专利名称：一种快速简便富集微量动物组织线粒体dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法。
背景技术：
二十世纪中叶，随着DNA双螺旋模型的揭示和生物遗传密码的破解，生物学研究逐渐进入分子水平，加上核酸序列测定以及聚合酶链式反应(PCR)技术的发明和日趋成熟，基于DNA片段的扩增和序列分析的分子鉴定方法越来越受到人们的重视。线粒体DNA作为一种核基因组外的遗传信息携带者，由于其拷贝数量大、进化速度快、没有同源重组、分子结构稳定等特性受到分子鉴定学家们的青睐，特别适合于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等方面。传统的线粒体DNA富集方法主要是依靠分级超速离心先分离出线粒体，再针对线粒体提取DNA，不仅样品需求量大且过程繁琐。目前最常用的方法是利用CTAB或者SDS法同时提取细胞核DNA和线粒体DNA，利用线粒体特异性引物扩增目的片段(如动物条形码标签coxl)，然而动物组织样品预处理中常常用到蛋白酶K消化很费时；此外硅胶膜离心柱法也是目前常用的商品化方法，缺点在于成本太高，不适合大规模样品的分析。
发明内容
本发明目的是提供一种线粒体DNA富集方法，起始组织用量少(最低可为10mg)，富集出的DNA可以作为后续PCR扩增分析的可靠模板。本发明采用的技术方案是:一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法包括:(I)取动物组织样品(最低10mg)，加入适量提取缓冲液，置于1.5mL离心管中，漩涡振荡器混合lmin，得混合液A ;所述裂解缓冲液为本领域常规用于组织提取的缓冲液；如果是较硬的动物组织如表皮、肌肉等，则需尽可能切成小块，置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，再置于离心管中进行提取；如果较软的组织如幼虫、胚胎、肝脏、神经等，则不需要进行研磨；(2)混合液A加入2倍体积碱性裂解液，颠倒混合30SeC，冰浴5min，得混合液B ；所述裂解缓冲液为本领域常规用于组织裂解的碱性裂解液；(3)混合液B加入1/2体积的3M醋酸钾溶液,颠倒混合30sec,冰浴IOmin,得混合液C ;(4)混合液C加入终浓度25 u g/mL的RNase A，37°C温浴Ihr后自然冷却至室温，12000 Xg以上离心10 15min,取上清液I移至新的1.5mL离心管；(5)上清液I中加入等体积的苯酚(pH8.0)，室温混匀5 lOmin，12000Xg以上离心10 15min,取上清液2移至新的1.5mL离心管；(6)上清液2中加入等体积的苯酚/氯仿体积比1:1的混合液，室温混匀5 IOmin, 12000 Xg以上离心10 15min,取上清液3移至新的1.5mL离心管；(7)上清液3中加入等体积的氯仿,室温混勻5 IOmin, 12000 Xg以上离心10 15min，取上清液4移至新的1.5mL离心管；(8)上清液4中加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀，_20°C放置30min沉淀DNA，取沉淀即为富集的线粒体DNA，溶于适量样品溶解液，_20°C保存备用。所述样品溶解液为本领域常规用于DNA保存的溶解液。步骤(I)中所述提取缓冲液组成如下:0.1M NaCl,lmM EDTA, IOmM Tris-Cl，溶剂为水，ρΗ8.0。步骤(2)中所述碱性裂解液组成如下:1%SDS，0.2M NaOH，溶剂为水。步骤(8)中样品溶解液IOmM Tris-Cl，溶剂为水，pH8.5。在对于微量动物样品的分子鉴定分析过程中，可采用上述方法富集线粒体DNA，再按照下述方法进行进一步分析:(A)动物条形码标签coxl分析:利用动物coxl通用引物LC01490 (序列5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和 HC02198 (序列 5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，)，建立以下 PCR 反应体系(25 μ L):10mM Tris-Cl (ρΗ9.0), 50mM 氯化钾，1.5mM 氯化镁，0.l%TritonX-100, 四种 dNTP 各 200 μ M，两种引物各 0.4 μ Μ, 1.25U Taq DNA 聚合酶，并加入0.5 μ L上述方法制备的DNA模板。PCR反应条件为:94°C 5min, 38次循环(94°C 30sec,45°C 30sec,72°C 45sec),72°C IOmin0 所有 PCR 反应均在 Whatman-Biometra TGradient 基因扩增仪上进行。扩增获得的PCR产物按常规方法电泳检测、割胶回收、连接转化和序列测定。(B)动物线粒体16S rRNA基因片段分析:利用动物线粒体16S rRNA基因通用引物16Sar (序列 5，-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3，)和 16Sbr (5，-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3，)，建立以下PCR反应体系(25yL):10mM Tris-Cl (pH9.0)，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，
