利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法

利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法
【专利摘要】本发明适用于酵母筛选【技术领域】，提供了一种利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，包括：选取产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物和重金属含量高的重金属污染区能源作物；将重金属污染区能源作物提取总糖；以该总糖为原料配制成酵母培养液；利用重金属含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对酵母菌进行筛选，选取3-6株重金属耐受性高的酵母菌株；利用产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对重金属耐受性高的酵母菌株进一步筛选，获得最优酵母。本发明还提供一种利用本发明的酵母筛选方法得到的酵母生产乙醇的方法。
【专利说明】利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酵母筛选【技术领域】，尤其涉及一种利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法和生物乙醇的制备方法。
【背景技术】
[0002]能源和人类的活动息息相关，没有了能源，人类社会的发展就无从谈起，现代社会文明就无法继续。生物燃料乙醇作为一种可再生的新型能源，因为无污染、用途广，其重要性日益凸显。目前，我国普遍采用木薯、甘蔗、甜高粱、农作物秸杆等非粮作物生产燃料乙醇，其中，甘蔗和木薯是经济效益最显著的非粮经济作物。发展以甘蔗和木薯等能源作物作为原料生产乙醇，可以缓解“能源与人争粮”的现象，但不可忽略的是，存在着“能源与粮争地”的局面。
[0003]我国目前矿区累计破坏的土地面积达500万公顷，复垦率仅为12%，受矿山污染的耕地面积达2000万公顷，约占耕地面积的1/6。这些土壤不适于种植粮食作物，但经改良后种植非食用性的能源作物——能源甘蔗、能源木薯、能源薯蓣却有极大的可行性。大面积存在的矿区重金属污染土壤和边缘化土壤，为发展燃料乙醇等生物质能源提供了大量可利用的土地资源。对矿区重金属污染土壤合理利用，是打破“能源与粮争地”局面最有效的措施。
[0004]酵母菌种是乙醇发酵的核心所在，因此酵母菌种的筛选研究就尤其重要，目前对酵母菌的筛选方法有:
[0005](I)诱变筛选法。这是通过传统诱变技术处理酵母的原始菌株，对诱变后的菌株进行筛选目的菌株。
[0006](2)细胞融合法。主要是利用原生质体融合技术，该技术可克服细胞壁的天然屏障，排除接合型的限制，实现多基因重组，并且可以直接采用生产性能好的菌株作为亲株。原生质体融合技术是国内外选育优良酵母比较常用的研究方法，如日本三井造船株式会社选育酵母菌株AM12。
[0007](3)基因工程技术。目前，该技术成为世界研究的热点，主要包括基因工程改造法，外源基因导入构建工程菌，基因敲除技术等。袁振宏等(2006)采用基因导入的方法，将树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶基因xyl2,及休哈塔假丝酵母(CandidaShehatae)木糖还原酶基因xyll转入酿酒酵母(S.cerevisiae),构建成木糖发酵的酿酒酵母重组工程菌。史文慧等(2002)和赵丽娟等(2005)通过基因敲除技术，使酵母ADH2基因失活，不利用乙醇做碳源，提高乙醇利用率。
[0008]上述酵母筛选方法均利用复杂的技术和设备实现，操作成本高，因此开发简便易行的且具有针对性的酵母筛选方法将有重要意义。

【发明内容】

[0009]本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种生物乙醇的制备方法。
[0011]为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下:
[0012]选取产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物和重金属含量高的重金属污染区能源作物；
[0013]利用该重金属污染区能源作物提取总糖；
[0014]以提取的总糖为原料配制成酵母培养液；
[0015]利用重金属含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对待筛选的酵母菌进行重金属耐受性筛选，选取3-6株重金属耐受性高的酵母菌株；
[0016]利用产量、总 糖含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对重金属耐受性高的酵母菌株进一步筛选，选取发酵效率最高的酵母菌种，该发酵效率通过发酵液中糖转化率和乙醇含量体现。
[0017]以及，一种生物乙醇的制备方法，包括采用酵母对重金属污染区能源作物发酵获取乙醇的步骤，其中，所述酵母是经上述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法获得。
