专利名称：检测人21号染色体str基因型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及荧光定量PCR技术(QF-PCR)，具体涉及一种检测人类21号染色体STR基因型的试剂盒，是多个STR基因座基因型的快速高通量检测。
背景技术：
21三体综合征(又称唐氏综合征)是活产儿中发病率最高的染色体异常疾病，约占1/600。该疾病患者的21号染色体数目由正常的两条变为3条，临床表现为严重的智力发育迟缓，易并发心脏病、白血病、免疫功能低下等。该疾病目前无法治疗，主要通过产前诊断进行预防。我国大规模开展的产前诊断主要手段和金标准是细胞遗传学染色体核型分析，该方法准确、可靠，但建立在手工操作基础上，依赖人工分析和经验积累，存在检测周期长(2-3周时间)、检测通量低下等诸多问题。染色体核型分析作为主流技术，已难以满足临床日益增长的产前诊断需求。QF-PCR是一种快速分子诊断技术，能基于自动化平台对遗传标记STR(短串联重复序列)的多态性进行定性、定量分析以诊断目标染色体数目，有助于突破目前染色体核型分析的技术瓶颈，达到快速、准确、自动化、高通量检测的目的。STR存在于染色体上的特定位置，遵循孟德尔遗传规律，每个STR基因座与所在染色体具有连锁关系，能够代表相应染色体的数量。具体来说，正常染色体有两条，在特定STR基因座上可表现为I个等位基因(来源于父母的两个等位基因一致，也称纯合子)或基因量相等的2个等位基因(来源于父母的两个等位基因不同，也称杂合子)。对21三体综合征而言，多余的I条21号染色体来自于母亲或父亲，理论上在特定STR基因座应有3个等位基因，但由于STR的多态性有限，实际检测时在21号染色体STR基因座可能出现三种基因型情况:第一种为I个等位基因，即3条染色体的STR等位基因相 同；第二种为2个等位基因，即3条染色体中有两条的等位基因一致，但两个等位基因的基因量有差别，约为1:2或2:1的比例；第三种为3个等位基因，SP3条染色体的等位基因各不相同，其基因量比例近似为1:1:1。后两种基因型能够提示染色体数量为3条，都具有诊断价值，以第三种最有诊断价值。基于STR多态性和基因组正常变异的复杂性，STR检测用于特定染色体的数目诊断时需要联用多个STR基因座，而STR又具有人群的特异性，因此，选择本人群中多态性好、杂合度高的多个STR基因座联合，更易获得有诊断价值的基因座、达到准确诊断染色体数目的目的。目前用于染色体数目检测的QF-PCR商品化试剂盒，如英国的Aneufast、Elucigene QSTR,瑞典的 Chromo Quent> Deryser,美国 ABI 的 TrueScience AneuploidySTR Kits,所选择的闻多态性基因座都是基于白人(或闻加索人)的群体样本，可能未必适用于中国人群。研发针对中国人群的QF-PCR诊断试剂盒，首先就是要选择本人群具有高多态性的STR基因座的方法，这需要在一定样本量基础上建立群体遗传学资料以从中挑选；其次，就是建立复合检测多个STR基因座的QF-PCR检测方法，达到高通量、快速检测的目的，这对引物设计、PCR条件控制等提出了较高的要求。
QF-PCR检测结果的标准化也是临床普及应用的重要前提。目前市场的同类型产品和已有专利缺乏对STR等位基因的精确分型，检测结果表述难以统一，不利于临床常规应用和实验室质量控制。要做到STR等位基因的精确分型，首先需要对特定群体中观察到的所有等位基因进行扩增、克隆，再通过DNA测序证实各等位基因的序列组成，按照国际遗传学通用法则进行等位基因命名，然后将已知等位基因混合制备成标准品，与待测标本同时电泳，配合软件分析对待测标本进行等位基因分型。尽管STR分型技术已在法医DNA分型及其他领域的应用已得到广泛认可，但在检测染色体数目的QF-PCR技术中尚未得到应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人21号染色体STR基因型的试剂盒，是一种快速复合扩增检测人类21号染色体STR基因座的QF-PCR试剂盒，用于检测21号染色体的数目，主要用于诊断21三体综合征。