Antibodies10(3-4):127-142 ；Wheeler 等(2003)Mol.Ther.8 (3):355-366 ；Stocks (2004)DrugDiscov.Today9 (22):960-966]是可以生成的重组蛋白的例子。
[0043]靶蛋白可以由任选在编码靶蛋白的一条或多条多肽链的一个或多个(例如2、3、
4、或5)表达载体中的一个或多个(例如2、3、4、或5)核酸编码。因此，例如抗体或抗体的抗原结合片段的两条链(例如轻链和重链或一种或两者的片段)可以由单一表达载体中的单一可读框(ORF)或者由在单一表达载体或两个分开的表达载体中的两个ORF表达。因此，含有抗体的轻链和重链可变区的抗体scFV —般会由单一 ORF编码。另一方面，完整的IgG抗体、Fab片段、或F(ab’)2片段的轻链和重链最常(但不一定)会由两个一般(但也不一定)各在分开的表达载体中的分开的核酸内的分开ORF表达。关于抗体和抗体的抗原结合片段的上文描述的相同原则理解为适用于由一个或多个(例如2、3、4、或5)不同多肽链组成的其它蛋白质。
[0044]也可以将靶蛋白与聚合物、载体、赋形剂、免疫毒素、或可检测(例如，荧光、发光、或放射性)模块中的一种或多种连接。例如，可以将靶蛋白与聚乙二醇连接，所述聚乙二醇可以用于提高小蛋白质的分子量和/或延长循环残留时间。
[0045]遗传工程化细胞
[0046]本文中描述的遗传工程化细胞(例如耶氏酵母细胞)含有pYPSl和pYPS2活性缺陷。例如，此类遗传工程化细胞不能生成可检测水平的功能性PYPSl和/或功能性pYPS2。可以通过例如删除或破坏至少两个内源yapsin基因,例如YPSl (Genolevures RefN0.YAL10E10175g ;基因 ID:2912589)和 YPS2 (Genolevures Ref N0.YAL10E22374g ;基因ID:2912981)(它们分别编码pYPSl和pYPS2)在耶氏酵母细胞中产生此类缺陷。pYPSl和PYPS2的氨基酸序列分别在SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4中列出(参见图1B)。还可分别参见 GenBank 登录号 ΧΡ_503768.1，G1: 50552716 和 ΧΡ_504265.1，G1: 50553708。
[0047]同源重组可以用于破坏内源基因。例如，可以以如下的方式构建“基因替换”载体，使得包括选择标志物基因。选择标志物基因可以与5’和3’两端与足以介导同源重组的长度的基因的一部分可操作连接。选择标志物可以是许多基因之一，所述基因互补宿主细胞营养缺陷型或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合适的选择标志物包括CAT基因，其对酵母细胞赋予氯霉素抗性，或IacZ基因，其导致由于表达β -半乳糖苷酶所致的蓝色菌落。然后，使用本领域中公知的方法(见下文)来将基因替换载体的线性化DNA片段导入细胞中。可以基于选择标志物来确定线性片段对基因组的整合和对基因的破坏，并且可以通过例如Southern印迹分析来确认。在一些实施方案中，基因的破坏生成不产生可检测水平的编码功能性pYPSl和功能性pYPS2的mRNA分子的遗传工程化菌株。
[0048]在其在选择中使用后，可以通过例如Cre-1oxP系统(见例如Gossen等(2002)Ann.Rev.Genetics 36:153-173及美国申请公开文本N0.20060014264)自宿主细胞的基因组除去选择标志物。标志物除去的方法称为“消除(curing)”。
[0049]或者，可以以如下的方式构建基因替换载体，使得包括要破坏的基因的一部分，其中该部分缺乏任何内源基因启动子序列，并且编码无一基因编码序列或编码基因编码序列的无活性片段。“无活性片段”指编码具有例如自基因的全长编码序列生成的蛋白质的活性的小于约10% (例如，小于约9%、小于约8%、小于约7%、小于约6%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约 2%、小于约1%、或0% )的蛋白质的基因的片段。以如下的方式将基因的所述一部分插入载体中，使得无已知的启动子序列与基因序列可操作连接，但是终止密码子和转录终止序列与基因序列的一部分可操作连接。随后，可以将此载体在基因序列的一部分中线性化，并转化入细胞中。通过单一同源重组，此线性化载体随后在基因的内源对应物中整合。
[0050]在一些实施方案中，可以导入或表达RNA分子，其干扰具有pYPSl和/或pYPS2活性的蛋白质的功能性表达。RNA分子包括例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA、或微小 RNA(miRNA)。
[0051]在一些实施方案中，可以改变编码具有pYPSl和/或pYPS2活性的蛋白质的一种或多种内源基因的启动子或增强子元件，使得改变其编码蛋白质的表达。
[0052]适合于遗传工程化的细胞包括耶氏酵母细胞，诸如解脂耶氏酵母细胞和其它相关双态性酵母细胞。在如本文中规定的遗传工程化前，此类细胞可以获自多种商业来源和研究资源所，诸如例如美国典型培养物保藏中心(ATCC) (Manassas，VA)。在一个实施方案中，使用解脂耶氏酵母的pold菌株。pold菌株在登录号139下在Centre Internat1nal deRessources Microbienne, CLIB 培养物保藏中心(CLIB culture collect1n)可得到。在pold菌株中，分泌性碱性胞外蛋白酶AEP(基因XPR2)已经被删除，并且酸性胞外蛋白酶AXPl (基因AXP)可以通过靶基因的基因破坏和插入来删除或者通过发酵培养基的pH控制。
