流感病毒温度敏感株关键位点的筛选、突变株及其机制的探讨的制作方法
【专利摘要】本发明首次从PB1和PB2基因水平上，应用冷获得性流感病毒A/AA/6/60和A/Leningrad/134/57/17关键位点，通过点突变A/PR8病毒株，筛选出新的温度敏感型突变株：A/PR8/34(H1N1)/PB1-391/581(CGMCCNo.6207)和A/PR8/34(H1N1)/PB1-265/591+PB2-478(CGMCC?No.6206)；本发明从病毒RNA水平和聚合酶活性两个方面对突变株表型的机制进行了分析；本发明还对筛选的温度敏感株在细胞和动物水平进行了研究；本发明所述的温度敏感型流感活疫苗，适应于临床应用。
【专利说明】流感病毒温度敏感株关键位点的筛选、突变株及其机制的探讨
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，本发明具体地涉及温度敏感型流感病毒突变株A/PR8/34(HlNl)/PB1-391/581 和 A/PR8/34(HlNl)/PB1-265/591+PB2-478 及其构建方法，以及所述突变株的温度敏感型及减毒表型的研究，并从分子生物学、细胞及动物水平对其进行了分析及筛选，具有临床应用价值。
【背景技术】
[0002]A型流感病毒是具有高度传染性的人类和动物病原体。作为一个主要的冬季呼吸道感染，季节性流感仍是发病率和死亡率的重要原因。流感流行伴随着死亡率的增加。增加的死亡率不仅仅由流感和肺炎引起，也与流感引起的心肺疾病和其他慢性病恶化有关。
[0003]接种疫苗是预防和控制流感的主要战略。两种不同类型的疫苗，灭活和活的，目前获准用于预防季节性流感。三价季节性流感疫苗，每个剂型包含三种病毒(或HA蛋白)，即最有可能在即将到来的流感季节流通的A型H3N2、HlNl及B型流感株。自1945年以来三价灭活流感疫苗(TIV)已被使用。三个减毒活疫苗在2003年通过了美国FDA批准；2009年9月，FDA又批准了一株LAIV鼻内的新型甲型HlNl流感病毒疫苗。
[0004]在美国，冷适应性流感病毒A/AA/6/60(H2N2)是减毒三价季节性流感活疫苗的主要组成。该病毒最初是取喉咙洗出液于36°C在鸡胚肾组织培养，逐步降低温度到25°C至连续传代适应。该 病毒复制效率在25°C和33°C，但在温度超过39°C不能有效地复制；这些表型性状分别为冷适应(CA)和对温度敏感的(TS)表型。此外，该病毒在体内减毒(ATT表型)，并仅限于小鼠和雪貂的呼吸道中复制。这些表型是由三个基因(PB1，PB2和NP)段指定的五个突变。
[0005]在俄罗斯有两株冷适应性流感疫苗，均来自同一 H2N2株A/Leningrad/134/57，已适应25°C鸡胚增长。第一株，Len/17,传代17次，已用于成人。第二，Len/47,传代47次，并已用于年龄小于16岁的儿童。
[0006]虽然减毒活疫苗已被批准用于人类，但是它的机制还不清楚。病毒RNA聚合酶在感染禽类和人类的流感病毒株中高度保守。我们检测了聚合酶活性和RNA水平，试图解释减毒活疫苗的机制。本实验选择突变A/PR8 (HlNl)。通过反式遗传技术，改良了 PB2和PBl基因，使其获得温度敏感和减毒表型。我们的研究建议，这些用于减毒活疫苗制备的突变位点可以用于流感流行株的制备，利于季节性流感的预防。
【发明内容】
[0007]本发明旨在构建一种通用的温度敏感型流感活疫苗，从而有效地预防流感病毒。
[0008]本发明首次从PBl和PB2基因水平上，基于A/AA/6/60 (H2N2)和A/Leningrad/134/57/17关键位点信息去构建新的温度敏感型流感突变株。
[0009]本发明所述的流感病毒活疫苗，其在PBl和/或PB2基因中包含与A/AA/6/60 (H2N2)和A/Leningrad/134/57中的突变位点相似的突变位点。
[0010]本发明的优选实施例中，筛选出温度敏感株具有温度敏感型和减毒表型。
[0011]本发明的优选实施例中，上述的敏感株突变位点基于A/AA/6/60(H2N2)和A/Leningrad/134/57的突变位点信息选择。