本发明试剂盒包括独立包装的扩增试剂和扩增产物检测试剂，所述的扩增试剂包括弓I物混合物、热启动C-Taq酶、扩增反应液、质控品，采用体外聚合酶链式反应(PCR)进行扩增；所述的扩增产物检测试剂包括分子量内标、等位基因分型标准品(Allelic Ladder),在单通道或多通道毛细管电泳仪上检测扩增产物；所述引物混合物包括12对引物SEQ IDN0.1-24，所述扩增反应液包含PCR缓冲液、MgCl2和dNTP，质控品优选9947A女性DNA，也可以是已知基因型的其它DNA，用以控制实验室质量。本发明试剂盒没有采用文献报导的引物序列，而是根据复合检测的要求对12个基因座的扩增引物重新进行了设计，引物混合物中的引物均对应于基因座的侧翼序列，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。每对引物分别用三种不同的荧光染料FAM、HEX、TAMRA进行标记，用于同时扩增21号染色体上的11个STR基因座和I个性染色体基因座。所述引物混合物中，D21S1432、D21S11、D21S1246和D21S1412等4个基因座的引物采用FAM (蓝色)标记;D21S1437、D21S1413、D21S2039和D21S1270等4个基因座的引物采用HEX (绿色)标记；Amelogenin、D21S1435、D21S1446和D21S1409等4个基因座的引物采用TAMRA (黄色)标 记。所述引物信息具体参见表I。
权利要求
1.一种检测人21号染色体STR基因型的试剂盒，由扩增试剂和扩增产物检测试剂组成， 所述的扩增试剂包括引物混合物、热启动C-Taq酶、扩增反应液、质控品，所述的扩增产物检测试剂包括分子量内标、等位基因分型标准品；所述的引物混合物包括12对引物SEQ ID N0.1-24，所述扩增反应液包含PCR缓冲液、MgCl2和dNTP，质控品选用9947A女性DNA或已知基因型的其它DNA。
2.根据权利要求1所述的一种检测人21号染色体STR基因型的试剂盒，其特征在于，所述分子量内标包括 75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500 的14个片段长度，采用荧光染料SIZ标记分子量内标，使用时加入电泳混合液与待测样本一起电泳。
3.根据权利要求1所述的一种检测人21号染色体STR基因型的试剂盒，其特征在于，所述等位基因分型标准品由各STR基因座的所有已知等位基因经混合调平衡后制备而成，使用时加入电泳混合液与待测样本一起电泳，经ABI GeneMapper IDv3.2软件分析。
4.根据权利要求1所述的一种检测人21号染色体STR基因型的试剂盒，其特征在于，所述弓I物混合物中的引物均对应于基因座的侧翼序列，其中每对弓丨物中有一条引物的5 ’端进行荧光染料标记。
5.根据权利要求4所述的一种检测人21号染色体STR基因型的试剂盒，其特征在于，每对引物分别用三种不同的荧光染料FAM、HEX、TAMRA进行标记，用于同时扩增21号染色体上的11个STR基因座和I个性染色体`基因座。
全文摘要
本发明提供一种检测人类21号染色体STR基因型的试剂盒，由扩增试剂和扩增产物检测试剂组成，主要包含12对荧光标记的引物、包含14个片段大小的分子量内标、等位基因分型标准品和一个质控品。本发明试剂盒，使用时标本需要量少、诊断快速，可用于绒毛、羊水、血液等多种组织，既可进行产前诊断，也可用于21三体流产胚胎多余染色体的来源分析；能够精确地诊断基因型，有利于诊断结果表述和实验室质量评价；能实现快速、准确、自动化、高通量地检测21号染色体数目，并实现检测结果的质量可控和标准化，具有临床应用前景。
文档编号C12Q1/68GK103103267SQ201310020780
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月19日 优先权日2013年1月19日
发明者朱宇宁, 吕时铭, 薛佳, 郑卫国, 陈雁, 张民 申请人:浙江大学医学院附属妇产科医院, 无锡中德美联生物技术有限公司, 杭州博圣生物技术有限公司