[0053]本文中描述的遗传工程化细胞进一步可以包括其它天冬氨酸蛋白酶，例如在EC
3.4.23下分类的天冬氨酸蛋白酶，诸如蛋白酶A(由PEP4基因编码)的缺陷。
[0054]本文中描述的遗传工程化细胞进一步可以包括编码靶蛋白(例如上文描述的靶蛋白，诸如抗体)的核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA、和含有核酸类似物的DNA(或RNA)。核酸可以具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链(即，有义链或反义链)。核酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物，以及核酸类似物。“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指氨基酸的任何肽连接的链，而不管长度或翻译后修饰。
[0055]“分离的核酸”指与存在于天然存在的基因组的其它核酸分子分开的核酸，包括通常在天然存在的基因组(例如，酵母基因组)中的核酸的一侧或两侧侧翼的核酸。如本文中所使用的，术语“分离的”就核酸而言还包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天然存在的序列不存在于自然界，并且在天然存在的基因组中没有刚好连续的序列。
[0056]分离的核酸可以是例如，DNA分子，只要通常刚刚在天然存在的基因组中的DNA分子侧翼找到的核酸序列之一被除去或缺乏。如此，分离的核酸包括但不限于作为不依赖于其它序列的不同分子(例如，化学合成的核酸、或通过PCR或限制性内切核酸酶处理生成的cDNA或基因组DNA片段)存在的DNA分子以及掺入载体、自主复制型质粒、病毒(例如，任何副粘液病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、或疱疹病毒)中，或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA。另外，分离的核酸可以包括经工程化改造的核酸诸如作为杂合或融合核酸的一部分的DNA分子。认为存在于例如cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶(例如电泳凝胶)切片内的数百至数百万个其它核酸间的核酸不是分离的核酸。
[0057]如本文中所使用的，术语“外源的”就核酸和特定宿主细胞而言意指不存在于(并且不能获自)如自然界中找到的所述特定细胞的任何核酸。如此，认为一旦导入宿主细胞中，非天然存在的核酸对于宿主细胞而言是外源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可以含有自然界中找到的核酸亚序列或核酸序列片段，只要整个核酸不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且如此一旦导入宿主细胞中，对于宿主细胞而言是外源的，因为整个核酸分子(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，认为作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制型质粒、或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)是非天然存在的核酸。由此可见，认为通过PCR或限制性内切核酸酶处理的基因组DNA片段及cDNA是非天然存在的核酸，因为它们以自然界中找不到的分开的分子存在。由此还可见，以自然界中找不到的排列含有启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是特定细胞外源的。例如，一旦自酵母X细胞分离的整个染色体被导入酵母I细胞中，所述染色体对于酵母I细胞而言是外源核酸。
[0058]可以使用多种方法诸如球形体技术或全细胞氯化锂酵母转化方法将重组核酸以表达载体形式诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒或病毒颗粒导入细胞中。可用于对细胞转化质粒或线性核酸载体的其它方法记载于例如美国专利N0.4，929，555 ；Hinnen等(1978)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 75:1929 ;Ito 等(1983)J.Bacter1l.153:163 ；美国专利 N0.4，879，231 ;及 Sreekrishna 等(1987)Gene 59:115。也可以使用电穿孔和 PEG1000全细胞转化规程，如由 Cregg and Russel, Methods in Molecular B1logy:PichiaProtocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N.J., pp.27-39 (1998)描述的。
