专利名称：金银花p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H 及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种金银花P-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’ H及其应用。
背景技术：
植物次生代谢是指有些生物体利用某些初生代谢产物为“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质的过程，这些特殊的化学物质即为次生代谢产物，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等，它们是植物中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物，但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展却起着不可替代的作用。植物次生代谢产物具有重要的经济价值。临床应用的药物，有很多都是取自植物的次生代谢产物。西方的临床药物中，大约25%是直接或间接地从植物中提取的次生代谢物。在我国，药用植物的应用历史更为悠久。此外，用作食品调味剂、日用芳香剂、杀虫剂等的植物次生代谢产物也倍受人们的青睐。随着基因工程技术的不断完善，对植物细胞代谢网络进行修饰和改造来积累大量目的产物已成为可能。目前，次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。应用关键酶基因的代谢工程为提高植物组织、细胞培养及整体植株代谢产物的产量提供了技术平台。植物次生代谢产物种类繁多，生物合成途径也千差万别，只有在了解目标植物特定次生代谢途径的基础上，才能有选择地进行有效的基因操作。因此，植物次生代谢图谱的研究是植物次生代谢基因工程 必要的前提工作。中草药是中国传 统的药用植物，其有效成分绝大多数都来源于次生代谢产物，在植物中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量难度很大。通过次生代谢的基因工程，来提高中药材有效成分含量的研究刚刚起步。有效成分相关基因的克隆及其功能鉴定的有效方法还较少，且耗时，所获得的次级代谢途径中的相关基因较少。山东道地药材金银花(Lonicera japonica Thunb.)是忍冬科忍冬属(Lonicera)植物，具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫调节等作用。含有多种生物活性成分挥发油成分类、芳樟醇、棕搁酸、黄酮类化合物类(木犀草素、忍冬昔等)、绿原酸类(绿原酸和异绿原酸、咖啡酸及棕搁酸等)、三萜皂苷类(忍冬苦苷A和忍冬苦苷C)、P-谷甾醇等。一般认为绿原酸类化合物是金银花主要有效成分。绿原酸在清除自由基、水果和蔬菜的酶促褐变以及抗真菌和抗虫等方面具有重要功能。因此，提高绿原酸含量对改善金银花品质具有重要意义。绿原酸的生物合成属于植物的苯丙素类代谢途径。植物通过该途径合成了大量重要的次生代谢物质。羟基肉桂酸是木质素合成的中间产物，决定细胞壁的合成及物理化学性质。同时，羟基肉桂酸还是众多挥发类物质合成的前体，这些物质在植物化感作用中具有重要功能。咖啡酸和阿魏酸酯是植物体内重要的抗氧化物质。由苯丙烷生成的其它物质还参与了植物应对环境的生物和非生物胁迫，例如二苯乙烯和类黄酮都是重要的植物抗毒素。苯丙素类物质的生物合成至少需要两步羟化反应。首先是苯环的4号碳原子由肉桂酸羟化酶(C4H)催化羟化。C4H功能在植物中比较容易测定，是最早鉴定的P450家族成员之一。第二步羟化反应发生在苯环的3号碳原子，由P-香豆酰酯3’ -羟化酶(C3’ H)催化。目前对C3’ H的功能和酶活特性还不完全清楚。有研究表明C3’ H是依赖抗坏血酸、NADPH或者黄素的氧化酶。另有学者认为C3’H位于质体，利用质体醌或者铁氧化还原蛋白为电子供体。也有人认为3号碳原子的羟化反应是由P450以香豆酰奎尼酸或者香豆酰莽草酸为底物催化的。被子植物C3’ H属于细胞色素P450 CYP98家族，其催化的羟化反应不能以香豆酸单体为底物，只能催化香豆酰与莽草酸或者奎尼酸形成的复合物。拟南芥中C3’H功能丧失导致植株矮小，且高度不育，表明C3’ H在植物苯丙氨酸代谢途径中是必需的。尽管目前已经在许多物种中克隆到P-香豆酰酯3’-羟化酶基因，但是对于忍冬科植物金银花来说该基因的克隆、功能验证尚未见报道，并且对于该基因与绿原酸关系的研究也是未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种金银花中绿原酸相关基因一一P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H及其在制备绿原酸中的应用。本发明的技术方案是从金银花中分离得到P-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H，在原核系统中验证功能，然后在原植株中研究其与绿原酸生物合成的关系。本发明所述的金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H，其特征在于所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了一种含上述金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因的原核表达载体pET28a-LjC3’ H，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述原核表达载体pET28a_LjC3’H的构建主要通过以下四步完成1)带有EcoRI和XhoI酶切位点的引物扩增目的基因LjC3’ H ；2)将目的基因LjC3’ H克隆入pMD18_T载体；3)将含有LjC3’ H基因的pMD18-T载体和pET28a载体分别用EcoRI和XhoI进行双酶切；4)将回收的LjC3’ H基因和pET28a载体连接。