[0018]本发明的筛选酵母方法利用生长于重金属污染区的能源作物对酵母菌进行筛选，该方法充分利用了生长于重金属污染区的能源作物，该方法筛选出的酵母菌可将作物中的糖分充分转化为乙醇，有利于恢复重金属污染土地的生态恢复并促进燃料乙醇的生产，该筛选方法操作简便，成本低，针对性强。
[0019]本发明的生物乙醇的制备方法，能充分利用重金属污染区作物，且其中使用的酵母具有较强针对性，该制备方法具有高的乙醇转化率，实现了资源的优化配置。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021]本发明实施例提供一种利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，包括以下步骤:
[0022](I)选取产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物和重金属含量高的重金属污染区能源作物；
[0023](2)利用步骤(I)的所述两类重金属污染区能源作物提取总糖；
[0024](3)以提取的所述总糖为原料配制成酵母培养液；
[0025](4)利用步骤所述重金属含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对待筛选的酵母菌进行重金属耐受性筛选，选取3-6株重金属耐受性高的酵母菌株；
[0026](5)利用所述产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对步骤(4)中筛选出的重金属耐受性高的酵母菌株进一步筛选，选取发酵效率最高的酵母菌种，所述发酵效率通过发酵液中糖转化率和乙醇含量体现。
[0027]具体地，在步骤(I)中的重金属污染区可以为矿山污染土壤，也可以为边际化土壤，该能源作物为甘蔗、木薯或薯蓣。
[0028]在步骤(I)中，当能源作物为甘蔗时，甘蔗选取的方法如下:[0029]用游标卡尺和直尺量取甘蔗植株的直径和株高；提取甘蔗汁，采用锤度计直接测定甘蔗汁锤度，采用旋光仪测定经澄清过滤后的蔗汁的转光度；上述指标为甘蔗的生理指标，可以用来衡量甘蔗的产量。同时利用DNS还原法测定甘蔗汁中总糖含量。采用现有重金属含量测定方法测定蔗渣和蔗汁中总重金属含量，测量的该重金属为锌(Zn)、铜(Cu)、镉(Cd)、铅(Pb)。
[0030]当能源作物为木薯或薯蓣时，其选取的方法如下:
[0031]测量木薯或薯蓣的块茎重量；在将木薯或薯蓣液化糖化后用DNS法测量总糖。DNS即二硝基水杨酸，该测量方法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖(如纤维素、半纤维素和淀粉等)水解产生的多种还原糖体系中。采用现有重金属含量测定方法测定木薯或薯蓣块茎中总重金属含量，测量的该重金属为锌(Zn)、铜(Cu)、镉(Cd)、铅(Pb)。
[0032]在所述能源作物为甘蔗时，步骤(2)中提取总糖的方法为取甘蔗榨汁，总糖包含于该甘蔗汁中；在所述能源作物为木薯或薯蓣时，取木薯或薯蓣的块茎粉碎，加入水中高温糊化，然后加入糖化酶糖化，所得溶液含有总糖。
[0033]在步骤(3)中，当该重金属污染区能源作物为甘蔗时，该酵母培养液的配制方法为:提取后的甘蔗汁为含有总糖的溶液，向该甘蔗汁中加入其体积0.1-0.2%的尿素，用磷酸把pH调至3.3-3.6，90°C灭菌1-1.5h。
[0034]当该重金属污染区能源作物为木薯或薯蓣时，该酵母培养液的配制方法为:将木薯或薯蓣淀粉液化糖化，制得含有总糖的溶液，向该溶液中加入0.25-0.5%的尿素，用磷酸把 pH 调至 4.5-5.0，90°C灭菌 `1-1.5h。
[0035]在步骤(4)中的酵母菌重金属耐受性试验为选取5株以上的工业酵母菌，该酵母可应用任何适用于发酵的菌株，在具体实施例中可使用薛瓦酵母(S.chevalieri)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、威尔酵母(S.wiIIianus)等，但不限于上述酵母。以步骤(I)中的重金属含量最高的作物提取的总糖提取物进行培养筛选，该总糖提取物中含有锌(Zn)、铜(Cu)、镉(Cd)、铅(Pb)等重金属，通过糖转化率和乙醇产量选取耐受性高的3-5株菌株。
[0036]该步骤(4)中，将筛选得到的耐受性高的3-5酵母菌株分别接种至酵母培养液中的接种量为5-10%，优选的接种量为10%。
[0037]本发明的筛选酵母方法利用生长于重金属污染区的能源作物对酵母菌进行筛选，该方法充分利用了生长于重金属污染区的能源作物，该方法筛选出的酵母菌可将作物中的糖分充分转化为乙醇，有利于恢复重金属污染土地的生态恢复并促进燃料乙醇的生产，该筛选方法操作简便，成本低，针对性强。
[0038]本发明实施例还提供了一种生物乙醇的制备方法，包括提取能源作物的总糖获得溶液，向该溶液中加入酵母进行发酵，获得乙醇，其中，所述酵母是经上文所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法获得。
[0039]本发明实施例的生物乙醇的制备方法，能充分利用重金属污染区作物，且其中使用的酵母具有较强针对性，该制备方法具有高的乙醇转化率，实现了资源的优化配置。[0040]以下结合具体实施例对本发明进行详细描述。
[0041]实施例1甘蔗相关指标检测
[0042]1.植株产量及含糖量检测
[0043]在矿山污染土壤中，种植耐受重金属、高光合量和高生物量的甘蔗品种。种植一年后计算五米行长甘蔗数及10株甘蔗重量，分别用游标卡尺和直尺量取甘蔗样品的直径和株高，每个样品取十个重复。以此分析比较甘蔗产量。