[0012]本发明的优选实施例中，上述的敏感株是基于A/PR8改造的，八质粒系统A/PR8由伦敦大学的Dr Kenth Gustafsson馈赠,本实验室按照常规方法包装,该病毒株目前很多实验室都在使用，许多文献都有报道，例如Jin H，Lu B，Zhou H，Ma C，Zhao J，et al.(2003)Multiple amino acid residuesconfer temperature sensitivity to human influenzavirus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60.Virology 306:18-24.。2005年Hoffmann等建立了使用双向转录表达载体的8质粒系统，在同一个模板(载体上)实现vRNA的转录和病毒蛋白的表达。在这种表达载体中，把编码—嫩的(^嫩正向克隆至？0111启动子(从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来)和终止序列(牛生长激素Poly(A)信号aIIBGH)之间，在此表达盒之间还反向插入了人pol I启动子(P I h)和鼠pol I终止序列(t I)。8个基因片段cDNA分别克隆后转染真核细胞，在同一个模板上由pol I控制合成负链vRNA，由polll控制合成正链mRNA并表达蛋白质。该技术已是一成熟的流感病毒包装技术并被广泛应用。以A/PR8作为减毒株，通过对其关键位点的突变，我们成功获取了两株温度敏感型流感病毒突变株:A/PR8/34 (HlNl)/PB1-391/581和A/PR8/34 (HlNl) /PB1 -2 65/591+PB2-478,所述两株温度敏感型流感病毒突变株已于2012年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)，A/PR8/34(HlNl)/PB1-391/581 的保藏号为 CGMCC N0.6207, A/PR8/34 (HlNl)/PB1-265/591+PB2-478 的保藏号为CGMCC N0.6206。上述两株温度敏感型流感病毒突变株在本发明中还分别简称为PB1-391/581 和 PB1-265/591+PB2-478。
[0013]从下表3可以看到，以往文献报道至少需要4个以上突变位点才能检测到温度敏感表型，而A/PR8/34 (HlNl) /PB1-391/581只需要突变两个位点即可。而A/PR8/34 (HlNl) /PB1-265/591+PB2-478是首次在A/PR8病毒株上进行突变并获得相应的温度敏感株。以上突变位点为温度敏感及减毒株的制备提供了依据。
[0014]表1.A/PR8/34 (HlNl)/PB1-391/581 突变株的突变位点
【权利要求】
1.以A/PR8为骨架构建的温度敏感型流感病毒突变株:A/PR8/34(HlNl) /PB1-391/581和A/PR8/34 (HlNl)/PB1-265/591+PB2-478，其中温度敏感型流感病毒突变株A/PR8/34 (HlNl)/PB1-391/581的保藏号为CGMCC N0.6207，温度敏感型流感病毒突变株A/PR8/34 (HlNl)/PB1-265/591+PB2-478 的保藏号为 CGMCC N0.6206。
2.—种构建减毒和稳定敏感型流感病毒突变株的方法，所述方法包括在流感病毒的PBl基因中引入K39IE和E581G突变氨基酸位点；或者在流感病毒的PBl基因中引入K265N及V591I突变氨基酸位点，并且在流感病毒的PB2基因中引入V478L突变氨基酸位点。
3.含K391E及E581G突变氨基酸位点的PBl基因或含K265N及V591I突变氨基酸位点的PBl基因组合含V478L突变氨基酸位点的PB2基因在构建减毒和稳定敏感型流感病毒突变株中的应用。
4.一种减毒和稳定敏感型流感疫苗，所述疫苗包含权利要求1所述的温度敏感型流感病毒突变株中的任一种。
【文档编号】C12N7/01GK103923886SQ201310011824
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2013年1月11日
【发明者】高斌, 贺文, 王伟 申请人:中国科学院微生物研究所