[0059]可以使用技术，包括但不限于在转化后在缺乏需要的生物化学产物(由于细胞的营养缺陷型所致)的情况中培养营养缺陷型细胞，选择并检测新表型，或在存在抗生素的情况中培养来选择经转化的酵母细胞，所述抗生素在缺乏转化体中含有的抗性基因的情况中对于酵母是毒性。也可以通过将表达盒整合入基因组中来选择和/或确认转化体，其可以通过例如Southern印迹或PCR分析来评估。
[0060]在将载体导入细胞诸如耶氏酵母细胞中前，可以将载体在细菌细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)中生长(例如，扩增)。可以通过导致载体DNA自细菌环境(milieu)纯化的本领域中已知的任何方法来自细菌细胞分离载体DNA。可以用酹、氯仿、和乙醚来广泛提取纯化的载体DNA，以确保质粒DNA制备物中不存在大肠杆菌蛋白质。
[0061]整合性载体披露于例如美国专利N0.4，882，279。整合性载体一般包含至少第一可插入DNA片段、选择标志基因、和第二可插入DNA片段的连续排列序列。第一和第二可插入DNA片段各为约200 (例如，约250、约300、约350、约400、约450、约500、或约1000或更多)个核苷酸的长度，并且具有与要转化的物种的基因组DNA的一部分同源的核苷酸序列。含有表达的感兴趣基因(例如，编码靶蛋白质的基因)的核苷酸序列在此载体中在第一和第二可插入DNA片段间插入，无论在标志物基因之前还是之后。可以将整合性载体线性化，之后进行酵母转化以便于感兴趣的核苷酸序列对宿主细胞基因组的整合。
[0062]表达载体的特征可以是在酵母(例如，解脂耶氏酵母、陆地酵母、或其它相关二形酵母物种)启动子(其使它们能够在酵母中表达)的控制下的重组核酸。合适的酵母启动子包括 TEFI, HP4D, GAP, P0X2, ADCI, TPI1，ADH2, POX 和 Gal 10 启动子。见例如Madzak 等，(2000)J.Mol.Microb1l.B1technol.2:207-216 ;Guarente 等(1982)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 79(23):7410。其它合适的启动子记载于例如 Zhu 和 Zhang(1999)B1informatics 15(7-8):608-611 及美国专利 N0.6，265，185。
[0063]启动子可以是组成性或诱导型(条件性的)。组成性启动子理解为其表达在标准的培养条件下恒定或基本上恒定的启动子。诱导型启动子是响应一种或多种诱导信号(cue)的启动子。例如，可以将诱导型启动子化学调节(例如，其转录活性受到化学诱导剂诸如乙醇、四环素、类固醇、金属、或其它小分子的存在或缺乏调节的启动子)或物理调节(例如，其转录活性受到物理诱导物诸如光或高或低温的存在或缺乏调节的启动子)。也可以通过自身受到化学或物理信号直接调节的一种或多种转录因子间接调节诱导型启动子。
[0064]本文中描述的遗传工程化细胞可以进一步包括一处或多处别的修饰，使得细胞在靶蛋白上生成期望的N-聚糖。所述别的修饰可以包括下列一项或多项:(i)删除或破坏编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因；(ii)导入编码具有N-糖基化活性的蛋白质(例如，内源或外源蛋白质)的突变体形式的重组核酸(即，表达具有N-糖基化活性的突变体蛋白质)导入或表达干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达的RNA分子；(iv)导入编码具有N-糖基化活性的野生型(例如，内源的或外源的)蛋白质的重组核酸(即，表达具有N-糖基化活性的蛋白质)；及(V)改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的一种或多种内源基因的启动子或增强子元件，如此以改变其编码蛋白质的表达。应当理解项(ii)包括例如用相对于如此替换的内源基因编码具有更大N-糖基化活性的蛋白质的基因替换内源基因。遗传工程还包括改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因以生成具有添加(例如，异源序列)、删除、或取代(例如，突变诸如点突变；保守或非保守突变)的蛋白质。可以将突变特异性引入(例如，定点诱变或同源重组)或者可以随机弓丨入(例如，可以将细胞化学诱变，如记载于例如Newman and Ferro-Novick(1987) J.CellB1l.105(4):1587)。修饰可以包括例如那些记载于 WO 2011/061629 和 WO 2011/039634的。
[0065]此类别的遗传修饰可以导致下列一项或多项:(i)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的升高，(ii)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的降低，(iii)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的定位或胞内分布的变化，或(iv)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的比率变化。应当理解，N-糖基化活性量增加可以由具有N-糖基化活性的一种或多种蛋白质的过表达、内源基因的拷贝数目增加(例如，基因复制)、或刺激由基因编码的蛋白质表达升高的内源基因的启动子或增强子的变化所致。一种或多种N-糖基化活性的降低可以是由于具有N-糖基化改变活性的一种或多种蛋白质的突变体形式(例如，显性负性形式)的过表达、导入或表达降低具有N-糖基化活性的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种干扰RNA分子，或删除或破坏编码具有N-糖基化活性的蛋白质的一种或多种内源基因。
