专利名称：一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法
技术领域：
本发明涉及动物传染病诊断，具体涉及检测绵羊肺炎支原体的PCR方法技术领域。
背景技术：
绵羊肺炎支原体可引起绵羊及山羊发生非典型肺炎。临床上以咳嗽、流鼻涕、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎为主要特征([I] Besser T E, Cassirer E F，Potter K A, etal.Association of Mycoplasma ovipneumoniae infection with population-limitingrespiratory disease in free-ranging Rocky Mountain bighorn sheep ( OvisCanadensis canadensis).J Clin Microbiol，2008，4 6:423 430.[2] ParhamKj Churchward C P，McAuliffe L，et al.A high level of strain variation withinMycoplasma ovipneumoniae population of the UK has implications for diseasediagnosis and management.Vet Microbiol，2006，118:83 90.)。目前绵羊肺炎支原体在全球范围内分布，在我国流行十分广泛，给养羊业生产造成了巨大的经济损失([3]Patel H，Mackintosh Dj Ayling RDj et al.A novel medium devoid of ruminantpeptone for high yield growth of Mycoplasma ovipneumoniae.Vet Microbiol,2008，127 (3 4):309 314.[4]王华，杨发龙，王永，汤承.四川省山羊支原体性肺炎流行病学调查，中国畜牧兽医，2011，38(1): 210-213.)。迄今为止，有关绵羊肺炎支原体的病原学诊断集中在病原的分离鉴定和聚合酶链式反应(PCR)等方面。由于支原体生长的营养需求较高，且生长较为缓慢，给病原的分离鉴定带来困难。随着现代分子生物学的飞速发展，PCR方法因其具有快速、特异、灵敏的优势，已成为检测病原的常规技术手段，但长期以来由于绵羊肺炎支原体基因序列的缺乏，目前绵羊肺炎支原体的分子检测方法只有 McAuliffe L 根据 16S rRNA 建立的 PCR 方法的报道([5] McAuliffe Lj HatchellFM，Ayling RDj et al.Detection of Mycoplasma ovipneumoni ae in Pasteurella-vaccinated sheep flocks with respiratory disease in England.Vet Recj2003，153(22):687 688.)，该方法具有较好的特异性，但在实际应用于临床样本检测时发现灵敏性不高。另外，大量研究表明绵羊肺炎支原体在核酸水平和蛋白水平均存在高度的异质性，并且其基因组中G+C含量低，因此给分子检测靶点的选择造成很大困难([6] 1nas G，Norman NGj Clarke JKj Marshall RB.A study of the heterogeneity of isolatesof Mycoplasma ovipneumoniae from sheep in New Zealand.Vet Microbiol.1991Nov;29(3-4):339-47; [7] Parham K，Churchward CPj McAuliffe Lj Nicholas RA，Ayling RD.A high level of strain variation within the Mycoplasma ovipneumoniaepopulation of the UK has implications for disease diagnosis and management.VetMicrobiol.2006 Nov 26;118(1-2):83-90.)。
热休克蛋白70 (HSP70)是一个高度保守的蛋白质，它存在于从细菌到人体的所有有机体中。本发明克隆测序了 15株绵羊肺炎支原体HSP70基因，并对其结构和序列进行了详细的生物信息学分析发现，在I 300bp和1400 1818 (1815) bp这两个区域内，绵羊肺炎支原体HSP70与其他感染羊的支原体的种间差异较大，但种内保守，GC含量较高，可作为候选的分子诊断靶点。本发明根据这两个区域的序列，自行设计5对HSP70基因序列的种属特异性引物进行试验，最终筛选出一对特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析，建立绵羊肺炎支原体的简便、快速、准确的定性测定方法。
发明内容
[要解决的技术问题]
鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的是提供一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，使之能克服现有技术的缺点。[技术方案]
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。本发明涉及一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法。该方法的步骤如下:
A.模板DNA的制备
(1)取IOOg组织进行勻衆，再把勻衆后的组织4000r/m离心5min,取上清，上清11000r/m离心30min，弃上清；若是细菌培养物，则取Iml细菌培养物于1.5ml离心管中，11000r/m离心30min,弃上清；
