专利名称：高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在疫苗开发中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种狂犬病毒固定株的选育方法及其应用，具体涉及一种高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在狂犬病疫苗开发中的应用。
背景技术：
狂犬病是一种严重的致死性流行病。感染狂犬病毒后一旦出现临床症状，存活的预后极差，死亡几乎不可避免。目前全球超过25亿人生活在狂犬病流行区而受到该疾病的威胁，每年导致5万多人死亡，其中半数以上是年龄小于15岁的儿童，他们是感染狂犬病的高危人群。中国也是狂犬病流行高发区，狂犬病死亡率长期居于中国各类法定传染病首位。由于没有任何针对狂犬病的有效治疗药物能够成功得到应用，研发狂犬病疫苗(包括人用疫苗和动物用疫苗)成为控制疾病危害的唯一有效手段。人用狂犬病疫苗的研发历史已超过百年。鉴于狂犬病的超高致死率，疫苗品种更新换代的需求比其他流行病疫苗更为迫切，研发更为安全有效的新一代人用狂犬病疫苗成为疫苗开发的热点。国内外研发了种类繁多的人用狂犬病疫苗新品种，包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等。在这些不同类型人用狂犬病疫苗研发品种中，全病毒灭活疫苗的保护效果是最好的，也是目前唯一得到临床应用的人用狂犬病疫苗。预计在未来相当长的一段时期，人用狂犬病疫苗的更新换代，依然将以全病毒灭活疫苗技术路线为重点。其中，Vero细胞疫苗以其安全性好、成本低以及适应于工业化生产等优势，成为国内外人用狂犬病疫苗研发的主流。现有的人用狂犬病疫苗存在免疫失败的问题，Vero细胞疫苗也不例外，尤其是针对严重暴露于狂犬病毒的人群， 免疫失败比例较高。导致免疫失败的重要原因之一是疫苗生产用毒种免疫原性不够高。对于严重暴露于狂犬病毒的人群，如果疫苗生产用毒种免疫原性偏低，普通的抗原剂量就不足以保证疫苗的免疫保护效果，而进一步提高抗原剂量又可能导至免疫人群出现严重的不良免疫反应。通过提高疫苗生产用毒种的免疫原性，就有可能在不增加抗原剂量、保证安全性的前提下大幅度提高疫苗对所有免疫人群的保护效果。因此，高免疫原性疫苗生产用毒种的选育对人用狂犬病疫苗更新换代、进一步提高疫苗免疫保护效果、降低狂犬病的发病率和死亡率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高免疫原性狂犬病毒固定株的选育方法，尤其是能用Vero细胞进行大规模、高产率培养的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育方法。本发明的另一目的是提供新的狂犬病毒固定株。具体涉及所述的狂犬病毒固定株，能以Vero细胞作培养基质高滴度培养；与国内外现有的狂犬病毒固定株相比，免疫原性更高；病毒基因组碱基序列及病毒蛋白质氨基酸序列与国内外现有的狂犬病毒固定株不同，且这些基因组碱基序列的差异和蛋白氨基酸序列的差异能稳定遗传，在以VeiO细胞进行连续传代过程中至少15代以内保持不变。本发明还提供了以此选育方法得到的狂犬病毒固定株在开发人用或动物用疫苗中的应用。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
Cl) 鼠脑毒种的扩增和纯化
从国内外被普遍认可的病毒保藏机构取回aG株或其他经动物脑组织传代建株的狂犬病毒固定株，病毒接种20-25日龄豚鼠脑腔，豚鼠出现典型狂犬病症状时无菌条件下取脑，加入维持液A (含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0)后研磨脑组织制成匀浆，高速离心除去沉淀，上清液经蔗糖密度梯度超速离心3-5小时，收取蔗糖浓度为45%-55%的组份，透析去除蔗糖，稀释制成滴度为9.0-10.0LogLD50/ml病毒悬液；
(2)鼠脑病毒对Vero细胞的适应培养
