专利名称：检测牛无浆体的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测动物血液病原菌的试剂盒，确切讲本发明涉及一种用于检测牛无浆体的试剂盒。
背景技术：
无衆体(anaplasma)是一类经蝶传播的专性细胞内寄生菌,主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。1910年在北非首次发现了牛无浆体病，后来发现该病广泛分布于世界各地。无浆体病引起动物体重下降，流产，产奶量下降，严重者导致死亡，造成严重的经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的疫病。引起牛无衆体病的病原已证实的有边缘无衆体(anaplasma marginale)、中央无衆体(anaplasma centrale)、牛无衆体(anaplasma bovis)和嗜吞卩遼细胞无衆体(anaplasmaphagocytophilum)ο牛无衆体(Anaplasma bovis)是无衆体属(Anaplasma)的一个重要成员，牛无衆体有广泛的宿主，已经证明它能寄生于牛、羊等反刍动物的体内，牛无浆体经节肢动物-蜱传播后寄生于宿主动物的血液的单核细胞内。牛无浆体在世界各地广泛流行，以前我国的牛无浆体病病原中并没有牛无浆体感染的报道，但在最近我们的调查中发现在我国许多地区存在牛无浆体，并且在某些地区呈高阳性率状态，应该引起高度重视，但目前针对该病原的检测方法仅有血涂片染色法和套式PCR方法。血涂片染色法在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。套式 PCR 检测方法，参见:Kawahara M, et al.2006, Novel genetic variants ofAnaplasma phagocytophilum, Anaplasma bovis, Anaplasma centrale, and a novelEhrlichia sp.1n wild deer and ticks on two major islands in Japan,App1.Environ.Microbiol, 2006.72:1102_1109，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染，而且费时费力。因此，建立一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的用于检测牛无浆体的试剂盒。本发明的检测牛无浆体的试剂盒内至少有如下的三条引物探针序列:正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ No 2和探针SEQ Na 3，其中的探针序列的5端结合有荧光发光基团FAM, 3端结合有连接MGB的非荧光淬灭基团。为方便使用，在本发明 的检测牛无浆体的试剂盒中还包括有如下成分:荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、阴性质控标准品。其中的荧光定量PCR反应液是由Premix Ex Taq (2X) 12.5yL，正向引引物SEQ Ns I和反向引物SEQ Na 2 (10 μ M )各 0.5 μ L，荧光探针溶液(5 μ Μ) 1.0 μ L，ROX Reference Dye II (50 X )
0.5 μ L，灭菌蒸馏水8.0 μ L组成。另外，本发明检测牛无浆体的试剂盒中的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA为由正向引物EEl和反向引物EE2扩增的DNA片段构建的pGEM-Teasy重组质粒；而阴性质控标准品可以是灭菌蒸馏水。本发明实际上是一种利用16S rRNA基因检测牛无浆体的实时荧光定量PCR方法。实时突光定量PCR( real- time fluorescent quantitative polymerasechain reaction,real-time FQ-PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR技术相比它所具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内外均未有检测牛无浆体实时荧光定量PCR方法的报道，本发明利用牛无浆体16S rRNA基因作为实时荧光定量PCR检测靶基因，设计针对牛无浆体16SrRNA基因的特异性引物和探针，从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测牛无浆体的方法，填补了技术空白。本发明中，通过对实时荧光定量PCR反应条条件的优化，使本发明具有良好的敏感性、特异性、重复性，其敏感性比套式PCR高10倍，可以用于牛无浆体的快速定量检测。
图1为本发明的实时荧光定量PCR标准曲线。图2为本发明的实时荧光定量PCR灵敏度试验。从上到下依次为1.0X IO7 — 1.0X 10°拷贝/ μ L的质粒标准品及阴性对照的扩增 结果。图3套式PCR检测方法电泳图。其中M 为 DNA 分子量标准 DL2000 ;1、2、3、4、5、6、7、分别为 1.0XlO6 -1.0XlO0 拷贝/μ L的质粒标准品；8为阴性对照；9阳性对照；10为正常牛全血基因组。图4为本发明的实时荧光定量PCR特异性试验。基线以上的为牛无浆体的扩增结果，基线以下的为绵羊无浆体、边缘无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、羊巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、支原体、衣原体、螺旋体、弓形虫和阴性对照的扩增结果。
具体实施例方式本发明以下结合附图和实施例作详细说明。本发明的试剂盒中最主要的是如下的三条引物探针序列，即:
ABRTFl (正向引物):5，-CACGCTGTAAACGATGAG-3’SEQNa I
ABRTRl (反向引物):5，-CGTCAATTCCTTTGAGTTTTAG-3， SEQNa 2 ABRTPb (荧光探针):5，(FAM)-ACCTCCGTGTTGTA - (NFQ) - (MGB) 3’ SEQ Na 3
其中的的荧光探针SEQ Ns 3的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有连接MGB的非荧光淬灭基团。目的片段大小为117 bp。为方便使用，在实际应用的试剂盒内还可设有:荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、阴性质控标准品。在本实施例中荧光定量PCR反应液由Premix Ex Taq (2X >12.5 μ L, 10 μ M 的正向引物 SEQ Ns I 和反向引物 SEQ Ns 2 各 0.5μ L，荧光探针 SEQNs 3 溶液(5 μ Μ) 1.0 μ L，荧光校正液 ROX Reference Dye II (50 X )