(2)取500μ STE悬浮沉淀，加入20μ 10% SDSUOPL 10mg/mL蛋白酶K，混匀后于56°C水浴消化1.5h ；
所述的STE提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。所述的SDS是十二烧基硫酸钠,它能与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。所述的蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。这种酶经纯化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛。(3)加入与在步骤(2)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，他们的体积比是 25:24:1,混勻，10000r/m 离心 5min ；
所述的异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。(4)离心后步骤(3)获得的溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相，吸取上层水相，加入与所述水相等体积的异戊醇-氯仿混合物，混匀后10000r/m离心3min，取上清液；
(5)往上述上清液中加入0.1倍体积的5mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，10000r/m离心3min,得到DNA沉淀；
(6)所述沉淀用70%(体积比)乙醇水溶液洗涤，10000r/m离心lmin，弃乙醇，在室温下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30μ 灭菌去离子水溶解沉淀,于_20°C保存备用；
B.PCR扩增
反应体系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，灭菌双蒸水补足至25μ ;PCR反应条件:95°C预变性5min ;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C终延伸lOmin，16°C结束反应；
取5PL PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。琼脂糖凝胶电泳图谱分析采用美国Bio-Red公司的凝胶成像系统。C.结果及判断
检测时以灭菌去离子水为模板，作为阴性对照；根据在135bp处出现预期特征条带，确定该样本中含有绵羊肺炎支原体，相反地则不含有绵羊肺炎支原体。在本发明中，所述的上下游引物分别是:
上游引物 HSP70F 为 5’ -ACAACTCCTTCTGTTGTTGCCTT-3’
下游引物 HSP70R 为 5’ -AGCACGAACAGTTTTATCGCTAC-3’
根据本发明的一种优选实施方式，所述的检测是在5V/cm的电压下进行电泳25-30min,然后用凝胶成像系统照相。[有益效果]
本发明的有益效果是:
可以在不进行绵羊肺炎支原体纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性检测样品中的绵羊肺炎支原体，整个过程对样品中绵羊肺炎支原体的检测程序简单、特异性好、检测效率高。本发明建立的方法比目前唯一报道的基于16S rRNA建立的检测绵羊肺炎支原体的PCR方法灵敏度高10倍。
图1.绵羊肺炎支原体的引物特异性验证
M: DNA Marker I ;泳道1:无模板对照；泳道2:绵羊肺炎支原体PCR扩增片段；
图2.特异性检测
M: DNA Marker I ;泳道I为阳性对照，泳道2为无模板对照，泳道3 12依次为丝状支原体丝状亚种、丝状支原体山羊亚种、牛支原体、无乳支原体、精氨酸支原体、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌及沙门氏菌。图3.绵羊肺炎支原体临床分离株PCR扩增产物
M: DNA Marker I ;泳道I 20为20株绵羊肺炎支原体临床分离株的PCR扩增片段；21泳道为阳性对照；22泳道为无模板对照；
图4.绵羊肺炎支原体临床分离株的PCR扩增产物
M: DNA Marker I ;泳道I 15为15株绵羊肺炎支原体临床分离株的PCR扩增片段；16泳道为阳性对照；17泳道为无模板对照。
图5.绵羊肺炎支原体快速检测方法的灵敏性检测
M: DNA Marker I ;泳道I为无模板对照，泳道2 11为10倍系列稀释的Y98 DNA(2.2 X IO1 2.2Χ1(Γ8 ng/μ )的 PCR 扩增片段。图6.绵羊肺炎支原体16S rRNA基因PCR方法的灵敏性检测
M: DNA Marker I ;泳道I为无模板对照，泳道2 11为10倍系列稀释的Y98 DNA(2.2 X IO1 2.2Χ1(Γ8 ng/μ )的 PCR 扩增片段。图7.绵羊肺炎支原体快速检测方法对临床样本的检测M: DNA Marker I ;泳道I为阳性对照，泳道2为无模板对照，泳道3 21为临床样本。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。主要试剂:TaqDNA 聚合酶、10 X PCR Buffer、dNTP 和 MgCl2 均购于 TaKaRa 公司；DNA Marker I购于天根生化科技有限公司；琼脂糖购于香港基因有限公司；
主要仪器:PCR仪(my cyclerTM)、凝胶成像系统(Doc 2000)、核酸电泳仪(PowerpacuniversalTM)均购于美国Bio-Rad公司；移液器购于德国Eppendorf公司。实施例1特异性检测