[0066]应当理解，遗传工程化修饰可以是条件性的。例如，可以使用例如位点特异性DNA重组酶诸如 Cre-1oxP 系统(见例如 Gossen 等(2002) Ann.Rev.Genetics 36:153-173 及美国申请公开文本N0.20060014264)来条件性删除基因。
[0067]具有N-糖基化活性的蛋白质包括例如外部链延伸(Outer CHainelongat1n, 0CH1)蛋白、α-1，2_甘露糖苷酶、天冬酰胺连接的糖基化3 (AsparagineLinked Glycosylat1n 3，ALG3)蛋白、I _1，3_葡萄糖基转移酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶
I1、GlcNAc-转移酶I (GnT I)、GlcNAc-转移酶II (GnT II)、或半乳糖基转移酶(Gal T)。
[0068]例如，分泌性蛋白质上期望的N-聚糖可以基于Man5GlcNAc2或Man3GlcNAc2结构。例如为了生成1&11561(3嫩(32基本结构，耶氏酵母细胞可以工程化改造为使得1-1，2-甘露糖苷酶活性在胞内区室中升高，而OCHl活性降低。为了生成Man3GlcNAc2基本结构，ALG3和(在一些实施方案中)OCHl的活性降低，而1-1，2-甘露糖苷酶的活性和在一些实施方案中，1-1，3-葡萄糖基转移酶的活性升高。可以通过将细胞进一步工程化改造为含有下列一项或多项活性来改变此类酵母细胞中生成的蛋白质的N-聚糖概况(profile):GlcNAc转移酶I (GnT I)活性、甘露糖苷酶II活性、GlcNAc转移酶II (GnT II)活性、葡糖苷酶II活性、和半乳糖基转移酶(Gal T)活性。例如，在生成Man5GlcNAc2或Man3GlcNAc2 N-聚糖的耶氏酵母细胞中表达GnT I导致将GlcNAc模块转移至Man5GlcNAc2或Man3GlcNAc2 N-聚糖，使得分别生成 GlcNAcMan5GlcNAc2 或 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖。在生成 GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的细胞中，表达甘露糖苷酶II导致两个甘露糖残基自GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖除去以生成GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖。在生成GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的细胞中，表达GnT II导致另一个GlcNAc模块转移至GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖以生成GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖。在生成 GlcNAcMan3GlcNAc2 或 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的细胞中表达Gal T导致将半乳糖转移至GlcNAcMan3GlcNAc2或GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖以生成 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖。在一些实施方案中，可以表达葡糖苷酶(例如，通过表达α和β亚基)以提高Man3GlcNAc2基本结构的生成。
[0069]编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因可以来自任何含有此类基因的物种。可以获得编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因的例示性真菌物种包括但不限于异常毕赤酵母(Pichia anomala)、牛毕赤酵母(Pichia bovis)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、卡氏毕赤酵母(Pichia carsonii)、粉状毕赤酵母(Pichiafarinose)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、膜購毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、粗状假丝酵母(Candidavalida)、白念珠菌(Candida albicans)、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、南极假丝酵母(Candida