专利名称：一种粉末型细小病毒维持培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物新材料，更具体地，涉及一种粉末型细小病毒维持培养基及其制备方法。
背景技术：
培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐以及维生素和水等；有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定；基础培养基添加血清、抗生素等物质后，叫做完全培养基也叫细胞培养基，完全培养基根据添加血清量的多少，又分为细胞生长培养基和细胞维持培养基。细胞维持培养基是维持细胞缓慢生长或不死的培养基，血清含量比较少，一般细胞因缺少生长因子不能增殖，生长缓慢，但是发生转化或者癌细胞因自身有产生促生长增殖因子的能力，在血清缺少情况下仍能生长，所以维持培养基可用于选择发生恶性转化的细胞。在现有技术中，在细小病毒维持工艺中，一般使用基础培养基，这种培养基在使用时需要辅以血清，这种培养基主要针对细胞的存活与增殖，并未特意弱化细胞对病毒的抵抗力和高比例防腐剂灭活剂添加对最终产品的副作用。
发明内容
针对现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种粉末型细小病毒维持培养基及其制备方法，优化了维持病毒时维持培养液的配方，本发明通过增加维持培养液营养成分可以使目标产物表达量更高，通过调低防腐剂和灭活剂比例减少最终成品副作用。本发明填补了细小病毒维持液的配方空白，切实有效的在细胞维持阶段保持细胞存活率，并且支持病毒 维持时的营养状态不发生过抗状态；通过本发明的制备方法制成的粉末剂型，增加了产品的存放时间和降低了产品的存放条件要求。—种粉末型细小病毒维持培养基，其特征在于，按质量分数计，由10-30份的氨基酸及其衍生物、2-5份的维生素及其衍生物、40-78份的无机化合物和15-50份的其它类组成，所述其它类包括5.8-10.4份的PluronicF-68和0.00009-0.00016份的亚油酸冻干粉。优选的，所述氨基酸及其衍生物按质量分数计，包括:4.1-8.5份L-色氨酸，0.3-0.6份L-半胱氨酸，0.1-0.3份L-异亮氨酸，0.3-0.5份L-亮氨酸，0.1-0.3份L-缬氨酸，0.2-0.4份L-赖氨酸，0.3-0.8份L-蛋氨酸，0.2-0.4份L-谷氨酸，0.2-0.3份L-苯丙氨酸，0.5-1.3份L-酪氨酸，0.2-0.3份甘氨酸，0.1-0.2份L-脯氨酸，0.1-0.3份L-丙氨酸，0.2-0.3份L-天冬氨酸，0.2-0.4份L-丝氨酸，0.3-0.8份L-苏氨酸，3.5-6.3份L-谷氨酰胺，0.3-0.7份L-天冬酰胺，0.3-0.6份L-胱氨酸盐酸盐，0.2-0.4份L-精氨酸盐酸盐，0.5-0.8份L-组氨酸盐酸盐。优选的，所述无机化合物按质量分数计,包括:45.6-94.6份氯化钠,0.5-0.9份六水氯化镁，0.4-0.8份无水硫酸镁，0.7-1.6份无水氯化钙，1.3-2.2份氯化钾，0.3份-0.6份一水磷酸二氢钠，0.2-0.3磷酸氢二钠，0.0007-0.001份七水合硫酸锌，0.000003-0.000005份五水硫酸铜，0.0007-0.002份九水合硝酸铁。优选的，所述维生素及其衍生物按质量分数计，包括:0.0007-0.001份维生素C， 0.001-0.003g磷酸吡哆醇，0.00009-0.0002份磷酸吡哆醛，0.01-0.03份烟酰胺，0.01-0.03 份盐酸硫胺素，0.0001-0.0003 份钴铵素，0.006-0.01 份核黄素，0.02-0.05份叶酸，0.0007-0.002份生物素。制备上述亚油酸冻干粉的方法，包括以下步骤:
(1)将7g亚油酸和Ig氢氧化钠溶于50ml蒸馏水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化钠制备成预冻液Y ；
(2)将步骤(I)所述的预冻液Y放入真空冷冻干燥机中，在-36°C下保温，打开真空冷冻干燥机的真空装置，待其真空度到6-7Pa时，以每小时2°C的梯度升温，直至预冻液Y的共晶点;
(3)将步骤(2)中的预冻液Y，保持温度lh，2次升华至0°C，待冰点核通透后急速升温至常温，常温保持2h，制得亚油酸冻干粉。一种粉末型细小病毒维持培养基的制备方法，包括以下步骤:
(I)制备亚油酸冻干粉:将7g亚油酸和Ig氢氧化钠溶于50ml蒸馏水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化钠制备成预冻液Y，再将预冻液Y放入真空冷冻干燥机中在_36°C下保温，打开真空冷冻干燥机的真空装置，待其真空度到6-7Pa时，以每小时2°C的梯度升温，直至预冻液Y的共晶点，然后保持温度lh，2次升华至0°C，待冰点核通透后急速升温至常温，常温保持2h，制得亚油酸冻干粉。(2)组分制 备:按照重量分别称取各物质，配制成组分A、B、C、D，然后将组分A在鼓风恒温干燥箱65°C下干燥8h，将组分B在鼓风恒温干燥箱80°C下干燥8h，将组分C在鼓风恒温干燥箱40°C下干燥14h，组分D在鼓风恒温干燥箱65°C下干燥IOh ；
(3)成品制备:将上述干燥的组分A、干燥的组分B、干燥的组分C与600-800gPluronicF-68的混合物、干燥的组分D分别装在球磨机的四头缸体中，混合6h,制得四种粒径小于0.1mm3的中间体A、B、C、D，然后再将上述中间体A、B、C、D在三维运动混合机中进行搅拌混合均匀，得到粉末型细小病毒维持培养基。
具体实施例方式为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例1:
首先，制备亚油酸冻干粉，具体步骤如下:
(1)将78亚油酸和Ig氢氧化钠溶于50ml蒸馏水中，配制成溶液Z;然后在溶液Z中添加20g氯化钠，配制成预冻液Y ；
(2)将预冻液Y放入真空冷冻干燥机的托盘中，关好设备舱门，将冷凝温度调到-36°C，保持温度；
(3)将真空度调至约6-7Pa，开始以每小时2°C的梯度升温，直至到达预冻液Y的共晶占.(4)保持温度lh，二次升华至0°C，观察冰点核情况，冰点核通透后急速升温至常温，在常温下保持2h，冻干亚油酸制成。然后，制备1000L培养基，将配方中的原料分为A、B、C、D四组，按照下列质量称取各组分:
组分A: L-色氨酸450g，L-半胱氨酸37.5g，L-异亮氨酸15g，L-亮氨酸30g，L-缬氨酸16.5g，L-精氨酸盐酸盐18.75g，L-组氨酸盐酸盐50g，L-赖氨酸22.5g，L-蛋氨酸37.5g, L-谷氨酸25g, L-苯丙氨酸18.75g, L-天冬酰胺31.5g,甘氨酸20g, L-脯氨酸14.25g, L-丙氨酸15g, L-天冬氨酸20g, L-丝氨酸22.5g, L-苏氨酸37.5g, L-谷氨酰胺390g，L-胱氨酸盐酸盐33.75g，L-酪氨酸60g。组分B:六水氯化镁60g，无水硫酸镁48g，无水氯化钙80g，氯化钾141g，氯化钠1040g, 一水磷酸二氢钠32g，磷酸氢二钠20g，七水合硫酸锌0.08g,五水硫酸铜0.0003g。组分C:氯化钠2000g，九水合硝酸铁0.08g。组分D:氯化钠2000g，大米水解物800g，丙酮酸钠105g，还原型谷胱甘肽0.04g,肌醇Sg，次黄嘌呤钠盐0.5g，腐胺0.08g,硫辛酸0.08g,亚油酸冻干粉0.0lg，维生素C0.08g，磷酸吡哆醇0.16g，磷酸吡哆醛0.0lg，钴铵素0.016g，烟酰胺1.6g，核黄素0.7g，盐酸硫胺素1.6g,氯化胆碱5.6g, D-泛酸 丐2g,叶酸3.2g,生物素0.08g。在鼓风恒温干燥箱中，将组分A以65°C的条件下干燥8h ;将组分B以80°C的条件下干燥8h ;将组分C以40°C的条件下干燥14h ;将组分D以65°C的条件下干燥10h。最后，在球磨机的四头缸体分别装入上述干燥组分A、B、D和干燥组分C与640gPluronic F-68 ;混合6h，产出粒径小于0.1mm3的中间体A、B、C、D，然后在三维运动混合机中进行搅拌混合均匀，制得粉末型细小病毒维持培养基。
实施例2:
首先，制备亚油酸冻干粉，步骤与实施例1中完全相同。然后，配制1000L培养基，将配方中的原料分为A、B、C、D四组，按照下列质量称取各组分:
组分A: L-色氨酸551.25g，L-半胱氨酸43.75g，L-异亮氨酸20g，L-亮氨酸34g，L-缬氨酸19.5g，L-精氨酸盐酸盐24.25g，L-组氨酸盐酸盐56.25g，L-赖氨酸25.8g，L-蛋氨酸50g, L-谷氨酸28.2g, L-苯丙氨酸21.75g, L-天冬酰胺42g,甘氨酸22.5g,L-脯氨酸16.25g，L-丙氨酸17.5g，L-天冬氨酸22.5g，L-丝氨酸26.25g，L-苏氨酸49.lg, L-谷氨酰胺438.75g，L-胱氨酸盐酸盐39.75g，L-酪氨酸80g。组分B:六水氯化镁66g，无水硫酸镁54g，无水氯化钙100g，氯化钾155.1g,氯化钠1170g，一水磷酸二氢钠40g，磷酸氢二钠22g，七水合硫酸锌0.09g,五水硫酸铜0.00033go组分C:氯化钠2500g，九水合硝酸铁0.1Ogo组分D:氯化钠2500g，大米水解物lOOOg，丙酮酸钠115.5g，还原型谷胱甘肽