该实施例用建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法检测丝状支原体丝状亚种LC型 Y-goat 株(M.mycoides subsp.mycoides.LC)、丝状支原体山羊亚种 PG3 株(M.mycoides subsp.Capri )、牛支原体(M.bovis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.arginini)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、大肠杆菌013株(Escherichia coil)、金黄色葡萄球菌 SW07 株(Staphylococcus aureus)、巴氏杆菌(Pasteurella)和沙门氏菌(Salmonella),以参考菌株Y98作为阳性对照，以无模板对照为阴性对照，评价该方法的特异性。a.PCR 检测:
DNA提取方法参照[技术方案]中模板DNA的制备。以提取的DNA为模板，进行PCR检测，反应体系 25μ :1OXPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ 上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，灭菌双蒸水补足至25μ ;反应条件:95°C预变性5min ;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C终延伸lOmin，16°C结束反应；b.结果及判断:
经绵羊肺炎支原体的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验结果见图2，泳道I为阳性对照，泳道2为无模板对照，泳道3 12依次为丝状支原体丝状亚种，丝状支原体山羊亚种，牛支原体，无乳支原体，精氨酸支原体，溶血性曼氏杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，巴氏杆菌，沙门氏菌。一般认为阳性特征在135bp处出现预期扩增条带，说明此样本中含有绵羊肺炎支原体；无模板对照无特征条带。图2中阳性对照出现阳性特征，无模板对照无特征条带；丝状支原体丝状亚种LC型Y-goat株、丝状支原体山羊亚种PG3株、牛支原体、无乳支原体、精氨酸支原体、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌013株、金黄色葡萄球菌SW07株、巴氏杆菌和沙门氏菌均无特征条带，经过3次重复试验，此结果稳定一致，说明该方法特异性好。实施例2对已知阳性样本的检测
该实施例用建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法对35株已知绵羊肺炎支原体临床分离株(基于16S rRNA的PCR鉴定)进行检测，以参考菌株Y98作为阳性对照，以无模板对照为阴性对照，评价该方法对已知阳性样本的检出情况。a.PCR 检测:
DNA提取方法参照[技术方案]中模板D NA的制备。以提取的DNA为模板，进行PCR检测，反应体系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ 上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，灭菌双蒸水补足至25μ ;反应条件:95°C预变性5min ;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C终延伸lOmin，16°C结束反应；b.结果及判断:
经绵羊肺炎支原体的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验结果见图3、图4。图3中泳道I 20为20株绵羊肺炎支原体临床分离株的PCR扩增片段，泳道21为阳性对照，泳道22为无模板对照；图4中泳道I 15为15株绵羊肺炎支原体临床分离株的PCR扩增片段，16泳道为阳性对照，17泳道为无模板对照。一般认为阳性特征在135bp处出现预期扩增条带，说明此样本中含有绵羊肺炎支原体；无模板对照无特征条带。图3、图4中临床样本检测结果与预期结果一致，具有阳性特征，无模板对照无特征条带，说明该方法对已知阳性样本的检出率为100%，通用性好。实施例3绵羊肺炎支原体快速检测方法的敏感性评价
该实施例将参考菌株Y98进行10倍系列稀释后，分别用本发明建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法与目前唯——种由McAuliffe L根据16S rRNA建立的PCR方法进行比较，评价本发明建立的方法的敏感性。a.PCR 检测:
DNA提取方法参照[技术方案]中模板DNA的制备。用核酸蛋白检测仪测得参考菌株Y98 DNA的浓度为220 ng/^L，将其进行10倍系列稀释(2.2 X IO1 2.2X 1(Γ8 ng/μυ，分别按照本发明建立的PCR反应体系和反应条件及McAuliffe L建立的方法进行扩增。b.结果及判断: 经本发明建立的绵羊肺炎支原体快速定性检测方法进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果见图5, M为DNA Marker I ,泳道I为无模板对照，泳道2 11为十倍系列稀释的Y98 DNA (2.2X IO1 2.2X 1(T8 ng/^L)的PCR扩增产物。由图5可知，该方法的最低检测限为4.4X 1(Γ3 ng/反应。经McAuliffe L根据16S rRNA建立的PCR方法扩增的结果见图6，M为DNAMarker I，泳道I为无模板对照，泳道2 11为10倍系列稀释的Y98 DNA (2.2X IO1
2.2X10_8 ng/μυ的PCR扩增产物。由图6可知，该方法的最低检测限为4.4 X 10_2 ng/反应。由此可见，本发明建立的绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法比McAuliffe L建立的PCR方法的灵敏度高10倍。实施例4对临床样本的检测