本发明所述金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’H在制备绿原酸中的应用。本发明在金银花中克隆得到的基因LjC3’ H与其他物种中的类似基因相比同源性在46-77%之间。对其保守区分析发现，金银花中P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H的氨基酸序列含有4个CYP家族的保守域PPGP、I helix、PERF和PFGXGRRXCX。在已知其它物种中的P-香豆酰酯3’-羟化酶基因中都含有该保守域，该结构上的特征对于其功能的发挥具有一定的作用。实验证实将体外纯化的LjC3’ H蛋白加入酶促反应体系中，能够将香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸分别催化生成绿原酸和咖啡酰莽草酸，其中所述绿原酸和咖啡酰莽草酸的含量由HPLC方法测定。本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了金银花中的P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H并进行了功能验证。通过不同诱导子处理金银花植株，经过比较分析证明，LjC3’H基因与绿原酸生物合成密切相关。故对于该基因LjC3’ H的研究具有重要都意义和应用前景。
图1为金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H的读码框电泳图其中1为 LjC3’ H 基因，M 为 Marker。图2为金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H蛋白纯化图其中M，蛋白分子标准；1，未经IPTG诱导总蛋白；2，未经IPTG诱导的可溶性蛋白；3，经IPTG诱导总蛋白；4，经IPTG诱导的可溶性蛋白；5，回收的LjC3’ H蛋白。图3纯化的LjC3’ H蛋白催化香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸的HPLC检测。图4不同诱导子处理条件下，金银花植株中LjC3’ H基因的表达分析。
具体实施例方式实施例1、LjC3’ H的克隆1.1金银花总RNA的提取(I)金银花材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50_100mg组织材料加入ImlTRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min, 2_8°C离心IOmin去沉淀。(3)每Iml TRIZOL溶液`中加入O. 2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min, 12000r/min, 2-8。。离心 15min。(4)取上清，每Iml TRIZOL加入O. 5ml的异丙醇，混匀，室温放置10 20min。(5) 2-8°C 12000r/min 离心 lOmin,弃上清。(6)加lml75%乙醇洗漆沉淀2次，4°C不超过7500r/min离心5min,弃上清。(7)室温放置晾干后，加入15 μ I DEPC处理的双蒸水溶解RNA。1. 2逆转录合成第一链cDNA(I) O. 2ml Eppendorf 管中，加入下列成分用DNaseI 纯化的上述总 RNA (O.1 μ g/ μ I) 2. O μ IOlige (dT) anchored primer (2 μ Μ) 2. 0 μ I(2) (TC水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。(3)在 10μ I 反应体系中加入下列成分2· 0μ I 5 X MMLV RT buffer;1. O μ I250ymol/L dNTP mix;0. 25 μ I Rnasin; 0· 5 μ I (200u/μ I) MMLV 逆转录酶；2 μ I 上述 RNA变性液。42°C进行逆转录反应Ihr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。1. 3 PCR以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。(I)PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物PO: 5，-GTYGGHAACCTCTACGAC-3，引物P1:5’ -RTCWCKVGCNACHGCCCA-3’其中W=T or A;R=A or G; Y=C or T;N=C, T, A or G;H=A, T or C;K=G or T; V=G, A or C
(2) PCR反应体系
IOxPCR buffer2μ1
MgCb(25m.mol/L)1.5μ1
dNTP(each 250fimol/L)0.2μ1
PO (ΙΟμιηοΙ/L)I d
Pl (iOiLimo1/L)Ιμ
逆转录第一链产物4μ1
Ex Taq0.2μ1
