专利名称：嵌合抗原受体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤生物制药领域，具体涉及一种嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ 的制备及其用途。
背景技术：
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)是由抗原特异性的受体(如单链抗体scFv),间隔序列(spacer),跨膜序列(TM Domain)和胞内共刺激信号分子组成。间隔序列可以是hlgGl、hIgG4、hlgD、CD7或CD8等，跨膜序列可以是CD3 ζ、CD4、CD7、CD8、Fe ε RI Y、H2-Kb 等。胞内共刺激信号分子可以是 CD28、CD134、CD137、CD244、Fe ε RI γ、⑶3ζ等。根据胞内共刺激信号分子的组成的差异，CAR被分为三代。第一代CAR仅含有一个胞内的信号分子(Fe eRI Y或⑶3ζ)。通过对CAR分子胞内区的信号分子的改变，显著提高了 CAR修饰的的T淋巴细胞在体内对肿瘤细胞的杀伤力及在增强了在体内抗原刺激下的增殖能力及延长了存活周期。根据共刺激信号分子的数量将CAR又分为第二代(含有两个共刺激信号分子)和第三代(含有三个共刺激信号分子)。CAR修饰的T淋巴细胞在体内能够通过其单链抗体特异的识别相关肿瘤表面抗原，然后通过胞内共刺激信号分子将识别的信号传递到细胞内，激活T淋巴细胞的杀伤性，杀伤肿瘤细胞。CAR修饰的T细胞(CART)用于治疗相关肿瘤，通过对患者的T淋巴细胞的改造，使T淋巴细胞能够通过其表达的CAR分子识别肿瘤相关抗原，从而激活，释放各种细胞因子，杀伤肿瘤细胞。因此这种改造的T淋巴细胞具有很好的靶向性，对肿瘤抗原的识别不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制。另外在治疗过程中是对患者自身的T细胞进行改造，并且改造的T细胞表达的scFv也是人的，所以避免患者自身对CART细胞的排斥，保证CART细胞回输到患者体内后的活性。目前的过继细胞免疫治疗主要有CIK细胞，DC-CIK细胞等，但是CIK细胞由于没有特异性的肿瘤杀伤作用，故在临床上的疗效有限，而DC-CIK虽然对肿瘤有特异性杀伤，但是DC细胞的制备成本较高，并且从外周血能够分离的DC细胞的数量也有限，并且用于刺激DC细胞的特异抗原制备较困难，而目前使用较多的是肿瘤细胞的裂解物，大大降低了DC-CIK细胞的特异性，故在临床上DC-CIK的疗效不显著。LMPl是EB病毒表达潜在膜蛋白，是EB病毒表达的唯一确定具有转化能力的蛋白，可使大鼠成纤维细胞发生转化，使其能够不依赖于生长。本实验通过LMPl胞外区制备的抗原筛选天然人Fab噬菌体库，获得的抗LMPl的Fab与鼻咽癌细胞表面的LMPl有很好的亲和力，并且在0.5 μ M浓度时对肿瘤细胞的生长抑制大于率50%。本发明以该Fab序列设计合成的抗LMPl的scFv。
发明内容
本发明的目的是为解决目前T细胞治疗过程中，抗原呈递细胞制备困难，且成本较高，制备周期较长，重复性差等问题。
为了解决上述问题，本发明提供一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体由人抗EB病毒潜伏膜蛋白I (LMPl)的单链抗体(scFv)，人IgGl分子Fe区的CH2CH3及T细胞共刺激信号分子CD28、CD134 (0X40)及CD3 4的胞内信号结构串联构成；其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示；其编码的基因序列如序列表中的SEQ ID N0.3所示。该嵌合抗原受体针对的人抗EB病毒潜伏膜蛋白I(LMPl)的单链抗体，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.4所示。其编码的基因序列如序列表中的SEQ ID N0.5所示。该嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ IDN0.6所示。该嵌合抗原受体的单链抗体的重链和轻链分子之间有个(gly4ser)3连接肽，(gly4ser) 3 连接妝即 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser0该嵌合抗原受体以IgGl分子的CH2CH3及⑶28、⑶134、⑶3 ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.9所示。该嵌合抗原受体中的T细胞共刺激信号分子除了是⑶28-⑶134-⑶3 ζ还可以是CD28-CD3ζ，CD28-CD137(4-1BB)-CD3ζ。