从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获取的Vero细胞，贴壁培养24-72小时，胰蛋白酶消化并离心收集细胞；加入含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0 ；含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培养基优选:0.01% — 0.1%胰蛋白酶、0.1-1mMEDTA、0.5—1%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0 ;制成密度为5X 105_2X IO6Cells/ml的细胞悬液；按病毒:细胞为1:1——I: 100的量加入步骤(I)制备的病毒悬液，25-40°C条件下放置10-60分钟；加入含5-10%牛血清的M199培养基，PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5-lX105cells/cm2, 37°C条件下贴壁培养；24_48小时后培养液更换成含0.5%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，30_34°C条件下贴壁培养；96_144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒; (3)Vero细胞培养病毒在裸鼠脑组织中扩增
步骤(2)得到的病毒悬液接种裸鼠脑腔，动物出现典型狂犬病症状时无菌条件下取脑，按步骤一同样方法制备病毒悬液；
低代次细胞适应病毒培养液病毒滴度较低；动物脑组织是狂犬病毒天然培养基质，故可用动物脑组织扩增Vero细胞适应病毒，提高滴度；国内外大多使用豚鼠脑、小鼠脑、兔脑或羊脑扩增狂犬病毒，但这些动物不适合用于高免疫原性的狂犬病毒扩增，因为这些动物都具有健全的免疫系统，高免疫原性的病毒会导至动物产生细胞凋亡等免疫反应而形成负选择，影响选育效果；裸鼠是免疫缺陷动物，故本发明使用裸鼠。(4) 病毒在裸鼠脑组织和VeiO细胞上交替传代
重复步骤(2)和步骤(3)，病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代2_10次，优选5_8次，最优选6次,制备6代Vero细胞传代培养的病毒悬液；
(5)本步骤可使Vero细胞适应的病毒突变体(包括高免疫原性的突变体)不断得到优
选
病毒在VeiO细胞上连续传代
步骤(4)得到的病毒悬液接种贴壁培养的Vero细胞，32-34°C培养72-168小时，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定病毒滴度，并在Vero细胞上连续传代，直到病毒滴度高于7.5LogLD50/ml ；
(6)本步骤可使Vero细胞适应的病毒突变体(包括高免疫原性的突变体)进一步得到优选
病毒单克隆纯化、筛选和保存建株
步骤(5)得到的滴度高于7.5LogLD50/ml的病毒培养液，按文献方法制备Vero细胞的病毒蚀斑，微型注射器吸取单斑病毒培养液，经Vero细胞扩大培养，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法测定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活标定病毒免疫原性，选取病毒滴度高于7.5LogLD5(l/ml、免疫原性比活高于2.0的多个单斑病毒培养液分别进行分装、冷冻干燥后保存于_20°C冰箱；
对保存的毒种进行基因组序列分析，并与起始鼠脑毒种比较，病毒基因组的碱基序列和病毒蛋白的氨基酸序列均出现明显差异；
(7)选育毒种的传代稳定性分析
步骤(6)得到的若干株候选毒种，在Veix)细胞上连续传15代以上，每代或隔三代进行一次检定:小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法测定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活标定病毒免疫原性、病毒基因组序列分析和病毒蛋白氨基酸序列分析测定毒种遗传稳定性，选取以上各项检定数据至少15代以内保持稳定的候选毒种作为疫苗生产用毒种；上述的百分含量为质量百分含量。选育毒种在狂犬疫苗研发中的应用 步骤(7)选育的疫苗生产用毒种，接种方瓶、转瓶或生物反应器培养的VeiX)细胞，32-34 °C培养72-168小时，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度，均高于
