一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法
【专利摘要】本发明属于细胞生物学领域，涉及肿瘤干细胞研究，具体涉及一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法。本发明方法简化了卵巢肿瘤SP细胞分选过程，采用改良的孵育液，可有效的用于贴壁培养的卵巢肿瘤细胞系的SP细胞分选；不需要酶解消化过程，细胞直接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色后再将细胞酶解成单细胞，在悬浮状态上机分选，可以提高分选时的细胞活性。本方法能简便、快速、有效分选得到SP细胞，可明显节省实验流程操作时间，获得的SP细胞可用作肿瘤干细胞的表面标志物，对后续的实验研究具有明显的实用价值。
【专利说明】一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，涉及肿瘤干细胞研究，具体涉及一种贴壁分选卵巢 肿瘤侧群细胞的方法。该方法从卵巢肿瘤细胞系中分选出一群具有干细胞样特性的细胞， 即侧群细胞（SP cells, side population cells),能够简化实验过程和节约时间，提高分 选时的细胞活性。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了肿瘤干细胞是一群具有自我更新和分化能力的具有干样特性的 细胞，目前，公认的肿瘤干细胞的分选方法包括表面标志物的分选，如⑶133+、⑶44+⑶117+ 以及ALDHbr (aldehyde dehydrogenase bright)等，另外还有侧群细胞的分选，即SP细胞 分选。肿瘤干细胞中高表达ABC转运蛋白的细胞能够通过流式鉴定。卵巢肿瘤的SP细胞 分选方法的基础就在于这一小群细胞高表达ABC转运蛋白，能够拒染H 〇echst33342。上述 两种方法中，其中的表面标志物的分选方法，迄今尚未发现有较为明确的肿瘤干细胞的表 面标志物的报道；所述的侧群细胞的分选方法，作为传统的实验方法存在有如下缺陷：实 验操作较为繁琐，耗时耗力。因此，本研究领域迫切需要简化卵巢肿瘤SP细胞分选的方法 以达到提商实验效率的目的。
[0003] 与本发明相关的现有技术有：
[0004] 1.Dou J，Jiang C，Wang J，Zhang X，Zhao F，Hu W，He X，Li X，Zou D，Gu N. Using ABCG2-molecule-expressing side population cells to identify cancer stem-like cells in a human ovarian cell line.Cell Biol Int2011 ；35 :227-234.
[0005] 2. Hiraga T, Ito S, Nakamura H. Side population in MDA-MB-231human breast cancer
[0006] cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncol Rep2011 ；25 :289-296.
[0007] 3. Goodel 1 MA. Stem cell identification and sorting using the Hoechst33342side population (SP). Curr Protoc Cytom2005 ；9 ：18.
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简化的从卵巢肿瘤细胞系中分 选具有干细胞样特性细胞的新方法，尤其涉及一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法。
[0009] 本发明方法，可明显节省实验流程操作时间（30分钟左右），且随着分选细胞总数 的增加相应节约的时间更多，效率提高，存活细胞比例增加，使劳动力成本明显下降。
[0010] 具体的，本发明的一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，其特征在于，不需要酶 解消化过程，细胞直接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色后再将细胞酶解成单细胞， 在悬浮状态上机分选，获得与传统方法无差异的SP细胞比例。
[0011] 本发明对传统分选SP细胞的方法进行了改进，现有技术的分选SP细胞的方法的 技术方案中（Goodell等在2005年公开的SP细胞分选方法），对贴壁培养的细胞进行染色 时，需要先采用胰酶消化，使细胞悬浮后再进行染色，且所采用的H〇echst33342染色后孵 育至少需要90分钟，每10-15分钟需要振荡混匀一次等的技术方案；
[0012] 本发明中，简化了卵巢肿瘤SP细胞分选过程，贴壁生长的细胞不需消化悬浮，也 不必在孵育过程中不停地振荡混匀，最后洗弃培液直接重悬无需反复洗涤离心，减少了对 细胞活性损害。
[0013] 本发明中，实验所采用的孵育液为改良的孵育液，该孵育液可有效的用于贴壁培 养的卵巢肿瘤细胞系的SP细胞分选；所述的改良的人卵巢肿瘤细胞系SP细胞分选孵育液 由如表1所述的成分组成。
[0014] 表1显示了改良的人卵巢肿瘤细胞系SP细胞分选孵育液的成分与配比。表1
[0015]
【权利要求】
1. 一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，其特征在于，不需要酶解消化过程，细胞直 接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色后再将细胞酶解成单细胞，在悬浮状态上机分 选，获得侧群细胞；其包括步骤： 1) 进行人卵巢肿瘤细胞系细胞培养， 2) 培养的细胞按一定密度接种于培养器皿中，使其贴壁生长，直接染色孵育90分钟， 无需每15分钟振荡混匀， 3) 孵育后用预冷HBSS液洗涤并酶解成单细胞悬液，离心弃去上清液后重悬浓缩细胞， 在悬浮状态上机分选，获得侧群细胞。
2. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的人卵巢肿瘤细胞系是ES-2和 OVCAR-3细胞系， 其中，培养ES-2细胞系使用含10 %胎牛血清（Hyclone)的RPM1640培养 基（Hyclone)，0VCAR-3 使用含 20 % 胎牛血清（Hyclone)、0· Olng/μ 1 胰岛素的 RPM1640(Hyclone)培养基，培养条件为37°C，5% C02，细胞每两天传代一次。
3. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，采用的孵育液由如表1所述 的成分组成，其PH值须调整到7. 0 ; 表1
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4. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，卵巢肿瘤细胞系以5X105/ L的密度接种。
5. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中直接H〇echst33342染色孵育 90分钟。
6. 按权利要求1所述的方法，其特征在于，所获得的SP细胞在制备肿瘤干细胞的表面 标志物中的用途。
【文档编号】C12N5/095GK104059880SQ201310097217
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月22日 优先权日:2013年3月22日
【发明者】姜桦, 马晓玲, 陈彤 申请人:复旦大学附属妇产科医院