0.l%TritonX-100,四种 dNTP 各 200 μ M，两种引物各 0.4 μ Μ, 1.25U Taq DNA 聚合酶，并加入0.5 μ L上述方法制备的DNA模板。PCR反应条件为:94°C 5min, 38次循环(94°C 30sec,45°C 30sec,72°C 45sec),72°C IOmin0 所有 PCR 反应均在 Whatman-Biometra TGradient 基因扩增仪上进行。扩增获得的PCR产物按常规方法电泳检测、割胶回收、连接转化和序列测定。线粒体DNA CmtDNA)呈双链环状，在动物中大小一般在15kb 18kb之内。本发明以罗氏沼虾(较硬的动物组织)和中华卤虫(较软的动物组织)为例，验证了本发明方法的可行性，因此本发明方法可适用于毫克级的各种动物来源样品，尤其适用于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等。本发明涉及的线粒体DNA富集方法，优点在于快速简便，无需费时的蛋白酶处理过程，且起始组织用量少(最低10mg)，富集出的DNA可以直接作为后续利用PCR扩增进行分子鉴定的可靠模板，可用于小型鉴定实验室的微量动物样品预处理。相比较其他同类方法，简便易行，实验耗时短，成本低廉，设备要求低。
图1为罗氏沼虾条形码标签coxl和16S rRNA基因片段的扩增电泳图；1、2分别为coxl和16S rRNA基因片段，M为IOObp分子量marker ；电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶，100V ；
图2为中华卤虫条形码标签coxl的扩增电泳图；1、2分别为两雌性个体，3、4分别为两雄性个体的coxl基因片段；电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶，IOOV ；图3为中华卤虫16S rRNA基因片段的扩增电泳图；1、2分别为两雌性个体，3、4分别为两雄性个体的16S rRNA基因片段；电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶，100V。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:罗氏沼虾肌肉组织动物条形码标签coxl和线粒体16S rRNA基因片段分析1.取一小块罗氏沼虾尾部肌肉，置于液氮中研磨至粉末状，取大约20mg组织样品粉末加入100 μ L提取缓冲液，漩涡振荡器混合Imin ；2.混合液中加入200 μ L碱性裂解液,颠倒混合30sec,冰浴5min ；3.混合液中加入 150 μ L3M醋酸钾溶液,颠倒混合30sec,冰浴IOmin ；4.混合液中加入0.45 μ L25mg/mL RNase A(生工生物工程有限公司，货号R0675)，37°C温浴lhr，自然冷却至室温，12000 Xg离心lOmin，上清液移至新的1.5mL离心管；5.上清液中加入等体积的苯酹(pH8.0),室温混勻5min, 12000Xg离心IOmin,上清液移至新的1.5mL离心管；6.上清液中加入等体积的苯酚/氯仿混合液(体积比1:1)，室温混匀5min，12000 Xg离心IOmin,上清液移至新的1.5mL离心管；7.上清液中加入等体积的氯仿,室温混勻5min, 12000 Xg离心IOmin,上清液移至新的1.5mL离心管；8.上清液中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，混匀，_20°C放置30min沉淀DNA, 12000 X g离心IOmin,弃去上清液；9.沉淀中加入500 μ L75%乙醇洗漆5min, 12000X g离心5min,弃去上清液；10.沉淀开盖置于空气中干燥15min，溶于30 μ L样品溶解液，_20°C保存备用；11.取0.5yL上述DNA模板，利用动物coxl通用引物LC01490和HC02198，建立 25 μ L PCR 反应体系:IOmM Tris-Cl (ρΗ9.0)，50mM 氯化钾，1.5mM 氯化镁，0.l%TritonX-100，四种dNTP各200μΜ，两种引物各0.4yM，1.25U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为:94°C 5min，38 次循环(94°C 30sec,45°C 30sec,72°C 45sec),72°C IOmin0 所有 PCR 反应均在Whatman-Biometra TGradient基因扩增仪上进行。扩增获得的PCR产物按常规方法电泳检测、割胶回收、连接转化和序列测定，结果参见图1和SEQ ID N0.1。