所述的嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ在制备EB病毒相关肿瘤药物中的应用。所述的嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ用于EB病毒相关的肿瘤治疗。该嵌合抗原受体采用逆转录病毒或慢病毒感染T细胞，制备嵌合抗原受体T细胞(CART)，用于EB病毒相关的肿瘤治疗。EB病毒相关的肿瘤包括鼻咽癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胃癌。
本发明根据本实验室噬菌体展示技术筛选到的人抗LMPl的Fab序列(专利申请号:201110364065)，经密码子优化，在5’加上信号肽，全基因合成抗LMPl的scFv序列，并将合成的scFV序列克隆到pSFG-CH2CH3-CD28 -CD3 ζ载体中，即构建成LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶3 ζ嵌合抗原受体，然后通过Gateway重组克隆技术将合成的⑶134片段克隆到LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶3 ζ中，即获得本发明的嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ。利用该嵌合抗原受体与逆转录病毒的包装质粒PeqPam3及RD114 env在293T细胞中包装成逆转录病毒。利用该逆转录病毒感染T淋巴细胞，使淋巴细胞表达该抗原受体。通过ELISPL0T检测该嵌合抗原受体T (CART)细胞在LMPl抗原刺激下IFN-Y的分泌及通过流式检测该CART细胞对LMPl阳性的鼻咽癌细胞的杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶134-⑶3 ζ可以在EB病毒相关的肿瘤的T细胞治疗中应用，可以用于制备抗EB病毒相关肿瘤的药物。有益效果:本发明提供的嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶134-⑶3 ζ是通过逆转录病毒技术制备的逆转录病毒，可以在体外感染患者的自身T淋巴细胞，修饰的T淋巴细胞即为LMPl特异的CART细胞。该CART细胞能够依赖LMPl特异的scFv序列特异识别EB病毒相关的表达LMPl的肿瘤的细胞，从而激活CART细胞，释放IFN- Y等杀伤肿瘤细胞。释放的IFN-Y除了自身能对肿瘤细胞有杀伤作用力，还能增强CART细胞进入肿瘤的内部，增强细胞治疗的效果。采用CAR技术制备的CART细胞制备的周期短，重复性较好。可以在EB病毒相关的肿瘤的T细胞治疗中应用，制备与EB病毒相关肿瘤的抗肿瘤药物。
图1是本发明所述的合成LMPl scFv序列在pUC57载体上用NcoI和BamHI酶切后释放的LMPl scFv序列部分。泳道I为pUC57-LMPl-scFv用NcoI和BamHI双酶切；泳道2为15kb核酸分子量标准。图2 是本发明所述的LMPl scFv克隆到逆转录病毒PSFG-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ 中，用 NcoI 和 SphI 酶切鉴定，释放片段为 LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ，大小为2.2kb,泳道I为CAR载体经NcoI和SphI酶切；泳道2为未酶切的CAR载体；泳道3为15kb的核酸分子量标准。图 3 是 Western Blotting 本发明构建的 LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134_CD3 ζ转染293Τ细胞后的表达，分别用了抗人Fe的抗体和抗人⑶3 ζ检测。泳道I为293Τ对照；泳道2为转染的CAR载体的293Τ细胞。图4是流式检测本发明构建的LMPl-CAR修饰的T细胞中CAR分子的表达。图5 是 Western Blotting 检测鼻咽癌 SUNE1-LMP1-TOFA 及 SUNE1-LMP1-TONA 细胞中，加强力霉素(DOX)前后的LMPl的表达，泳道I为SUNE1-LMP1-T0FA细胞蛋白，泳道2为SUNE1-LMP1-TOFA经DOX诱导的细胞蛋白，泳道3为SUNE1-LMP1-TONA细胞蛋白，泳道4为SUNE1-LMP1-TONA经DOX诱导的细胞蛋白。图6 是 Western Blotting 检测淋巴瘤细胞 U937，Raji，RPMI6666 细胞中 LMPl 的表达，泳道I为U937细胞蛋白，泳道2为Raji细胞蛋白，泳道3为RPMI6666细胞蛋白。图7是本发明中LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ修饰的T细胞对鼻咽癌SUNE1-LMP1-TOFA及SUNE1-LMP1-TONA细胞在用DOX诱导前后的杀伤作用。图8是本发明中LMPl-scFv_CH2CH3-⑶28-⑶134-⑶3 ζ修饰的T细胞对淋巴瘤细胞 U937，Raji, RPMI6666 的杀伤检测。图9是本发明中LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ修饰的T细胞在收到LMPl抗原刺激后IFN-Y的表达。