0.045g，肌醇IOg,次黄嘌呤钠盐0.55g，腐胺0.09g,硫辛酸0.1Og,亚油酸冻干粉0.0llg,维生素C0.09g，磷酸吡哆醇0.20g，磷酸吡哆醛0.011§，钴铵素0.018g，烟酰胺2.0g，核黄素
0.Hg,盐酸硫胺素1.8g，氯化胆碱7g，D-泛酸钙2.2g，叶酸3.6g，生物素0.1Ogo在鼓风恒温干燥箱中，将组分A以65°C的条件下干燥8h ;将组分B以80°C的条件下干燥8h ;将组分C以40°C的条件下干燥14h ;将组分D以65°C的条件下干燥10h。最后，在球磨机的四头缸体分别装入上述干燥组分A、B、D和干燥组分C与720gPluronic F-68 ;混合6h，产出粒径小于0.1mm3的中间体A、B、C、D，然后在三维运动混合机中进行搅拌混合均匀，制得粉末型细小病毒维持培养基。实施例3:
首先，制备亚油酸冻干粉，步骤与实施例1中完全相同。然后，配制1000L培养基，将配方中的原料分为A、B、C、D四组，按照下列质量称取各组分:
组分A: L-色氨酸652.5g，L-半胱氨酸50g，L-异亮氨酸25g，L-亮氨酸37.5g，L-缬氨酸22g，L-精氨酸盐酸盐31.25g，L-组氨酸盐酸盐62.5g，L-赖氨酸30g，L-蛋氨酸62.5g, L-谷氨酸31.25g, L-苯丙氨酸25g, L-天冬酰胺52.5g,甘氨酸25g, L-脯氨酸19g，L-丙氨酸25g，L-天冬氨酸25g，L-丝氨酸30g，L-苏氨酸62.5g，L-谷氨酰胺487.5g，L-胱氨酸盐酸盐45g，L-酪氨酸100g。组分B:六水氯化镁72g，无水硫酸镁60g，无水氯化钙120g，氯化钾169.2g，氯化钠1300g，一水磷酸二氢钠48g，磷酸氢二钠24g，七水合硫酸锌0.1g,五水硫酸铜0.00036g。组分C:氯化钠3000g，九水合硝酸铁0.12g。组分D:氯化钠3000g，大米水解物1200g，丙酮酸钠126g，还原型谷胱甘肽0.05g,肌醇12g，次黄嘌呤钠盐0.6g，腐胺0.lg，硫辛酸0.12g，亚油酸冻干粉0.012g，维生素C0.1g,磷酸吡哆醇0.24g，磷酸吡哆醛0.012g,钴铵素0.02g,烟酰胺2.4g，核黄素0.84g，盐酸硫胺素2g,氯化胆碱8.4g, D-泛酸|丐2.4g,叶酸4g,生物素0.12g。
在鼓风恒温干燥箱中，将组分A以65°C的条件下干燥8h ;将组分B以80°C的条件下干燥8h ;将组分C以40°C的条件下干燥14h ;将组分D以65°C的条件下干燥10h。最后，在球磨机的四头缸体分别装入上述干燥组分A、B、D和干燥组分C与SOOgPluronic F-68 ;混合6h，产出粒径小于0.1mm3的中间体A、B、C、D，然后在三维运动混合机中进行搅拌混合均匀，制得粉末型细小病毒维持培养基。以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
权利要求
1.一种粉末型细小病毒维持培养基，其特征在于，按质量分数计，由10-30份的氨基酸及其衍生物、2-5份的维生素及其衍生物、40-78份的无机化合物和15-50份的其它类组成，所述其它类包括5.8-10.4份的PluronicF-68和0.00009-0.00016份的亚油酸冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种粉末型细小病毒维持培养基，其特征在于，所述氨基酸及其衍生物按质量分数计，包括:4.1-8.5份L-色氨酸，0.3-0.6份L-半胱氨酸，0.1-0.3份L-异亮氨酸，0.3-0.5份L-亮氨酸，0.1-0.3份L-缬氨酸，0.2-0.4份L-赖氨酸，0.3-0.8份L-蛋氨酸，0.2-0.4份L-谷氨酸，0.2-0.3份L-苯丙氨酸，0.5-1.3份L-酪氨酸，0.2-0.3份甘氨酸，0.1-0.2份L-脯氨酸，0.1-0.3份L-丙氨酸，0.2-0.3份L-天冬氨酸，0.2-0.4份L-丝氨酸，0.3-0.8份L-苏氨酸，3.5-6