无菌水ΙΟ.ΙμΙ(3) PCR反应程序94°C 5min ；94°C 3Osec, 50°C 3Osec, 72°C 2min, 35 个循环；最后 72°C延伸 7min。1. 4 3 ;和 5 ' - RACE按照TaKaRa Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳3 '和5 ' -RACE产物。1. 5目的片段的回收(I)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1. 5mlEppendorf管中。(2)称重，加入3-4倍体积的DR-1 Buffer, 65°C加热IOmin融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化。(3)加入 DR-1 Buffer 量的 1/2 体积的 DR-1I Buffer,均勻混合。(4)将 Spin Cloumn 安置于 Collection Tube 上,将上述溶液转移至 Spin Column中，5000rpm离心lmin,弃滤液。(5)将 500 μ I Rinse A 加入 Spin Column 中，5000rpm 离心 lmin,弃滤液。(6)将 700 μ I Rinse B 加入 Spin Column 中，5000rpm 离心 lmin，弃滤液。(7)重复步骤6,然后12000rpm再离心lmin。(8)将Spin Cloumn安置于新的L 5ml的离心管上,在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60°C的25 μ I的水或洗脱缓冲液，室温静置lmin。(9) 12000rpm 离心 lmin 洗脱 DNA。(10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5. 3)和2倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀Ihr0(11)然后41，12000印111离心15min，用70%冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40 μ I无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。1. 6 连接用上述的回收目的片段与pMD-18T载体(购自宝生物工程有限公司，下同)按摩尔比约1:1的比例进行连接，连接体系如下
H的片段7μ1
T-veclorΙμ
10X 4 DNA Ligase BufferI μ
Τ4 DNA LigaseΙμ 混匀并短暂离心，16°C连接过夜。得到重组质粒PMD18T-AS1，用于后面的反应。1. 7 CaCl2法制备感受态细胞(I)挑取DHlOB单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。(2)按1:100-1 50的比例，取Iml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37°C振荡培养至菌液OD6tltl为O. 3-0.6。(3)将菌液冰浴IOmin, 4°C 4000rpm离心IOmin,收集菌体。(4)沉淀加IOml预冷的O.1M CaCl2悬浮后，冰浴30min。(5) 4°C 4000rpm离心lOmin。沉淀重悬浮于Iml预冷的O.1M CaCl2,混匀并冰水浴中保存，备用或加入15%的甘油置于-70°C中保存。1. 8 热击法转化 Ecoli DH5a(I)在无菌条件下 吸取100 μ I感受态细胞，加入1. 5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10 μ I连接产物(1. 6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。(2)在42°C恒温水浴中热激90sec (准确记时)。(3)冰浴 3_5min。(4)加入800 μ I不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37°C振荡培养45_60min。(5)短暂离心收集菌体,用150 μ I LB液体培养基重悬菌体,转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。(6)将平板于37°C正向放置15_30min至液体被吸收，倒置平板，于37°C培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。1. 9碱裂解法提取大肠杆菌质粒(I)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp (50mg/L)的固体LB平板中，37°C震荡培养12-16h ；(2) 12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；(3)加入100 μ I冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；(4)加入200 μ I溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-lOmin ；(5)加入150 μ I冰预冷的溶液III，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴 5-10min ；(6) 12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95%乙醇，混勻后，室温静置3min ；12000rpm离心3min,使质粒DNA沉淀；(7)弃尽上清，取200 μ I TE溶液溶解沉淀； (8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA ；(9) 12000rpm,离心 3min ；
