专利名称：一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法
技术领域：
本发明属于固定化酶制备技术领域，特别涉及一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法。
背景技术：
蛋白酶是一种具有特殊催化功能的高效生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，该酶催化过程已经在工业中获得了较多的应用。但由于游离酶对工业催化过程存在一定的障碍，限制了其在工业上更广泛的应用，主要存在以下问题:
(I)酶在脱离细胞内的环境后，往往很难保持长期的稳定性，容易失去活性，尤其在油相或油-水界面，更容易失去活性；(2)由于酶为水溶性，在水相中反应时难以回收利用，造成使用成本偏高；为了解决游离蛋白酶的缺陷，人们发明了酶固定化技术，即酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使之仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。在本发明之前，依据酶的性质及用途主要分为吸附法、共价结合法、包埋法和交联法几种。传统酶固定化方法还存在着一定的缺陷性:(I)固定化蛋白酶的载体制备和固定化过程分开进行，造成固定化过程复杂，酶与载体的生物相容性较差；(2)采用吸附交联法固定化的蛋白酶，其与载体之间的结合作用相对较弱，容易造成酶脱落，从而使得固定化酶的稳定性差，使用寿命低；(3)采用共价结合法固定化的蛋白酶，其固定化反应通常较剧烈，容易造成酶的失活，从而导致固定化酶的活力降低。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法。 本发明的技术方案是:一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其主要技术特征在于包括以下步骤:在固定化反应器中加入聚苯胺单体和蒸馏水使得溶液浓度为0.01 0.2mol/L，用酸调节溶液pH为1.0 7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，在-10°C 45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10°C 45°C条件下恒温的引发剂和助剂，引发剂与单体的摩尔浓度比为1: 0.3 1: 5，助剂和单体的摩尔浓度比为1:1 1: 10，同时加入游离蛋白酶，单体质量与蛋白酶质量比为1: 0.01 1: 0.1 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10°C 45°C恒温条件下反应12 24h ;反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物真空干燥或冷冻干燥8 24h，得到固定化酶。用于固定化的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶、氨基肽酶、胶原酶。上述的单体为苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻苯二胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、邻甲氧基苯胺、邻巯基苯胺中的一种。上述用于调节单体溶液pH值的酸为无机酸，即盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一种。上述的引发剂为K2Cr2O7, (NH4)2S2O8' Ce(SO4)2' FeCl3' FeCl4' AlCl3' HAuCl4, KIO3'H2O2、MnO2 中的一种。上述的助剂为F127 (EO70PO100EO70)、丁基萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基二烯丙基氯化铵中的一种。上述的真空干燥温度为10°C 45°C，真空度为O -0.1MPa0本发明的优点和效果在于:制备载体的同时加入游离酶使得固定化过程简单，条件温和，时间缩短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力高；固定化的酶稳定性好，使用寿命长。本发明方法制备固定化蛋白酶的工艺简单，载体价廉易得，成本较低，有利于大规模的工业化生产。
具体实施例方式以下将通过具体的实施例进一步阐述本说明，但本发明技术方案不局限于以下所列的具体实施方式
。所述的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶、氨基肽酶、胶原酶。所述的单体为苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻苯二胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、邻甲氧基苯胺、邻巯基苯胺中的一种。所述调节单体溶液pH值的酸为无机酸，包括盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一种。所述的引发剂为K2Cr2O7, (NH4)2S2O8' Ce(SO4)2' FeCl3' FeCl4' AlCl3' HAuCl4, KIO3'H2O2、MnO2 中的一种。所述的助剂为F127即EO7ciPOiciciEO7c1、丁基萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基二烯丙基氯化铵中的一种。下面是具体实施例说明。实施例1:在固定化反应器中加入苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.0lmol/L，加入硫酸调节溶液pH为3.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，在0°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在0°C条件下恒温的引发剂K2Cr2O7、助剂EO70PO100EO70, K2Cr2O7与苯胺的摩尔浓度比为1: 0.5，EO7ciPOiciciEO7ci与苯胺的摩尔浓度比为1: 2，同时加入游离的木瓜蛋白酶，苯胺质量与木瓜蛋白酶质量比为1: 0.05;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于(TC恒温条件下反应；反应时间为18h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥15h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.9倍。该过程载体制备与酶的固定化同时进行，操作简单，耗时较短，生物相容性好，能耗较少，成本较低，有利于大规模的工业化生产。同 时，将该固定化酶重复使用多次后酶活没有明显降低。实施例2:
在固定化反应器中加入邻甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.05mol/L，加入盐酸调节溶液PH为5.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，10°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在10°C条件下恒温的引发剂(NH4)2S2O8，助剂丁基萘磺酸钠，(NH4)2S2O8与邻甲苯胺的摩尔浓度比为1: 1，丁基萘磺酸钠和邻甲苯胺的摩尔浓度比为1: 5，同时加入游离的菠萝蛋白酶，邻甲苯胺质量与菠萝蛋白酶质量比为1: 0.08 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于10°C恒温条件下反应；反应时间为15h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在15°C、-0.05MPa条件下干燥18h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.2倍。该效果同实施例1。实施例3:在固定化反应器中加入间甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.lmol/L，溶液pH为7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，20°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在20°C条件下恒温的引发剂Ce (SO4)2,助剂十二烷基苯磺酸钠，Ce (SO4) 2与间甲苯胺的摩尔浓度比为1: 3，十二烷基苯磺酸钠和间甲苯胺的摩尔浓度比为1: 8，同时加入游离的胃蛋白酶，间甲苯胺质量与胃蛋白酶质量比为1: 0.1;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于20°C恒温条件下反应；反应时间为12h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在30°C、_0.05MPa条件下干燥18h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.6倍。效果同实施例1。实施例4:在固定化反应器中加入对甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.08mol/L，加入醋酸调节溶液PH为6.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，_5°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在_5°C条件下恒温的引发剂FeCl3，助剂十六烷基三甲基溴化铵，FeCl3与对甲苯胺的摩尔浓度比为1: 0.8，十六烷基三甲基溴化铵和对甲苯胺的摩尔浓度比为I: 3，同时加入游离的胰凝乳蛋白酶，对甲苯胺质量与胰凝乳蛋白酶质量比为1: 0.04;然后搅拌使整个体系 混合均匀，放置于_5°C恒温条件下反应；反应时间为20h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥8h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.8倍。效果同实施例1。实施例5:在固定化反应器中加入邻苯二胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.12mol/L，加入磷酸调节溶液PH为1.0;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，15°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在15°C条件下恒温的引发剂FeCl4，助剂二甲基二烯丙基氯化铵，FeCl4与邻苯二胺的摩尔浓度比为1: 1.5，二甲基二烯丙基氯化铵和邻苯二胺的摩尔浓度比为1: 6，同时加入游离的胰蛋白酶，邻苯二胺质量与胰蛋白酶质量比为1: 0.01;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于15°C恒温条件下反应；反应时间为16h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在20°C、_0.08MPa条件下干燥10h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.0倍。效果同实施例I。实施例6:在固定化反应器中加入邻氯苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.2mol/L，加入硝酸调节溶液PH为2.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，30°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在30°C条件下恒温的引发剂AlCl3、助剂十二烷基苯磺酸钠，AlCl3与邻氯苯胺的摩尔浓度比为1: 4，十二烷基苯磺酸钠和邻氯苯胺的摩尔浓度比为1: 10，同时加入游离的糜蛋白酶，邻氯苯胺质量与糜蛋白酶质量比为1: 0.06 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于30°C恒温条件下反应；反应时间为24h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在10°C、-0.1MPa条件下干燥12h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.0倍。效果同实施例1。实施例7:在固定化反应器中加入间氯苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.18mol/L，溶液pH为7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在45°C条件下恒温的引发剂HAuCl4、助剂丁基萘磺酸钠，HAuCl4与间氯苯胺的摩尔浓度比为1: 5，丁基萘磺酸钠和间氯苯胺的摩尔浓度比为1: 9，同时加入游离的羧肽酶，间氯苯胺质量与羧肽酶质量比为1: 0.02;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于45°C恒温条件下反应；反应时间为17h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在35°C、_0.04MPa条件下干燥14h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.3倍。效果同实施例1。实施例8:在固定化反应器中加入邻甲氧基苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.06mol/L，加入盐酸调节溶液pH为4.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，-10°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10°C条件下恒温的引发剂KIO3，助剂十二烷基苯磺酸钠，KIO3与邻甲氧基苯胺的摩尔浓度比为1: 1，十二烷基苯磺酸钠和邻甲氧基苯胺的摩尔浓度比为I: 7，同时加入游离的组织蛋白酶，邻甲氧基苯胺质量与组织蛋白酶质量比为1: 0.08;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10°C恒温条件下反应；反应时间为20h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥16h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.5倍。效果同实施例1。实施例9:在固定化反应器中加入邻巯基苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.16mol/L，加入硫酸调节溶液PH为3.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，35°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在35°C条件下恒温的引发剂H2O2，助剂十六烷基三甲基溴化铵，H2O2与邻巯基苯胺的摩尔浓度比为1: 0.3，十六烷基三甲基溴化铵和邻巯基苯胺的摩尔浓度比为1: 4，同时加入游离的枯草杆菌蛋白酶，邻巯基苯胺质量与枯草杆菌蛋白酶质量比为I: 0.05;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于35°C恒温条件下反应；反应时间为15h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥15h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.5倍。