.3份L-谷氨酰胺，0.3-0.7份L-天冬酰胺，0.3-0.6份L-胱氨酸盐酸盐，0.2-0.4份L-精氨酸盐酸盐，0.5-0.8份L-组氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种粉末型细小病毒维持培养基，其特征在于，所述无机化合物按质量分数计，包括:45.6-94.6份氯化钠，0.5-0.9份六水氯化镁，0.4-0.8份无水硫酸镁，0.7-1.6份无水氯化钙，1.3-2.2份氯化钾，0.3份-0.6份一水磷酸二氢钠，0.2-0.3磷酸氢二钠，0.0007-0.001份七水合硫酸锌，0.000003-0.000005份五水硫酸铜，0.0007-0.002份九水合 硝酸铁。
4.根据权利要求1所述的一种粉末型细小病毒维持培养基，其特征在于，所述维生素及其衍生物按质量分数计，包括:0.0007-0.001份维生素C， 0.001-0.003g磷酸吡哆醇，0.00009-0.0002份磷酸吡哆醛，0.01-0.03份烟酰胺，0.01-0.03份盐酸硫胺素，0.0001-0.0003 份钴铵素，0.006-0.01 份核黄素，0.02-0.05 份叶酸，0.0007-0.002 份生物素。
5.制备权利要求1-4中任意一项所述亚油酸冻干粉的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将7g亚油酸和Ig氢氧化钠溶于50ml蒸馏水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化钠制备成预冻液Y ； (2)将步骤(I)所述的预冻液Y放入真空冷冻干燥机中，在-36°C下保温，打开真空冷冻干燥机的真空装置，待其真空度到6-7Pa时，以每小时2V的梯度升温，直至预冻液Y的共晶点; (3)将步骤(2)中的预冻液Y，保持温度lh，2次升华至0°C，待冰点核通透后急速升温至常温，常温保持2h，制得亚油酸冻干粉。
6.一种粉末型细小病毒维持培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备亚油酸冻干粉:将7g亚油酸和Ig氢氧化钠溶于50ml蒸馏水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化钠制备成预冻液Y，再将预冻液Y放入真空冷冻干燥机中在_36°C下保温，打开真空冷冻干燥机的真空装置，待其真空度到6-7Pa时，以每小时2°C的梯度升温，直至预冻液Y的共晶点，然后保持温度lh，2次升华至0°C，待冰点核通透后急速升温至常温，常温保持2h，制得亚油酸冻干粉； (2)组分制备:按照重量分别称取各物质，配制成组分A、B、C、D，然后将组分A在鼓风恒温干燥箱65°C下干燥8h，将组分B在鼓风恒温干燥箱80°C下干燥8h，将组分C在鼓风恒温干燥箱40°C下干燥14h，组分D在鼓风恒温干燥箱65°C下干燥IOh ；(3)成品制备:将上述干燥的组分A、干燥的组分B、干燥的组分C与600-800gPluronicF-68的混合物、干燥的组分D分别装在球磨机的四头缸体中，混合6h,制得四种粒径小于0.1mm3的中间体A、B、C、D，然后再将上述中间体A、B、C、D在三维运动混合机中进行搅拌混合均匀，得到粉末`型细小病毒维持培养基。
全文摘要
本发明提供了一种粉末型细小病毒维持培养基，按质量分数计，由10-30份的氨基酸及其衍生物、2-5份的维生素及其衍生物、40-78份的无机化合物和15-50份的其它类组成，所述其它类包括5.8-10.4份的PluronicF-68和0.00009-0.00016份的亚油酸冻干粉。其制备方法如下(1)制备亚油酸冻干粉；(2)组分制备，按照重量分别称取各物质，配制成组分A、B、C、D，并将这四种组分在鼓风恒温干燥箱中干燥；(3)将上述干燥的组分A、干燥的组分B、干燥的组分C与600-800gPluronicF-68的混合物、干燥的组分D分别装在球磨机的四头缸体中，混合6h，然后再进行搅拌混合均匀，得到产品。本发明通过增加维持培养液营养成分可以使目标产物表达量更高，通过调低防腐剂和灭活剂比例减少最终成品副作用。
文档编号C12N7/00GK103184195SQ201310073638
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者张大鹤, 王其乐 申请人:苏州市沃美生物技术有限公司