SEQ ID N0.1为罗氏沼虾coxl核苷酸序列(长度709bp，引物位置用下划线标出):GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAACACTATATTTTATCTTCGGAG CGTGAGCAGGCATGGTAGGTACGTCACTAAGACTCTTAATTCGAGC AGAATTAGGGCAGCCGGGCAGACTGATCGGAAATGACCAAATCTAC AACGTAATTGTCACTGCCCACGCATTCGTAATAATTTTTTTCATGGTT ATACCGATCATAATTGGTGGTTTCGGTAATTGACTAGTACCCCTAATA TCAGGGGCCCCAGACATAGCATTCCCACGCATAAACAACATAAGATT CTGACTCCTACCCCCATCTCTAACACTTCTTCTCTCCAGAGGAATAG TAGAAAGAGGGGTTGGCACAGGATGAACTGTTTATCCACCACTAGC GGCCGGTACCGCCCACGCCGGGGCATCGGTAGATCTAGGTATTTTTT CCCTCCACCTAGCAGGAGTTTCTTCAATCTTAGGGGCTGTCAACTTT ATTACCACAGTGATTAACATACGAGCCCCAGGAATAACTATAGATCG ACTGCCCCTATTCGTATGAGCCGTATTTCTAACAGCCATCCTGCTTCT TCTCTCACTACCAGTTTTAGCCGGAGCCATTACCATACTCTTAACTGA TCGAAACCTAAATACATCCTTTTTCGACCCAGCGGGAGGAGGGGAC CCTATTCTCTACCAACACTTATTTTGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTT TA ；12.取0.5 μ L上述DNA模板，利用动物线粒体16S rRNA基因通用引物16Sar和16Sbr，采用与coxl相同的反应体系和反应条件，扩增获得的PCR产物按常规方法电泳检测、割胶回收、连接转化和序列测定，结果参见图1和SEQ ID N0.2。SEQ ID N0.2为罗氏沼虾16S rRNA序列(长度551bp，引物位置用下划线标出): CGCCTGTTTATCAAAAACATGTCCTGTGTGAATTAGTTATAAAGTCTA GCCTGCCCACTGATTTATTTAAAGGGCCGCGGTAATTTGACCGTGCG AAGGTAGCATAGTCAGTAGTCTTTTAATTGGAGGCTTGAATGAATGG TTGGACGAGGGATAAGCTGTCTCCTTAGCGGCGTTTGAATTTAACTT TTGAGTGAAAAGGCTCAAATTGTTTAGGGGGACGATAAGACCCTAT AAAACTTAATATAATTTAGGCTTAACTTGCGATGTGGGTGAAAAGTA GTTTTGTCTGGTTTATATTTCGTTGGGGAGATGAAGATATAATGAGTA ACTGTCTATAAAATTTTATAGCATTGACTAGAATTTGATCCTTCCTTG GGGATTAGGAGAATAAGTTACTTTAGGGATAACAGCGTGATTTTCTT TGAGAGTTCTTATCGACAAGAGTAGTTGCGACCTCGATGTTGAATTA AAATTTCAGCTAGGTGTAGCCGTTTAGCTGGTGGGTCTGTTCGACCT TTAAAATTTTACGTGATCTGAGTTCAGACCGG ；由以上结果可见:利用本方法富集的线粒体DNA模板，扩增得到的罗氏沼虾条形码标签coxl和线粒体16S rRNA片段，条带特异单一，大小正确，经两端测序后得到的序列与GenBank报道的罗氏沼虾线粒体全基因组(索引号NC_006880)比对一致。说明了本方法可成功应用于肌肉等较硬的动物组织，富集获得的DNA模板质量较高，实验重复性好，可以可靠地用于各种基于PCR的分子分析鉴定(如个体差异、种群分析等)。实施例2:中华卤虫个体条形码标签coxl和线粒体16S rRNA基因片段分析1.取4只中华卤虫成体(2只雌虫和2只雄虫)，置于1.5mL离心管中，称重(20 30mg)，加入100 μ L提取缓冲液，在冰上用微量研磨棒磨至均匀，漩涡振荡器混合Imin ；2.各管按照实施例1步骤2 12进行线粒体DNA富集、片段扩增以及序列分析，结果参见图2 图3和SEQ ID N0.3 4。SEQ ID N0.3为中华卤虫coxl序列(长度709bp，引物位置用下划线标出):GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGACTTTATACTTTATTTTTGGAG CTTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCTTTAAGTATACTTATTCGAGCG GAATTAGGTCAACCTGGCTCCCTAATTGGAGATGAACAGGTATATAA TGTTATTGTAACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTCATAGTTATG CCTATCCTCATTGGAGGGTTTGGTAACTGATTAGTACCTATTATACTA GGAGCTCCTGATATGGCTTTTCCCCGCTTAAACAATTTAAGATTTTG AATACTTCCACCTTCTTTAACTCTCCTTTTAGCTAGATCTATAGTTGA AGGAGGGGCCGGAACCGGATGAGCAGTTTATCCCCCTCTTTCTTCC GCCATTGCCCATGCTGGACCTTCAGTAGACTTAGCCATTTTCTCTCT CCACTTAGCCGGGGTTTCCTCAATTCTGGGAGCTGTAAACTTTATTA CTACTATTATTAATATACGGCCTCAGTCAATATCTATTGATCGCATACC TCTATTAGTCTGGGCGGTAGGAATTACAGCCGTTCTTTTACTTCTATC