(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95%乙醇，混匀后于室温静置3min, 12000rpm离心3min使质粒沉淀；(11)弃上清后用lml70%乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；(12)室温干燥后，取20 μ I含RNaseA(20 μ g/ml)的TE溶液溶解沉淀，37°C水浴30 60min 消化 RNA。(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200 μ 1，加入等体积的酚-氯仿-异戍醇，充分振荡5-10min, 12000rpm离心5min ；(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5. 3)和2倍体积的无水乙醇，混勻后_20°C放置15min, 12000rpm离心3min使质粒沉淀；(16)弃上清用lml70%乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40 μ I TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。1. 10质粒酶切验证用EcoRI酶切上述质粒,酶切反应体系如下表所示重组质粒16 μ IEcoRI限制性内切酶2μ1IOXBuffer 2 μ I将上述反应体系混匀并5000rpm离心lmin，37°C水浴反应过夜，然后进行1%的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。1. 11 DNA 测序挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp (50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果全长基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。经过NCBIblast分析，证明实验得到的就是金银花的p_香豆酰酯3’ -羟化酶基因，命名为P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H。实施例2、金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H的功能验证2.1原核表达载体的构建2.1.1目的基因的获得(I)引物设计设计一对PCR扩增带EcoRI和XhoI酶切位点的LjC3’ H基因。P2:5’-GAATTCATGGCATTCGCTCTCCTC-3’EcoRIP3:5’-CTCGAGCTAGTAATCCACTGGGACACG-3，XhoI(2) PCR 反应体系IOxPCRbuffer2μ1
MgCl2(25nimo1/L)Ι.5μ1
dNTPieach 250;.1moyL)0.2μ1
Ρ2 (4p.mo i/L)I μ !
Ρ3 (4μιτιο1/ )Ιμ
重组质粒pMD18T-^WΙμ
rTaq (TaKaRa)0.2μ1
无菌水13.1μ1(3) PCR反应条件为94°C 5min ；94°C 30sec, 60 °C 30sec, 72 °C 2min, 35 个循环；最后 72°C 延伸 7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。PCR产物电泳如图1所示。2.1. 2原核表达载体的构建步骤引入原核表达载体pET28a (购自宝生物工程有限公司)，该载体上含有中所含有EcoRI和XhoI两个酶 切位点。将带有EcoRI和XhoI酶切位点的cDNA与质粒分别进行EcoRI和XhoI的双酶切，再按照5:1的比例在T4连接酶的催化下进行连接16小时以上。反应体系及条件如下(I) cDNA酶切反应体系和条件
cDN A/EcoR 十 XhoI6μ1
AtoRiI μ I
XholΙμ
IOxH Buffer2μ137 °C 16h ；(2)质粒酶切反应体系和条件
pET2Sa 质粒6μ!
Ιμ
XholIμ
IOxH Buffer2μ137 °C 16h ；连接反应用Τ4 DNA Ligase进行，体系和条件同T载体的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，得到原核表达载体pET28a-LjC3’ H。提取阳性克隆pET28a_LjC3’ H的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。2. 2 DNA 导入大肠杆菌 BL21_Rosetta(I)在无菌条件下吸取100 μ I感受态细胞，加入1. 5ml预冷的无菌Eppendorf 管中，加入10 μ I连接产物(2.1中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。(2)在42°C恒温水浴中热激40sec (准确记时)。