[0044]采用锤度计直接测定蔗汁锤度；采用旋光仪测定经澄清过滤后的蔗汁的转光度；采用分光光度法测定蔗汁糖分:在酸性介质中，蔗糖将磷钥黄还原成磷钥蓝，磷钥蓝最大吸收波长为820nm，利用比色法可测定甘蔗中的蔗糖含量；利用还原糖与DNS的显色反应在520nm测定吸光值，由还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定甘蔗中的还原 糖含糖量。
[0045]2.蔗汁重金属含量测定
[0046]取200mL烧杯，经稀硝酸浸泡过夜，并用双蒸水冲洗干净,量取甘蔗汁样品IOmL加入该烧杯中。加入硝酸30mL，混合均匀，盖上表面皿，过夜。在通风橱中，往烧杯中加入IOmL高氯酸，然后放在电热板上加热，110°C，煮到澄清透明直到剩余f2mL，冷却，加水定容到50mL。以原子吸收分光光度计(YXF-1201型)上分别检测溶液中锌(Zn)、铜(Cu)、镉(Cd)、铅(Pb)的含量。
[0047]3.蔗渣重金属含量测定
[0048]准确称取1.0Og磨碎甘蔗样品于瓷坩埚中加热，先在电炉上炭化完全后，放入马福炉内(600°C)灰化(6h)。冷却后取出，加入5mL2mol/L的HCl溶液溶解，然后转移至50mL容量瓶中，用去离子水(或双蒸水)冲洗坩埚，将洗液转移至该容量瓶中，然后定容至50mL。用定量滤纸过滤后，取滤液在原子吸收分光光度计(YXF-1201型)上分别检测溶液中锌(Zn) JIf(Cu)Jg(Cd)Jg(Pb)的含量。
[0049]4.甘蔗汁总糖的测定
[0050]取甘蔗汁样品5mL加入锥形瓶中，再向锥形瓶中加入6mol/L HCl溶液15mL，置沸水浴中加热30min，冷却后用NaOH溶液调节pH值至中性。加去离子水定容至50mL，然后过滤。吸取ImL滤液，加去离子水定容至50mL，得稀释溶液，备用。
[0051]取上述稀释溶液0.5mL加入试管中，再加入二硝基水杨酸(DNS)溶液0.5mL,该浓度为本领域技术人员熟知，在沸水浴中加热5min，冷却后再加入蒸馏水4mL。将混合均匀，用制作标准曲线的空白管(I号管)溶液调零点，测定它们在540nm的吸光值，从标准曲线上查出其相应的含糖量(μ g)。标准曲线制作过程为本领域技术人员熟知，在此不再赘述。
[0052]5.测量结果
[0053]测量结果如表1-4所示。
[0054]表1:不同甘鹿品种的产量
【权利要求】
1.一种利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，包括以下步骤: 选取产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物和重金属含量高的重金属污染区能源作物； 利用所述重金属污染区能源作物提取总糖； 以提取的所述总糖为原料配制成酵母培养液； 利用所述重金属含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对待筛选的酵母菌进行重金属耐受性筛选，选取3-6株重金属耐受性高的酵母菌株； 利用所述产量、总糖含量高的重金属污染区能源作物对应的酵母培养液对所述重金属耐受性高的酵母菌株进一步筛选，选取发酵效率最高的酵母菌种，所述发酵效率通过发酵液中糖转化率和乙醇含量体现。
2.如权利要求1所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，其特征在于，所述耐受性高的酵母菌株分别接种至所述酵母培养液中的接种量为5%-10%。
3.如权利要求1所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，其特征在于，所述重金属污染区能源作物为甘蔗、木薯或薯蓣。
4.如权利要求3所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，其特征在于，所述重金属污染区能源作物为甘蔗，所述酵母培养液的配制方法:向含有所述总糖的甘蔗汁中加入所述甘蔗汁0.1-0.2%的尿素，并将pH调至3.3-3.6，90°C灭菌1-1.5h。
5.如权利要求3所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，其特征在于，所述重金属污染区能源作物为木薯或薯蓣，所述酵母培养液的配制方法:将所述木薯或薯蓣的总糖提取物糖化，再向糖化后的溶液中加入所述溶液0.25-0.5%的尿素，并将pH调至4.5-5.00
6.如权利要求1所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，其特征在于，所述重金属耐受性试验中的重金属为锌、铜、镉和铅。
7.如权利要求1所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法，其特征在于，所述重金属污染区为矿山污染土壤区或边际化土壤区。
8.—种生物乙醇的制备方法，其特征在于，包括采用酵母对重金属污染区能源作物发酵获取乙醇的步骤，其中，所述酵母是经权利要求1-7中任一项所述的利用重金属污染区能源作物筛选酵母方法获得。
【文档编号】C12N1/16GK103451143SQ201310041520
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2013年2月1日
【发明者】朱睿, 谢君, 刘艳霖 申请人:深圳信息职业技术学院