效果同实施例1。实施例10:在固定化反应器中加入苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.08mol/L，加入盐酸调节溶液pH为2.0 ;充分搅拌至溶液充分 混合均匀后，40°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在40°C条件下恒温的引发剂MnO2，助剂二甲基二烯丙基氯化铵，MnO2与苯胺的摩尔浓度比为1: 4.5，二甲基二烯丙基氯化铵和苯胺的摩尔浓度比为1: 1，同时加入游离的链霉菌蛋白酶，苯胺质量与链霉菌蛋白酶质量比为1: 0.01 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于40°C恒温条件下反应；应时间为12h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在40°C、-0.02MPa条件下干燥20h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.9倍。效果同实施例1。
实施例11:在固定化反应器中加入邻甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.03mol/L,溶液pH为
7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在45°C条件下恒温的引发剂FeCl3、助剂E07(lP01(l(lE07(l，FeCl3与邻甲苯胺的摩尔浓度比为I: 0.5，E07(iP01(i(iE07(i和邻甲苯胺的摩尔浓度比为1: 6，同时加入游离的氨基肽酶，邻甲苯胺质量与氨基肽酶质量比为1: 0.03;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于45°C恒温条件下反应；反应时间为14h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在45°C、_0.0lMPa条件下干燥17h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.2倍。效果同实施例1。实施例12:在固定化反应器中加入邻氯苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.15mol/L，加入硝酸调节溶液PH为1.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，20°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在20°C条件下恒温的引发剂HAuCl4、助剂十二烷基苯磺酸钠，HAuCl4与邻氯苯胺的摩尔浓度比为1: 3.5，十二烷基苯磺酸钠和邻氯苯胺的摩尔浓度比为1: 7，同时加入游离的胶原酶，邻氯苯胺质量与胶原酶质量比为1: 0.06;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于20°C恒温条件下反应；反应时间为17h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥24h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.6倍。效果同实施例1。
权利要求
1.一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤:在固定化反应器中加入聚苯胺单体和蒸馏水使得溶液浓度为0.0l 0.2mol/L，用酸调节溶液pH为1.0 7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，在-10°C 45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10°C 45°C条件下恒温的引发剂和助剂，引发剂与单体的摩尔浓度比为1: 0.3 1: 5，助剂和单体的摩尔浓度比为1:1 1: 10，同时加入游离蛋白酶，单体质量与蛋白酶质量比为1: 0.01 1: 0.1;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10°C 45°C恒温条件下反应；反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物真空干燥或冷冻干燥，得到固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于所述的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶、氨基肽酶、胶原酶。
3.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于所述的单体为苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻苯二胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、邻甲氧基苯胺、邻巯基苯胺中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于调节单体溶液pH值的酸为无机酸，即盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于所述的引发剂为 K2Cr2O7, (NH4)2S2O8' Ce (SO4) 2、FeCl3' FeCl4' AlCl3' HAuCl4, K103、H2O2' MnO2中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于所述的助剂为F127、丁基萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基二烯丙基氯化铵中的一种。
7.根据权 利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于真空干燥温度为10°c 45°C，真空度为O -0.1MPa0
8.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于单体质量与蛋白酶在-10°C 45°C恒温条件下反应的时间为12 24h。
9.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于将产物真空干燥或冷冻干燥8 24h，得到固定化酶。
全文摘要
本发明涉及一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法。本发明的技术方案是在制备聚苯胺载体同时加入蛋白酶进行吸附的反应-吸附耦联固定化蛋白酶方法，本发明为以苯胺及苯胺衍生物为单体，加入引发剂和助剂，同时加入需固定化的游离蛋白酶，放置于恒温条件下反应，过滤洗涤得到以聚苯胺为载体的固定化蛋白酶。本发明克服了现有传统酶固定化方法存在的固定化过程复杂，酶与载体的生物相容性较差，其与载体之间的结合作用相对较弱，固定化酶的稳定性差，使用寿命低，其固定化反应通常较剧烈，容易造成酶的失活，活力降低等缺陷。本发明具有固定化过程简单，条件温和，效率高，固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力好，使用寿命长。
文档编号C12N11/08GK103103178SQ20131005067
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者熊健, 黄亚娟, 侯丽云, 张华 申请人:扬州大学