Antarctica)、大西洋假丝酵母(Candida atlantica)、Candidaatmosphaerica、峰鄉假丝酵母(Candida blattae)、果生假丝酵母(Candida carpophila)、Candida cerambycidarum、Candida chaul1des、延古月索假丝酵母(Candida corydalis)、Candida dossey1、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)'Candida ergatensis、Candidafructus、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、发酵假丝酵母(Candida fermentati)、吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、黑马朗假丝酵母(Candida haemulonii)、Candida insectamens、Candida insectorum、中型假丝酵母(Candida intermedia)、Candida jeffresi1、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、克鲁斯氏念珠菌(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、Candida lyxosophila、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、膜醭假丝酵母(Candida membranifaciens)、梅林假丝酵母(Candida milleri)、撤揽假丝酵母(Candida oleophila)、俄勒同假丝酵母(Candida oregonensis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、桔假丝酵母(Candida quercitrusa)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatea)、Candida temnochilae、纤维假丝酵母(Candida tenuis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、Candida tsuchiyae、Candida sinolaborantiu、大显假丝酵母(Candida sojae)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、产I元假丝酵母(Candida utilis)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia silvestris、膜醭毕赤酵母、Pichia chodat1、膜醭毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、Pichia minuscule、毕赤酵母、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsi1、Pichia saito1、Pichia silvestris1、Pichia strasburgensis、陆生毕赤酵母(Pichia terricola)、Pichiavanrij1、Pseudozyma Antarctica、圆红冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、Saccharomyces momdshuricus、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、贝酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、二抱酵母(Saccharomyces bisporus)、谢瓦利埃酵母(Saccharomyces chevalieri)、德尔布酵母(Saccharomyces delbrueckii)、少抱酵母(Saccharomyces exiguous)、发酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、Saccharomyces marxianus、蜂蜜酵母(Saccharomycesmellis)、罗斯酵母(Saccharomyces roseii)、鲁酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、魏氏酵母(Saccharomyces willianus)、路氏类酵母(Saccharomycodes Iudwigii)、荚复膜抱酵母(Saccharomycopsis capsularis)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、扣囊复膜酵母、Endomyces horde1、Endomycopsisfobuligera.Saturnispora