该实施例用建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法对来自四川地区的19份疑似感染绵羊肺炎支原体的羊肺脏组织样本进行检测。a.PCR 检测:
羊肺脏组织DNA提取方法参照[技术方案]中模板DNA的制备。以提取到的DNA为模板，按照本发明建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法的反应条件和反应体系进行PCR扩
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>曰οb.结果及分析:
经本发明建立的绵羊肺炎支原体快速定性检测方法进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果见图7。由图7可知，19份疑似感染绵羊肺炎支原体的临床样本中有9份为绵羊肺炎支原体阳性，说明该方法可通过对临床病料的快速检测用于疑似病例的快速诊断。实施例5本发明的方法与现有方法对临床样本检出率的比较
该实施例分别用本发明建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法与目前唯一一种由McAuliffe L根据16S rRNA建立的PCR方法对来自四川地区的疑似感染绵羊肺炎支原体的56份羊鼻腔棉拭子样本进行检测，比较这两种方法对临床样本的检出率。a.PCR 检测:
DNA提取方法参照[技术方案]中模板DNA的制备。以提取到的DNA为模板，分别按照本发明建立的方法及McAuliffe L建立的方法进行PCR扩增。b.结果及分析 本发明建立的绵羊肺炎支原体快速检测方法对56份鼻腔棉拭子样本中绵羊肺炎支原体的检出率为11/56，而McAuliffe L建立的方法对这56份鼻腔棉拭子样本中绵羊肺炎支原体的检出率为9/56，可见本发明建立的方法比目前唯一报道的基于16S rRNA建立的检测绵羊肺炎支原体的PCR方法检出率高，因此更适用于临床检测。
权利要求
1.一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于该方法的步骤如下: A.模板DNA的制备 (1)取IOOg组织进行勻衆，再把勻衆后的组织4000r/m离心5min,取上清，上清11000r/m离心30min，弃上清；若是细菌培养物，则取Iml细菌培养物于1.5ml离心管中，11000r/m离心30min,弃上清； (2)取500μ STE悬浮沉淀，加入20μ 10% SDSUOPL 10mg/mL蛋白酶K，混匀后于56°C水浴消化1.5h ； (3)加入与在步骤(2)得到的 溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，他们的体积比是 25:24:1,混勻，10000r/m 离心 5min ； (4)离心后步骤(3)获得的溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相，吸取上层水相，加入与所述水相等体积的异戊醇-氯仿混合物，混匀后10000r/m离心3min，取上清液； (5)往上述上清液中加入0.1倍体积的5mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，10000r/m离心3min,得到DNA沉淀； (6)所述沉淀用70%(体积比)乙醇水溶液洗涤，10000r/m离心lmin，弃乙醇，在室温下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30μ 灭菌去离子水溶解沉淀,于_20°C保存备用； B.PCR扩增反应体系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ , 10μΜ上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，灭菌双蒸水补足至25μ ;PCR反应条件:95°C预变性5min ;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C终延伸10min，16°C结束反应；取5μ PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用凝胶成像系统进行电泳图谱分析。
2.根据权利要求1所述一种绵 羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于结果及判断为:检测时以灭菌去离子水为模板，作为阴性对照；根据在135bp处出现预期特征条带，确定该样本中含有绵羊肺炎支原体，相反地则不含有绵羊肺炎支原体。
3.根据权利要求1所述一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于:所述上游引物HSP70F序列为5’ -ACAACTCCTTCTGTTGTTGCCTT-3’，所述下游引物HSP70R序列为5’ -AGCACGAACAGTTTTATCGCTAC-3’。
全文摘要
本发明公开了一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法。该方法采用自行设计的绵羊肺炎支原体热休克蛋白70(HSP70)基因序列的种属特异性引物，进行种属特异性PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析，建立绵羊肺炎支原体的简便、快速、准确的定性检测方法。本发明可用于绵羊肺炎支原体的快速诊断，具有特异性强、重复性好、灵敏度高和易于标准化的优点。
文档编号C12Q1/04GK103103273SQ20131002895
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者岳华, 汤承, 杨发龙 申请人:西南民族大学