具体实施例方式实施例1:嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3(逆转录病毒载体构建。1.根据本实验室噬菌体展示技术筛选到的抗LMPl胞外区的人Fab序列的VH链和VL链的氨基酸序列(序列参考专利“一种人源抗鼻咽癌LMPl胞外区抗体及其应用”，该专利申请号为201110364065)，在OptimumGeneTM基因设计软件内输入VH和VL的氨基酸序列，密码子偏爱性参数选择人，软件计算出优化VH (SEQ ID NO 2)和VL (SEQ ID NO10)的核酸序列。参照 Dutour, A., V.Marin, et al.(2012)."In Vitro and In VivoAntitumor Effect of Anti_CD33 Chimeric Receptor-Expressing EBV-CTL against CD33Acute Myeloid Leukemia.〃 Adv Hematol 2012在构建嵌合抗原受体的时在单链抗体抗体(scFv)的5’端加上信号肽序列(SEQ ID NO 6 )，在VH和VL之间加入连接序列(gly4ser) 3，故设计构建到嵌合抗原 受体的scFv部分的结构为:信号肽-VH-(gly4ser)3-VL，对应的核酸序列(SEQ ID NO 5)由南京金斯瑞生物技术有限公司进行合成，该公司将该片段合成后克隆在pUC57载体中，命名为pUC57-LMPl-scFv。2.提取pUC57-LMPl_scFv质粒用限制性内切酶NcoI和BamHI (Takara公司)进行酶切，酶切体系如下:pUC57-LMPl-scFv 2 μ g，NcoI和BamHI各I μ 1，IOX酶切缓冲液2μ 1，用水补到20μ 1，37°C水浴过夜，酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒(购自Axygene公司)进行DNA片段回收(结果见图1，从电泳图上可以看出pUC57-LMPl-scFv载体经NcoI和BamHI酶切后释放出LMPl_scFv的条带)；用同样的方法 NcoI 和 BamH 酶切 pSFG-CH2CH3-CD28_CD3 ζ 载体(由 Xiaotong Song 博士赠送)，用琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切后的载体片段。将回收后的LMPl-scFv片段与酶切后的载体通过T4连接酶(购自Takara公司)进行连接，反应体系及条件如下:经NcoI和 BamHI 酶切的 LMPl-scFv 和 pSFG-CH2CH3-CD28_CD3 ζ 载体各 2 μ 1，IOX 连接缓冲液1μ 1，连接酶1μ 1，用水补到10μ 1，16°C连接过夜。连接产物转化入E.coli DH5a感受态细菌中，37°C过夜培养后,挑取单个菌落,扩大培养后，用质粒提取试剂盒(购自Axygene公司)按照试剂盒操作说明提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序检测，将正确的载体命名为LMPl-scFv—CH2CH3-CD28-CD3 ζ。3.从CD134的3’端选择从214-255位的氨基酸(SEQ ID NO 7 )作为CAR分子的共刺激信号分子与CD28及CD3 ζ串联表达，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成对应的核苷酸序列(SEQ ID NO 8),然后通过gateway重组克隆技术(南京金斯瑞公司的CloneEZ 重组克隆试剂盒)将CD134的序列克隆到LMPl-scFv—CH2CH3-CD28-CD3 ζ的CD28和CD3 ζ之间，构建成功的质粒用NcoI和SphI进行酶切鉴定(如图2酶切结果表明阳性克隆能释放出目的条带)及测序鉴定正确。实施例2:
嵌合抗原受体 LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ 表达鉴定采用大提试剂盒(天根生物)提取LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶134-⑶3 ζ逆转录病毒载体，并将质粒用PI转染试剂转染到人胚肾细胞293Τ中，24h后，用PBS洗涤一遍，加入RIPA细胞裂解液(已加Roche的蛋白酶抑制剂Cocktail Tablets)，提取转染后293T细胞的蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转膜，用鼠抗人CD3 ζ抗体及兔抗人Fe抗体4°C过夜孵育，然后用辣根过氧酶标记的抗小鼠及抗兔的二抗37°C孵育lh，最后在膜上加上ECL显色液进行显色。结果用抗人CD3(抗体及兔抗人Fe抗体均能购检测到CAR分子的表达，蛋白大小与理论的CAR蛋白一致，均为80kD (如图3)。实施例3:
嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶134-⑶3 ζ修饰的T淋巴细胞的制备 1、表达CAR分子逆转录病毒的包装制备
用天根质粒大提试剂盒提取逆转录病毒的包装载体PRD114和Peq_pam3质粒(由Xiaotong Song 博士赠送)与 LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134_CD3 ζ 逆转录病毒载体共转染到293Τ细胞中，转染后48h收集细胞上清，用4000prm离心lOmin，然后用0.45 μ m的滤膜过滤，-80°C分装冻存。2、T淋巴细胞 的制备
采取20ml健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(购自GE公司)分离外周血单核细胞(PBMC)。分离的细胞用包被过⑶3和⑶28的平板刺激48h，用T淋巴细胞培养基GT-T551(购自TAKARA公司)加3%自身血浆进行诱导培养，得到T淋巴细胞。3、CART细胞制备
用50 μ g/ml的RetroNectin(购自TAKARA公司)包被非组织培养24孔板，每孔500 μ 1，4°C过夜,然后每孔加入1.5ml逆转录病毒，32°C放置Ih,弃上清,再次加入1.5ml的逆转录病毒，32°C放置lh，弃去上清后再孔内加入T淋巴细胞及逆转录病毒，从而获得表达LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ T 细胞即 CART 细胞。4、流式检测CART细胞中CAR分子的表达
将表达LMPl-scFv-CH2CH3-CD28-CD134-CD3 ζ T细胞即CART细胞用FITC标记的抗人Fe抗体(购自Jackson公司)37°C孵育Ih后，进行流式检测，检测结果如图4，白色的峰表示作为对照的T淋巴细胞，黑色的峰表示感染嵌合抗原受体的逆转录病的T淋巴细胞，结果表明本方法制备的CART细胞效率大于90%。实施例4:
嵌合抗原受体LMPl-scFv-CH2CH3-⑶28-⑶134-⑶3 ζ修饰的T淋巴细胞对EB相关肿瘤细胞的杀伤作用
1、Western Blotting检·测鼻咽癌细胞中LMPl的表达
SUNE1-LMP1-TOFA和SUNE1-LMP1-TONA细胞均为鼻咽癌细胞(诺华公司赠送)，前者采用Tet-off表达系统转入LMPl基因，该细胞在没有DOX刺激时能够表达LMPl蛋白，在加入DOX刺激后LMPl表达被抑制，而后采用Tet-on表达系统转入LMPl基因，该细胞在没有DOX刺激时不能够诱导表达LMPI，在DOX刺激后能够诱导细胞表达LMPI。培养SUNE1-LMP1-TOFA和SUNE1-LMP1-TONA分别用DOX刺激和未刺激，细胞用RIPA细胞裂解液(已加Roche的蛋白酶抑制剂Cocktail Tablets)冰上裂解30min后,提取细胞蛋白，进行Western Blotting检测，检测结果如图5，SUNE1-LMP1-T0FA和用DOX诱导的SUNE1-LMP1-TONA的细胞能够检测到LMPl的高表达，而SUNE1-LMP1-TONA和经DOX诱导的SUNE1-LMP1-TOFA细胞LMPl的表达明显下降。2、Western Blotting检测淋巴瘤细胞中LMPl的表达
选取对数生长期的不同的淋巴瘤细胞(U937，Raji, RPMI6666)，提取细胞蛋白(方法同上)，进行Western Blotting检测，检测结果如图6，Raji和RPMI6666细胞能够检测到LMPl的表达，而U937细胞不能检测到LMPl的表达。3、CART细胞对肿瘤细胞杀伤力检测