saito1、八抱裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwann1mycesoccidental is)、德尔布有抱圆酵母(Torulaspora de Ibrueckii)、德尔布有抱圆酵母、Saccharomyces dairensis、德尔布有抱圆酵母、Torulaspora fermentat1、发酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、德尔布有抱圆酵母、罗斯有抱圆酵母(Torulasporarosei)、罗斯有孢圆酵母、德尔布有孢圆酵母、罗斯酵母、德尔布有孢圆酵母、德尔布酵母、德尔布有抱圆酵母、德尔布酵母、Zygosaccharomyces mongolicus、Dorulasporaglobosa、球形德巴利酵母(Debaryomyces globosus)、球拟圆酵母(Torulopsis globosa)、皮状丝抱酵母(Trichosporon cutaneum)、三角酵母(Trigonopsis variabilis)、Will1psis californica、土星拟威尔酵母(Will1psis saturnus)、二抱接合酵母(Zygosaccharomyces bisporus)、二抱接合酵母、Debaryomyces disporua、二抱酵母(Saccharomyces bisporas)、二抱接合酵母、二抱酵母、Zygosaccharomycesmellis、Zygosaccharomyces pr1rianus、Zygosaccharomyces 1uxiinKr^ 氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、巴格式结合酵母(Zygosaccharomyces barkeri)、鲁酵母、鲁氏接合酵母、醫醒接合酵母(Zygosaccharomyces majori)、Saccharomyces rousi1、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、Pichia bovis、加拿大毕赤酵母(Pichia Canadensis)、卡氏毕赤酵母(Pichia carsonii)、粉末毕赤酵母(Pichia farinose)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia pseudopolymorpha、 Pichia quercuum、 Pichia robertsi1、 PseudozymaAntarctica、圆红冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、圆红冬抱酵母菌、胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、贝酵母、二抱酵母、酿酒酵母、谢瓦利埃酵母、德尔布酵母、发酵性酵母、脆壁酵母、路氏类酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母、德尔布有孢圆酵母、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)、变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)、Will1psis californica、土星拟威尔酵母、二抱接合酵母、Zygosaccharomyces mellis、鲁氏接合酵母、或本领域中已知的或本文中所描述的任何其它真菌(例如，酵母)。
[0070]例示性的低等真核生物还包括曲霉属(Aspergillus)的多种物种，包括但不限于浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillusdeflectus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(黑曲霉素)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、帚状曲霉(Aspergillus penicilloides)、局限曲霉(Aspergillusrestrictus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、溜曲霉(Aspergillus tamari)、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)、或花斑曲霉(Aspergillus versicolor)。
[0071] 可以获得编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因的例示性原生动物属包括但不限于动体目(Blastocrithidia)、短膜虫属(Crithidia)、肠锥虫属(Endotrypanum)、匍滴虫属(Herpetomonas)、利什曼原虫属(Leishmania)、细滴虫属(Leptomonas)、植物单胞菌属(Phytomonas)、锥体虫属(Trypanosoma)(例如，布氏锥虫(T.bruceii)、冈比亚锥虫(T.gambiense)、罗德西亚维虫(T.rhodesiense)、和克氏维虫(T.cruzi))、和 Wallaceina0