0.5 μ L,灭菌蒸懼水8.0 μ L。本发明的实施例中上述的引物和探针委托美国Life Technologies公司合成。
本发明的试剂盒应用实例
1.构建重组质粒标准品。(I)参照文献 Barlough JE, et al.1996, Nested polymerase chain reactionfor detection of Ehrlichia equi genomic DNA in horses and ticks (Ixodespacificus).Vet.Parasi to 1.63:319 - 329.中的引物 EEl 和 EE2 扩增 16s rRNA 基因，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。(2)以实验室保存的牛无浆体菌株DNA为模板进行扩增，采用50yL的PCR反应体系，反应条件为94°C预变性3min，然后94°C 30s,54°C 30s,72°C 30s, 35个循环，72°C延伸5min。取5yL扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(Transgen,北京)进行纯化回收，将回收产物连接到pGEM-Teasy载体(Promega, America)后转化到大肠杆菌感受态细胞JM-109 (TaKaRa,大连)中，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆(白斑)进行PCR和测序鉴定。(3)对鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C (ThermoScientific，America)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/ μ L，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0X IO8 -1.0XlO0拷贝/ μ L，再进行定量PCR扩增，定量PCR反应体系为25 μ L =Premix Ex Taq (2X) 12.5 yL，正向引物SEQ I和反向引物SEQ 2 (10 μ M )各0.5 μ L，荧光探针SEQ 3 (5 μ Μ)1.0 μ L, ROX Reference Dye II (50 X) 0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L，灭菌蒸馏水 8.0 μ L。反应条件为:95°C预变性30s，然后95°C 5s,59°C 15s、72°C 20s，40个循环。在每一循环的延伸温度结束时设定荧光信号采集点进行实时检测，每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。所建立的实时荧光定量PCR标准曲线参见图1，模板量与对应的Ct值呈线性相关，相关系数为0.998，扩增效率为101.7%，标准曲线方程为y=-3.281X+41.43。实时荧光定量PCR方法特性分析。( I)敏感性分析
取浓度1.0X IO7 -1.0X 10°拷贝/ μ L的质粒标准品进行灵敏度试验，结果显示实时荧光定量PCR方法最低检出限为IO1拷贝/ μ L，参见图2，而套式PCR的最低检出限为IO2拷贝/ μ L参见图3，显然本发明比套式PCR检测方法灵敏度高10倍。(2)特异性分析
利用本文所建立实时荧光定量PCR方法，分别检测了牛无浆体、绵羊无浆体、边缘无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、羊巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、支原体、衣原体、螺旋体和弓形虫，结果显示只有牛无浆体呈阳性反应，其他病原体均呈阴性，参见图4。(3)稳定性分析
取浓度为1.0Χ106 -1.0Χ101拷贝/μ L的5个浓度的标准品进行稳定性分析。先进行批内重复性试验，对同一批次稀释的标准品， 每个浓度重复检测三次，经分析Ct值变异系数在0.10%-1.01%，小于5%。然后进行批间重复性试验，对3个不同批次稀释的标准品进行检测，经分析Ct值变异系数在0.61%-1.88%，小于10%。由此说明本发明具有较好的稳定性。表一批内重复I试验结果
权利要求
1.测牛无浆体的试剂盒，其特征在于试剂盒至少有如下的三条引物探针序列:正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ Na 2和探针SEQ Na 3，其中的探针序列的5’端结合有荧光发光基团FAM，3’端结合有连接MGB的非荧光淬灭基团。
2.权利要求1所述的检测牛无浆体的试剂盒，其特征在于试剂盒中还包括有如下成分:荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、阴性质控标准品。
3.权利要求2所述的检测牛无浆体的试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应液由Premix Ex Taq (2X >12.5 μ L, 10 μ M 的正向引物 SEQ Ns I 和反向引物 SEQ Ns 2 各 0.5μ L,5 μ M 的荧 光探针 SEQ Ns 3 溶液 1.0 μ L, ROX Reference Dye II (50X ) 0.5 yL，灭菌蒸馏水8.0 μ L组成。
4.权利要求3所述的检测牛无浆体的试剂盒，其特征在于阴性质控标准品为灭菌蒸馏水。
全文摘要
本发明公开一种用于检测牛无浆体的试剂盒。本发明的检测牛无浆体的试剂盒内至少有如下的三条引物探针序列正向引物SEQ №1，反向引物SEQ №2和探针SEQ №3，其中的探针序列的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有连接MGB的非荧光淬灭基团。本发明应用是一种利用16srRNA基因检测牛无浆体的实时荧光定量PCR方法。本发明具有良好的敏感性、特异性、重复性，其敏感性比套式PCR高10倍，可以用于牛无浆体的快速定量检测。
文档编号C12R1/01GK103088149SQ20131006273
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者殷宏, 迟庆安, 刘志杰, 李有全, 杨吉飞, 陈泽 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所