7.0LogLD5Q/ml ； β -丙内脂方法或甲醛方法灭活病毒，NIH方法测定原液效力，均高于
5.0IU/ml ;蔗糖密度梯度超速离心方法纯化灭活后的病毒培养液，收取45-55%蔗糖浓度的组份，透析法除蔗糖，测蛋白含量，按5ug/ml蛋白含量分装，加入人血白蛋白作保护剂，冷冻干燥制成疫苗，NIH方法测定原液效力，均高于2.5IU/剂；ELISA方法测抗原含量，均不高于效力值的1/2，所述的VeiO细胞为非洲绿猴肾细胞。本发明的优点在于:以该方法选育的新狂犬病毒固定株，可在Veix)细胞上高滴度扩增；扩增的病毒具有比现有的狂犬病毒固定株更高的免疫原性；新狂犬病毒固定株在Vero细胞上连续多次传代依然保持生物学、遗传学和其他特性的稳定性。基于这些特征，新狂犬病毒固定株可用于大规模、工业化生产免疫保护效果更好、安全性更高的狂犬病疫苗。与市售的各种狂犬病疫苗比较:用同样的ELISA试剂盒测定抗原量，同样条件下的NIH方法测定效力。结果这些疫苗的ELISA抗原量值均高于效力值。表明本发明选育的狂犬病毒固定株免疫原性至少是现有疫苗生产用毒种的2倍以上。
图1:GNV12毒株与标准株4aG的免疫原型关键蛋白(G蛋白)氨基酸序列比较； 说明:图1为GNV12毒株与标准株4aG的免疫原性关键蛋白(G蛋白)氨基酸序列比较，
其中174位氨基标准株4aG为脯氨酸(P )，GNVl2毒株为丝氨酸(S )，308位氨基酸标准株4aG为缬氨酸(V)，GNV12毒株为异亮氨酸(I)。图2:GNV12毒株的原始保存株与第15代Vero细胞传代株G蛋白氨基酸序列比较；
说明:图2为GNV12毒株的原始保存株与第15代VeiO细胞传代株G蛋白氨基酸序列比较。经过15代的的传代，毒株的氨基酸序列保持稳定。图3:GNV12毒株培养液密度梯度离心纯化图
说明:以GNV12毒株为疫苗生产用毒种，Veix)细胞为培养基质，病毒培养液经浓缩后进行蔗糖密度梯度超速离心紫外分光光度仪检测各组分光吸收，分组分收集不同蔗糖浓度的组分。
具体实施例方式以下用实施例对本发明举例说明，旨在阐述本发明的最佳实施方案，但本发明的保护范围并不限于此实施例。实施例1 病毒株Gtl的制备
将冻干狂犬病毒固定株4aG株干粉悬浮于注射用水,用维持液A (含0.5%牛血白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0)稀释10倍，脑腔接种体重45_50g豚鼠，0.1ml/只；96小时后无菌取脑，3个鼠脑合并，加入12ml维持液A，匀浆器制成匀浆；高速离心(10000XG，30分钟，4°C)去除沉淀；上清液置于密度梯度为30-60%的蔗糖层上进行超速离心(80000—100000 XG, 240分钟，4°C )，分组份收集溶液，测定各组份溶液的蔗糖含量和抗原量；合并蔗糖浓度为45-55%的组份，装入分子截留为30K的透析袋，在维持液A中透析除糖，得到病毒悬液，编号G0。实施例2 病毒株GV1的制备
24—72小时贴壁培养的Vero细胞，胰蛋白酶消化后用维持液B (0.01% — 0.1%胰蛋白酶、0.1—lmM EDTA、0.5 — 1%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0 — 8.0)制成密度为4X106cellS/ml的细胞悬液；按病毒:细胞为1:1一1: 100的量加入实施例1制备的Gtl病毒悬液，37 °C条件下放置，定时摇匀；30分钟后接种细胞培养瓶，接种量5X 105-2X 106cells/ml,加入培养液A(含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0)，37°C条件下贴壁培养；48小时后去培养液A，加入维持液B (含0.5%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.8)，30-34°C条件下贴壁培养；144小时后收获培养液，按实施例1相同方法进行蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，编号GV1 ;小鼠脑腔法测定病毒滴度为 4.6 LogLD50/mL.