将肿瘤细胞用培养基调整到4X107ml，加入终浓度为0.5μΜ calcein violet进行标记，冰上放置30min，用PBS洗涤三遍后，用1640培养基重悬细胞，计数。调整肿瘤细胞至4父106/1111，取25(^1加入到24孔板内，按E:T为20:1 ；10:1 ；5:1 ； 1:1分别加入T细胞2X107 ;1X107 ;5X106 ; I X 106，共培养4h，每孔加入50 μ g PI，转到流式管中进行FACS检测。肿瘤细胞有鼻咽癌细胞SUNE1-LMP1-TOFA，SUNE1-LMP1-TOFA加DOX诱导，SUNE1-LMP1-TONA，SUNE1-LMP1-TONA 加 DOX 诱导，检测结果(如图 7)表明 CART 细胞对LMPI表达较高的SUNE1-LMP1-TOFA和DOX诱导的SUNE1-LMP1-TONA细胞杀伤力高于SUNE1-LMP1-TONA 和 DOX 诱导的 SUNE1-LMP1-TOFA 细胞；淋巴瘤细胞 U937，Ra j i，RPMI6666，检测结果(如图8) CART细胞对LMPl表达较高的Raji和RPMI6666的杀伤力高于未能检测到LMPl表达U937细胞。4、ELISP0T检测CART细胞在受到LMPl抗原刺激后IFN- Y表达
用无菌ELISP0T包被液来稀释IFN-Y抗体(1:250稀释)，在ELISP0T板(Millipore，Cat.N0.MAIPS4510)上加入每孔100 μ 1，放在4° C冰箱过夜，进行包被。第二天从板上吸掉包被液。用PBS洗板两次，200 μ I/孔。每孔加入200 μ I含血清的细胞培养液RPM1-1640,在37°C放置I小时。洗去含血清的细胞培养液RPM1-1640，用PBS再洗三次。准备LMPl胞外区多肽，稀释在含血清的细胞培养液RPM1-1640，调至终浓度为I μ g/ml。每孔加IOOul。准备CART细胞，调至I X IO6Vl，每孔加IOOul，终浓度为I X IO5/孔。37。。，5%CO2培养24小时。24小时后，洗掉细胞，用PBS洗板三次。稀释生物素标记的抗IFN-Y抗体(1:250稀释)，每孔加100 μ I。培养2小时。洗掉抗体，再用PBS洗4次。准备Avidin-HRP,加IOOul进每孔。室温放置45分钟。洗掉Avidin-HRP，用PBS_tween20洗3次，然后用PBS洗3次。准备AEC溶液，加入IOOul每孔，室温10-60分钟，观察斑点形成用流水洗孔，中止反应。等板干，计数(结果如图9)，结果表明CART细胞在特异的LMPl抗原刺激下能够分泌IFN-Y。`
权利要求
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体由人抗EB病毒潜伏膜蛋白I的单链抗体scFv，人IgGl分子Fe区的CH2CH3及T细胞共刺激信号分子⑶28、⑶134及⑶3 ζ的胞内信号结构串联构成。
2.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
3.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体的核酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
4.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体针对的人抗EB病毒潜伏膜蛋白I的单链抗体，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.4所示。
5.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.6所不。
6.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体的单链抗体的重链和轻链分子之间有个 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer连接肽。
7.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体，其特征在于:该嵌合抗原受体以IgGl分子的CH2CH3及⑶28、⑶134、⑶3 ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.9所示。
8.如权利要求1中所述的嵌合抗原受体在制备抗EB病毒相关肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求1中所述 的嵌合抗原受体用于EB病毒相关的肿瘤治疗。
全文摘要
本发明属于肿瘤生物技术领域，公开了一种嵌合抗原受体的制备及其应用。该嵌合抗原受体由人抗EB病毒潜伏膜蛋白1的单链抗体、人抗体IgG1的CH2CH3及免疫共刺激信号分子CD28、CD134及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于EB病毒相关的肿瘤的治疗，以及制备抗EB病毒相关肿瘤的药物。
文档编号C12N15/62GK103145849SQ201310053109
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者冯振卿, 宋晓彤, 朱进, 唐小军, 陈仁杰 申请人:冯振卿