[0072]例如，编码GnT I的基因可以获自人(Swiss蛋白质登录号P26572)、大鼠、拟南芥属(Arabidopsis)、小鼠、或果蚬属(Drosophila);编码GntII的基因可以获自人、大鼠(Swiss蛋白质登录号Q09326)、拟南芥属、或小鼠；编码Man II的基因可以获自人、大鼠、拟南芥属、小鼠、果蝇属(Swiss蛋白质登录号Q24451);而编码GalT的基因可以获自人(Swiss蛋白质登录号P15291)、大鼠、小鼠、或牛。
[0073]在一些实施方案中，除了具有pYPSl和pYPS2活性缺陷外，本文中描述的遗传工程细胞还可以包含一种或多种以下修饰。例如，遗传工程细胞可以进一步缺乏OCHl (GenBank登录号:AJ563920)基因或其基因产物(mRNA或蛋白质)。在一些实施方案中，遗传工程细胞可以进一步缺乏 ALG3( Genbank? 登录号:XM_503488，Genolevures 参照:YAL10E03190g)基因或其基因产物(mRNA或蛋白质)。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达(例如，过表达)α -1, 3-葡萄糖基转移酶(例如，ALG6，Genbank?作录号:XM_502922,Genolevures参照:YAL10D17028g)蛋白。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达α-1,2-甘露糖苷酶(例如，Genbank登录号:AF212153)蛋白。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达GlcNAc转移酶I (例如，Swiss Prot.登录号P26572)蛋白。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达甘露糖苷酶II蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登录号Q24451)。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达半乳糖基转移酶I蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登录号P15291)。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达GlcNAc转移酶II蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登录号Q09326)。在一些实施方案中，遗传工程细胞进一步表达葡萄糖苷酶II诸如解脂耶氏酵母、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)或黑曲霉素(Aspergillus niger)的葡萄糖苷酶II的alpha或beta亚基(或alpha和beta亚基两者)。遗传工程细胞可以具有这些修饰的任何组合。
[0074]例如，在一些实施方案中，遗传工程细胞可以缺乏OCHl基因，并且表达α-1，2_甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶1、甘露糖苷酶I1、和半乳糖基转移酶I。在一些实施方案中，遗传工程细胞可以缺乏ALG3基因，并且表达α -1, 2_甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶1、GlcNAc转移酶1、和半乳糖基转移酶I。此类遗传工程细胞进一步可以表达α-1,3-葡萄糖基转移酶和/或表达葡萄糖苷酶II的alpha和beta亚基和/或缺乏OCHl基因。
[0075]多种此类蛋白质之一可以是含有异源靶向序列的融合蛋白。例如，α-1,2-甘露糖苷酶可以具有HDEL内质网(ER)-保留氨基酸序列。应当理解，可以将具有N-糖基化活性的任何蛋白质工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白。其它蛋白质可以具有将蛋白质靶向至高尔基体的异源序列。例如，可以使用由酵母Kre2p基因编码的前100个N端氨基酸、由酿酒酵母Mnn2基因编码的前36个N端氨基酸(Swiss Prot.登录号P38069)、或由酿酒酵母Mnn2p基因编码的前46个N端氨基酸来将蛋白质靶向至高尔基。因此，编码要在真菌细胞中表达的蛋白质的核酸可以包含编码将编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列。例如，可以将α-1,2-甘露糖苷酶靶向至ER，而可以将GnT 1、GnTI1、甘露糖苷酶、和Gal T靶向至高尔基体(Golgi)。