实施例3 病毒株GNV1的制备
实施例2制备的GV1病毒悬液，，脑腔接种体重8-10g裸鼠，接毒量20ul/只，72-96小时后无菌取脑，按实施例1相同方法制备病毒悬液，编号GNV115小鼠脑腔法测定病毒滴度为
8.02 LogLD50/ml。实施例4 病毒株GNV6的制备
实施例3制备的GNVi病毒，按实施例2和实施例3方法进行VeiO细胞和裸鼠交替传代，重复5次,制备Vero细胞培养毒种,该毒种累计经6次Vero细胞传代,编号为GNV6,小鼠脑腔法测定病毒滴度为6.55 LogLD5tlAil。
实施例5
病毒株GNV9的制备
48小时贴壁培养的VeiO细胞，去原培养液，加入维持液B，同时接种实施例4制备的GNV6病毒液，接毒量为MOI = 0.01 —1.0，32— 34°C条件下静置培养，144小时后收获培养液，小鼠脑腔法测定病毒滴度；重复此过程，使病毒株GNV9在Vero细胞上连续传代3次,收获病毒液，编号为GNV9，小鼠脑腔法测定病毒滴度为7.83 LogLD5tlAil。实施例6 病毒株GNV12的制备
10cm2塑料培养皿培养Vero细胞，长满至单层时去培养液，加入0.4ml实施例5制备的并经IO3倍稀释的GNV9病毒液，摇动培养皿使病毒液均匀涂布到细胞层上，37°C静置45分钟，加入8ml半固体M199培养基(含50mM Hepes-0.lmg/ml甲基纤维素-0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.8—8.0) 34°C、5%C02条件下培养144小时，倒置显微镜下可见因病毒侵蚀的细胞病变斑，挑选5个病变斑，编号分别为GNVltl-U GNV1(l-2、GNV1(l-3、GNV1(l-4、GNV10-5,微型注射器吸出蚀斑中央的培养液0.1ml,接种到长满单层Veix)细胞的12孔板，每孔加入2ml维持液B，32—34°C、5%C02条件下培养144小时，收获病毒培养液，编号分别为GNV11-UGNVn-2、GNVn-3、GNVn_4、GNVn-5 ;每个编号分别吸取Iml病毒培养液，转接至长满单层Vero细胞的175cm2培养瓶，加入50ml维持液B，32— 34°C、5%C02条件下培养144小时，收获病毒培养液，编号分别为GNV12-1、GNV12-2、GNV12-3、GNV12-4、GNV12-5 ；ELISA方法测狂犬病毒抗原量、小鼠脑腔法测狂犬病毒滴度、NIH方法测培养原液的狂犬病毒保护效力，结果见表1:
表1 5个单克隆纯化毒株三项疫苗相关指标检测结果
权利要求
1.高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于:包括如下步骤: (1)鼠脑毒种的扩增和纯化 从国内外被普遍认可的病毒保藏机构取回aG株或经动物脑组织传代建株的狂犬病毒固定株，病毒接种于20-25日龄豚鼠脑腔，豚鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，加入维持液A:含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0后，研磨脑组织制成匀浆，高速离心除去沉淀，上清液经蔗糖密度梯度超速离心3-5小时，收取蔗糖浓度为45%-55%的组份，透析去除蔗糖，稀释制成滴度为9.0-10.0LogLD50/ml病毒悬液； (2)鼠脑病毒对VeiO细胞:非洲绿猴肾细胞的适应培养 贴壁培养24-72小时的Vero细胞，用胰蛋白酶消化并离心收集细胞；加入含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，制成密度为5X 105_2X 106cells/ml的细胞悬液；按病毒:细胞为1:1——I: 100的量加入步骤(I)制备的病毒悬液，25-40°C条件下放置10-60分钟；加入含5-10%牛血清的M199培养基，PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5X IO5-1X 105cells/cm2，37°C条件下贴壁培养；24_48小时后培养液更换成含0.5%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，30_34°C条件下贴壁培养；96_144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒； (3)Vero细胞培养病毒在裸鼠脑组织中扩增 步骤(2)得到的病毒悬液接种裸鼠脑腔，裸鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，按步骤一同样方法制备病毒悬液； 病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代 