(3)冰浴 3_5min。(4)加入800 μ I不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37°C振荡培养45_60min。(5)短暂离心收集菌体，用150μ I LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素卡纳的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。(6)将平板于37°C正向放置15_30min至液体被吸收，倒置平板，于37°C培养12-16hr。2.3重组子的鉴定2. 3.1菌落PCR鉴定初筛(I)平板上的菌落长到肉眼可见时。(2)将除了模板以外的其他PCR反应液组分准备好，并分装。(3)用一根灭菌牙签挑取菌落，在PCR管中测一下，放入一个灭菌的1. 5ml离心管，对PCR管和1. 5ml离心管编号。(4)PCR扩增，O. 8%琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增显现特异性条带的克隆，置于1.5ml离心管中的半截牙签扔到5mlLB培养基中，37°C震荡培养，3±1小时提取DNA，用DNA作为模板再进行PCR进一步确定。PCR反应体系及条件如下`IOxPCRbuffer2μ1
MgCl2(25 mmol/L)1.5μ1
dNTPieach 250‘umol/L)0.2μ1
Ρ2 (4μηιο丨/L)Ιμ
P3 {4fj.mol/L)Ιμ
菌液Ιμ
rTaq (TaKaRa)0.2μ1
无菌水13.1μ1PCR反应条件为94°C 5min ；94°C 30sec, 60°C 30sec, 72°C 2min, 35 个循环；最后 72°C延伸 7min。实施例3、金银花LjC3’ H蛋白诱导表达及蛋白纯化3.1目的蛋白的诱导表达含有重组表达质粒pETLjC3’H和pET28a的大肠杆菌BL21单克隆分别接入5mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基，37°C培养过夜，次日稀释100倍继续培养至0D_为O. 6时加入终浓度为 O. Smmol/I,的 IPTG(Isopropyl-beta-D-thio galactoside)，28°C诱导表达4h。离心收获细菌培养物，磷酸盐缓冲液(50mmol/L PBS，pH 7. 2)重悬，超声波冰上破碎，SDS-PAGE检测总蛋白和可溶解蛋白。3.2目的蛋白的纯化将上清过已螯合Ni2+的镍琼脂糖凝胶柱(5ml)，然后通过梯度降低尿素的浓度(使柱上的尿素浓度依次为8M/L、6M/L、4M/L、2M/L)，再用50ml的洗涤缓冲液(20mmol/LTris-HCl,pH8. 0,0. 5mol/L NaCl，30mmol/L咪唑，0. l%Triton x-100)冲洗，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L Tri s_HCl，pH8. 0，0· 5mol/L NaCl，0. 5mol/L 咪唑，0. l%Triton χ-100)洗脱，取适量洗脱液SDS-PAGE检测。检测结果如图2所示。实施例4、体外酶促反应及酶动力学分析100 μ I标准体外酶促反应体系含有600μΜ的NADPH、100 μ M香豆酰莽草酸(或香豆酰奎尼酸)、0.1M磷酸钾缓冲液(ρΗ7. 5)以及2. 0μ g的重组蛋白。上述反应体系置于30° C下30分钟后，加入终浓度为5%的乙酸终止反应，之后用250 μ I的乙酸乙酯抽提并于10，OOOg下离心10分钟。取上清真空干燥后,加入50 μ 150%(ν/ν)的甲醇水溶液。酶促产物的分析使用配备有Kromosil C18反相柱(5 μ m, 250mmX 4. 6mm;MachereyNagel)的Waters Alliance 2695高效液相色谱系统(HPLC)完成。流动相为水(A)和甲醇(B)，流速为O. 6ml min—1，使用以下梯度条件30%B 3分钟、30 - 70%B 27分钟、70 - 80%B2分钟、80 - 95%B 3分钟以及95%B 5分钟。检测波长长320nm。用相应的标准品对各种化合物进行定量。HPLC检测结果如图3所示。本研究重组蛋白动力学常数的测定是在一个底物浓度饱和的情况下，用另一个底物介于其Km的O. 2 - 6. O范围内的5个浓度值进行计算获得的。实验使用上述标准的250 μ 10.1M磷酸钾缓冲液反应体系，每个实验重复3次。常数参数的测定在其主产物的最适反应温度和最适pH条件下完成。Km和Krat值计算结果如下表
权利要求
1.一种金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H，其特征在于所述基因CDNA序列如 SEQ ID No.1 所示。
2.一种含有权利要求1所述基因LjC3’ H的原核表达载体pET28a-LjC3’ H，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.权利要求1所述金银花P-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’ H在制备绿原酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种金银花中p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H及含所述基因LjC3’H的原核表达载体，同时还公开了所述金银花p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H在制备绿原酸中的应用。实验证实将体外纯化的LjC3’H蛋白加入酶促反应体系中，能够将香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸分别催化生成绿原酸和咖啡酰莽草酸，为开发生产提高目标产物绿原酸含量提供了理论依据和实践基础。
文档编号C12N15/74GK103045621SQ20131002852
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者向凤宁, 蒲高斌, 王鹏, 周冰谦 申请人:山东大学