[0076]在具有N-糖基化活性的靶蛋白或蛋白质源自与要表达蛋白质的细胞不同类型(例如，不同物种)的细胞的实施方案中，可以将编码蛋白质的核酸进行密码子优化以在感兴趣的特定细胞中表达。例如，可以将编码来自布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的具有N-糖基化的蛋白质的核酸进行密码子优化以在酵母细胞诸如解脂耶氏酵母中表达。此类密码子优化可以用于提高蛋白质在感兴趣细胞中的表达。用于将编码蛋白质的核酸进行密码子优化的方法是本领域中已知的，并且记载于例如Gao等(B1technol.Prog.(2004)20 (2):443-448)，Kotula 等(Nat.B1techn.(1991)9，1386 - 1389)及 Bennetzen 等(J.B1l.Chem.(1982) 257 (6): 2036-3031)。表1显示了解脂耶氏酵母的密码子选择。数据源自存在于5，967种编码序列的2，945，919个密码子。表1的内容获自密码子选择数据库，其可以见万维网于 kazusa.0r.jp/codon/cg1-bin/showcodon.cgi ? species = 284591。
[0077]表1
[0078]解脂耶氏酵母密码子使用表
[0079]
【权利要求】
1.一种分离的耶氏酵母(Yarrowia)细胞，其遗传工程化改造为包含pYPSl (YPS1蛋白)活性缺陷和pYPS2(YPS2蛋白)活性缺陷。
2.权利要求1的细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母(YarrowiaIipolytica)细胞。
3.权利要求1或权利要求2的细胞，其中所述细胞进一步包含编码靶蛋白的核酸。
4.权利要求3的细胞，其中所述靶蛋白是溶酶体蛋白、病原体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段的一条或两条多肽链、或融合蛋白。
5.权利要求4的细胞，其中所述抗体选自下组:结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、结合CD3的抗体、结合肿瘤坏死因子(TNF)的抗体、结合TNF受体的抗体、结合CD20的抗体、结合糖蛋白Ila/IIb受体的抗体、结合IL2受体的抗体、结合⑶52的抗体、结合⑶IIa的抗体、和结合HER2的抗体。
6.权利要求4的细胞，其中所述抗原结合片段选自下组:Fab、F(ab’)2、Fv、和单链Fv(scFv)片段。
7.权利要求1-6中任一项的细胞，其中所述细胞进一步是OCHl活性缺陷的。
8.权利要求1-7中任一项的细胞，其中所述细胞包含编码alpha-1，2甘露糖苷酶的核酸。
9.权利要求8的细胞，其中所述alpha-1,2甘露糖苷酶包含靶向序列以将所述alpha-1, 2甘露糖苷酶革巴向至胞内区室。
10.权利要求1-9中任一项的细胞，其中所述细胞进一步是ALG3活性缺陷的。
11.权利要求1-10中任一项的细胞，其中所述细胞进一步包含编码alpha-1，3-葡萄糖基转移酶的核酸。
12.权利要求1-11中任一项的细胞，所述细胞进一步包含编码葡糖苷酶的alpha和beta亚基的核酸。
13.权利要求1-12中任一项的细胞，其中所述细胞包含编码GlcNAc-转移酶I的核酸。
14.权利要求13的细胞，其中所述GlcNAc-转移酶I包含靶向序列以将所述GlcNAc-转移酶I靶向至胞内区室。
15.权利要求1-14中任一项的细胞，其中所述细胞包含编码GlcNAc-转移酶II的核酸。
16.权利要求15的细胞，其中所述GlcNAc-转移酶II包含靶向序列以将所述GlcNAc-转移酶II靶向至胞内区室。
17.权利要求1-16中任一项的细胞，所述细胞进一步包含编码半乳糖基转移酶的核酸。
18.权利要求17的细胞，其中所述半乳糖基转移酶包含靶向序列以将所述半乳糖基转移酶靶向至高尔基体。
19.权利要求1-18中任一项的细胞，其中所述细胞不生成可检测水平的功能性pYPSl或功能性PYPS2。
20.权利要求1-19中任一项的细胞，其中所述细胞不生成可检测的编码功能性pYPSl和功能性PYPS2的mRNA分子。
21.权利要求1-20中任一项的细胞，其中所述YPSl和YPS2基因在所述细胞中被破坏。
22.权利要求1-21中任一项的细胞，其中所述YPSl和YPS2可读框被删除。
23.解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量的所述解脂耶氏酵母细胞被遗传工程化改造为包含PYPSl活性缺陷和pYPS2活性缺陷。
24.一种分离的耶氏酵母细胞，其遗传工程化改造为包含(i)pYPSl活性缺陷和(ii)PYPS2活性缺陷，以及下列一项或多项:(iii)ALG3活性缺陷，(iv)OCHl活性缺陷，(v)编码alpha-1, 2甘露糖苷酶的核酸，(vi)编码GlcNAc-转移酶I的核酸，(vii)编码GlcNAc-转移酶II的核酸，(viii)编码甘露糖苷酶II的核酸，(ix)编码α _1，3-葡萄糖基转移酶的核酸，(x)编码半乳糖基转移酶的核酸，和(xi)编码葡糖苷酶的α和β亚基的核酸。
25.权利要求24的细胞，其中所述细胞进一步包含编码靶蛋白的核酸。
26.一种用于降低耶氏酵母中生成的靶蛋白的降解的方法，所述方法包括在权利要求1-25中任一项的耶氏酵母细胞中表达编码所述靶蛋白的核酸。
27.一种用于生成靶蛋白的方法，所述方法包括a)提供遗传工程化改造为包含pYPSl活性缺陷，PYPS2活性缺陷，和编码所述靶蛋白的核酸的耶氏酵母细胞；并13)在使得所述细胞生成所述靶蛋白的条 件下培养所述细胞。
【文档编号】C12N15/81GK104136622SQ201280070829
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2011年12月30日
【发明者】W.弗维肯, S.里卡尔特 申请人:奥克西雷恩英国有限公司