CCTTCCGGTCCTAGCAGGTGCCATTACTATACTCTTAACTGACCGTA ACTTAAACACCTCCTTTTTTGATCCCGCGGGTGGGGGGGATCCAATT CTCTACCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTA ；SEQ ID N0.4为中华卤虫16S rRNA序列(长度537bp，引物位置用下划线标出):CGCCTGTTTATCAAAAACATCGCTTCCTAATTCTAGGAGGTCGGGCC TGCCCACTGATTAATTAAAGGGCCGTGGTATACTGACCATGCGAAGG TAGCATAATCATTAGCCTCTTGATTGGGGGCTAGAATGAATGGTCTG ACGAGAGGCAGCCTGTCTCCCTTACTAAATTGAACTTAATCTTTAAG TGAAAAAGCTTAAATATTCTTGGAGGACGATAAGACCCTATAGATCT TCACATTCATCTCTTTTACCTAACGGTAGGTAAACGGGCAAAAGAA AAGAATGTTTGGTTGGGGCGACAATAAGAGTAGAATAAACACTTAA GAATATGTGCACACAAATAAGTGACCATTGATCCTTAGATGAGTATA GAACAAGTTACCTTAGGGATAACAGCGTAATTCTTTTTGAGAGTCCA AATCGACAAAAGAGTTTGCGACCTCGATGTTGGTTCAGGGACCCTA TTTGGTGCAGCAGCTTAGTTAGGTAGTCTGTTCGACTATTAAATCCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGG ； 由以上结果可知:利用本方法富集的线粒体DNA模板，扩增得到的中华卤虫条形码标签coxl和线粒体16S rRNA片段,条带特异单一，大小正确。经测序分析发现来自四个不同的个体的两种片段均完全相同，体现了该物种种内差异极小，方法可重复性较高。获得的序列经同源比对发现与数据库里已报道的中华卤虫序列具有高度相似性(>99%，如GenBank索引号DQ119648的coxl序列和FJ007818的16S rRNA序列等)。这说明了本方法可成功应用于水生浮游动物成体等较软的动物组织，富集获得的DNA模板质量较高，实验重复性好， 可以可靠地用于各种基于PCR的分子分析鉴定(如个体差异、种群分析等)。
权利要求
1.一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法包括: (1)取动物组织样品，加入适量裂解缓冲液，置于1.5mL离心管中，漩涡振荡器混合Imin,得混合液A ；(2)混合液A加入2倍体积碱性裂解液，颠倒混合30sec，冰浴5min，得混合液B； (3)混合液B加入1/2体积的3M醋酸钾溶液，颠倒混合30sec，冰浴lOmin，得混合液C； (4)混合液C加入终浓度25iig/mL的RNase A，37°C温浴Ihr后自然冷却至室温，12000 Xg以上离心10 15min,取上清液I移至新的1.5mL离心管； (5)上清液I中加入等体积的苯酚，室温混匀5 10min，12000Xg以上离心10 15min，取上清液2移至新的1.5mL离心管； (6)上清液2中加入等体积的苯酹/氯仿体积比1:1的混合液,室温混勻5 IOmin,12000 Xg以上离心10 15min,取上清液3移至新的1.5mL离心管； (7)上清液3中加入等体积的氯仿，室温混勻5 IOmin,12000Xg以上离心10 15min，取上清液4移至新的1.5mL离心管； (8 )上清液4中加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀，-20 V放置30min沉淀DNA，取沉淀即为富集的线粒体DNA，溶于适量样品溶解液，_20°C保存备用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述提取缓冲液组成如下:0.1MNaCl, ImM EDTA, IOmM Tris-Cl，溶剂为水，pH8.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述碱性裂解液组成如下:1%SDS，0.2M NaOH，溶剂为水。
4.如权利要求 1所述的方法，其特征在于步骤(8)中样品溶解液IOmMTris-Cl，溶剂为水，pH8.5。
全文摘要
本发明提供了一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法针对微量动物样品(最低10mg)，通过碱性裂解法选择性沉淀核基因组DNA，经几步纯化后，达到快速简便富集线粒体DNA的目的。本发明的优势在于简便易行，实验耗时短，成本低廉，设备要求低，所富集的DNA可以直接作为后续利用PCR扩增进行分子鉴定的可靠模板，可用于小型鉴定实验室的微量动物样品预处理，特别适用于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等。本发明可以适用于包括坚硬和柔软组织在内的几乎所有的微量动物组织。
文档编号C12N15/10GK103224928SQ201310047450
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者杨劲树, 俞炎琴, 杨卫军 申请人:浙江大学