A型流感病毒NP基因有干扰作用的siRNA序列的设计及应用的制作方法
【专利摘要】本发明为A型流感病毒NP基因有干扰作用的siRNA序列的设计及应用，公开了四条对A型流感病毒NP基因复制有抑制作用的siRNA；通过鸡胚实验测HA滴度的方法确定了siRNA对流感病毒干扰的有效性。
【专利说明】A型流感病毒NP基因有干扰作用的s i RNA序列的设计及应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及对A型流感病毒NP基因复制有干扰作用的SiRNA序列的发现及应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]流行性感冒(Influenza)，在流行性感冒病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。
[0003]流感病毒表面抗原HA和NA的变异有两种形式，即抗原性漂移(antigenic drift)和抗原性转变(antigenic shift)。抗原性漂移是指变异幅度小或连续变异，属于量变，即亚型内变异。一般认为这种变异是由病毒基因点突变和人群免疫力选择所造成的，引起小规模流行。抗原性转变是指变异幅度大，属于质变，即病毒株表面抗原结构发生一种或两种变异，形成新亚型(如H2N2 — H3N2)，由于人群对变异病毒株缺少免疫力而容易造成新型流感的大流行。同一时期也可同时流行两个亚型，如1997年甲3型(H3N2)流行时，甲I型(HlNl)同时出现。如果不同型别病毒同时流行，也可发生基因重组而形成新亚型。
[0004]尽管由死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成的抗流感疫苗能够有效地保护约70~80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新的潜在爆发的毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40%。由于大部分的死亡都是发生在高风险人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流感药物也能够降低流感感染的发生和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的承受能力、可能出现的抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感的防治至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途径是医学研究的重大课题。
[0005] RNA干扰(RNA interference, RNAi)既目的RNA与同源的祀目标mRNA结合，阻断病毒翻译蛋白质是解决流感病毒流行的重要手段和方法，其作用原理为:①SiRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21_23nt的小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), siRNA的结构特征是5 '端单磷酸，3'端羟基,而且3'端有2~3-nt的碱基突出RNA诱导的沉默复合物(RNA_induced SilencingComplex, RISC)的形成阶段。siRNA与RNAi特异性酶(如Ago_2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与siRNA同源的mRNA ;③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5'端ΙΟ-nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质，表现为基因沉默。[0006]作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤、病毒性疾病和遗传性疾病的治疗研究。
【发明内容】
[0007]本发明提供4条对A型流感病毒NP基因复制有抑制作用的siRNA编码序列。如序列表 400〈1>，400〈2>，400〈3>，400〈4> 所示。
[0008]本发明所述的四条siRNA载体质粒的动物水平的实验结果表明能效抑制H1N1，H9N2，H2N3的病毒复制。
【具体实施方式】
[0009]实施例1:鸡胚实验验证siRNA载体质粒干扰H9N2流感病毒增殖作用
[0010]H9N2病毒毒力ED50108/0.Iml,将H9N2病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0011 ] 实施例2:鸡胚实验验证siRNA载体质粒干扰HlNl流感病毒增殖作用
[0012]HlNl病毒毒力ED5018_6/0.Iml,将HlNl病毒稀释含有100个ED50病毒液，体积
0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0013]实施例3:鸡胚实验验证siRNA载体质粒干扰H3N2流感病毒增殖作用
[0014]H3N2病毒毒力ED50107_6/0.1ml，将HlNl病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积
0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0015]实施例4:尿囊液病毒滴度检测
[0016](I)微量血凝板的每孔中滴加PH7.2PBS100 μ L，⑵吸取被检尿囊液样品100
[0017]μ L，倍比稀释12孔，第12孔弃掉100 μ L。每孔中加入0.1 %红细胞悬液100 μ L。
[0018](2)设阴性对照和流感病毒阳性对照。
[0019](4)置微型振荡器上振荡Imin混匀。
[0020](5)放室温下(18~20°C )30min，观察结果。
[0021]经三次重复实验，序列表所述的四条序列〈400>1，〈400>2，〈400>3，<400>4对
[0022]流感病毒复制的抑制率如下:
[0023]
【权利要求】
1.一种对流感病毒NP基因复制有干扰作用的SiRNA，其核苷酸序列如序列表400〈1>，400<2>,400<3>,400<4> 所示。
2.权利要求1、对所述的siRNA作为抑制流感病毒Np基因沉默的靶向基因的应用。
【文档编号】C12N15/113GK103966212SQ201310048338
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2013年2月6日
【发明者】霍晋 申请人:霍晋