重复步骤(2)和步骤(3)，病毒在裸鼠脑组织和VeiO细胞上交替传代2-10次，制备Vero细胞传代培养的病毒悬液；` (5)可使Vero细胞适应的病毒突变体包括高免疫原性的突变体不断得到优选的方法: 病毒在VeiO细胞上连续传代 步骤(4)得到的病毒悬液接种贴壁培养的Vero细胞，32-34°C培养72-168小时，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定病毒滴度，并在Vero细胞上连续传代，直到病毒滴度高于`7.5LogLD50/ml ； (6)可使VeiO细胞适应的病毒突变体包括高免疫原性的突变体进一步得到优选 病毒单克隆纯化、筛选和保存建株 步骤(5)得到的滴度高于7.5LogLD50/ml的病毒培养液，按文献方法制备Vero细胞的病毒蚀斑，微型注射器吸取单斑病毒培养液，经Vero细胞扩大培养,收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法测定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活标定病毒免疫原性，选取病毒滴度高于7.5LogLD5(l/ml、免疫原性比活高于2.0的多个单斑病毒培养液分别进行分装、冷冻干燥后保存于_20°C冰箱； 对保存的毒种进行基因组序列分析，并与起始鼠脑毒种比较，病毒基因组的碱基序列和病毒蛋白的氨基酸序列均出现明显差异； (7)选育毒种的传代稳定性分析 步骤六得到的若干株候选毒种，在VeiO细胞上连续传15代以上，每代或隔三代进行一次检定:小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法测定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活标定病毒免疫原性、病毒基因组序列分析和病毒蛋白氨基酸序列分析测定毒种遗传稳定性，选取以上各项检定数据至少15代以内保持稳定的候选毒种作为疫苗生产用毒种； 上述的百分含量为质量百分含量。
2.根据权利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于:所述的病毒在裸鼠脑组织和VeiO细胞上交替传代5-8次，制备VeiO细胞传代培养的病毒悬液。
3.根据权利要求1或2所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于:所述的病毒在裸鼠脑组织和VeiO细胞上交替传代6次，制备VeiO细胞传代培养的病毒悬液。
4.根据权利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于:所述的含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培养基中胰蛋白酶的浓度为0.01%—0.1%, EDTA的浓度为0.1 — ImM、牛血清白蛋白的浓度为0.5 —1%。
5.高免疫原性狂犬病毒固定株在狂犬疫苗研发中的应用，其特征在于:应用方法如下: 将选育的疫苗生产用毒种，接种方瓶、转瓶或生物反应器培养的Vero细胞，32-34°C培养72-168小时，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度，均高于7.0LogLD5ciAil ；β-丙内脂方法或甲醛方法灭活病毒，NIH方法测定原液效力，均高于5.0IU/ml ;蔗糖密度梯度超速离心方法纯化灭活后的病毒培养液，收取45-55%蔗糖浓度的组份，透析法除蔗糖，测蛋白含量，按5ug/ml蛋白含量分装，加入人血白蛋白作保护剂，冷冻干燥制成疫苗，NIH方法测定原 液效力；ELISA方法测抗原含量。
全文摘要
本发明涉及高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在疫苗开发中的应用，属于生物技术领域；该方法包括如下步骤(1)鼠脑毒种的扩增和纯化，(2)鼠脑病毒对Vero细胞的适应培养，(3)Vero细胞培养病毒在裸鼠脑组织中扩增，(4)病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代，(5)病毒在Vero细胞上连续传代，(6)病毒单克隆纯化、筛选和保存建株，(7)选育毒种的传代稳定性分析，获得的候选毒种作为疫苗生产用毒种进行应用；以该方法选育的新狂犬病毒固定株，可在Vero细胞上高滴度扩增；扩增的病毒具有比现有的狂犬病毒固定株更高的免疫原性；在Vero细胞上连续多次传代依然保持生物学、遗传学和其他特性的稳定性，可用于大规模、工业化生产免疫保护效果更好、安全性更高的狂犬病疫苗。
文档编号C12N7/00GK103146655SQ201310099700
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者艾文, 沈名锋, 刘钿莲 申请人:广州银河阳光生物制品有限公司