一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用的制作方法

文档序号:539292阅读:1440来源:国知局
专利名称:一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一种植物表达载体的构建及应用,具体涉及一种植物表达载体pG II 0229-GUS的构建及应用,属于生物技术领域。
背景技术
甘鹿(Saccharum Complex)是最主要的糖料作物,鹿糖占世界食糖总产的76%,占我国食糖总产的92% ;甘蔗也是最重要的生物质能源作物之一,是迄今大田栽培作物中单位面积生物量和燃料乙醇产量最大的C4植物。甘蔗品种改良对产业科技进步贡献率高达60%,但是甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物,遗传背景非常复杂,表现为异源多倍体和多倍的非整倍体,染色体个数40 120个不等,变化幅度之大为其它作物所不及,常规有性杂交育种,从实生苗开始一般需要10 13年才能从10 30万株分离群体中培育出I个达到审(鉴)定要求的品种。现代分子生物学的发展和研究技术手段的进步,使品种的定向改良和目标性状育种成为可能。利用转基因技术改良甘蔗品种具有独特的优势,原因在于:(1)甘蔗属于转基因安全等级为I级的工业原料作物,批准转基因甘蔗产业化应用相对容易;(2)甘蔗又是无性繁殖作物,只要选到优良的单株就可以通过离体无性繁殖的方式,快速扩大群体并保持遗传上的稳定性。目前甘蔗转基因技术主要有两个途径,一是基因枪轰击法,二是农杆菌介导法,二者在甘蔗遗传转化上已经有应用实例,但是这两种技术在甘蔗转基因应用上,转化效率都很低。为了提高甘蔗转化效率,仍需进一 步对转化体系进行优化。但是目前用于体系优化的瞬时表达载体转化效率低,不利于对甘蔗遗传转化体系的优化。为此,为了建立更好的甘蔗转基因优化体系,我们探讨了一个新的瞬时植物表达载体构建及其在甘蔗遗传转化上的应用,目的是获得一个瞬时表达效率高的载体,从而能更有效地对甘蔗遗传转化体系进行优化,进而建立一种可实现甘蔗高效转化的技术方法,为甘蔗转基因改良提供技术支撑。

发明内容
本发明的目的是提供一种植物表达载体pG II 0229-GUS的构建方法及应用。针对现有甘蔗遗传转化体系优化时所用载体瞬时表达效率不高问题,提供一种转化效率高的载体。通过克隆获得瞬时基因表达盒,进而将其构建到植物表达载体中,获得一个新的瞬时植物表达载体,提高转化效率,从而建立更好的甘蔗外源基因遗传转化体系。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种植物表达载体pG II 0229-GUS的构建方法,包括引物设计、基因克隆和载体构建;其特征在于操作步骤如下:
1、引物设计:人工设计合成特异引物序列
Forward primer: 5’ - GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’
Reverse primer: 5’ - GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’ ;
2、PCR扩增:PCR 反应体系是 10XPCR Buffer 2.5 μ 1,dNTP 2.0 μ 1,10 μ mol/L的 Forward primer 1.0 μ 1,10 μ mol/L 的 Reverse primer 1.0 μ 1,5 U/μ I 的 Ex Taq酶 0.125 μ 1,100 ng/ μ I 的 DNA模板 1.0 μ I,加 ddH20 至终体积 25 μ I ;PCR程序是 95°C预变性5 min,95°C变性30 s,56°C退火30 s,72°C延伸3 min,30个循环,最后72°C延伸10min ;所述DNA模板是以pCAMBIA2301质粒为DNA模板;
3、载体构建:将步骤2的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,回收目的片段I,并将获得的目的片段I用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切,回收目的片段II,同时将pGreenI10229质粒DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切,回收目的片段III,将回收的目的片段II和目的片段III用T4-DNA连接酶进行连接,并将连接产物转化至大肠杆菌DH5ci中,挑取阳性克隆验证,获得pG II 0229-GUS载体;所述目的片段I是指用特异引物扩增出的含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和nos终止子的核酸片段;目的片段II是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切目的片段I后2927bp的核酸片段;目的片段III是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切pGreenI10229质粒DNA后4406bp的核酸片段;所述琼脂糖凝胶电泳,参照《分子克隆》工具书中琼脂糖凝胶电泳的方法;所述将连接产物转化至大肠杆菌DH5 α中,转化方法参照《分子克隆》工具书中用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的方法;所述酶切方法,参照限制性内切酶的说明书;所述回收方法,参照胶回收试剂盒说明书;所述用T4-DNA连接 酶进行连接方法,参照T4-DNA连接酶操作说明书;
所述携带⑶S基因的植物表达载体pCAMBIA2301、根癌农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensyM株.EHA105、植物表达载体pGreenI10229、大肠杆菌DH5 α ,均由商业购买获得。本发明的一种植物表达载体pG II 0229-GUS,可以在农杆菌侵染转化上应用,也可以在基因枪轰击转化上应用。若⑶S基因成功导入甘蔗组织细胞并在其中表达,则甘蔗心叶被染成蓝色。对构建获得的植物表达载体pG II 0229-GUS与原植物表达载体pCAMBIA2301在农杆菌侵染转化和基因枪轰击转化上的应用进行试验,结果如表I和表2所示。表I的试验结果表明,甘蔗心叶在进行农杆菌侵染转化时,植物表达载体pG II 0229-GUS比原来的植物表达载体PCAMBIA2301的瞬时表达率提高105.7%,经显著性测验,二者之间呈极显著差异。表2的试验结果表明,甘蔗心叶在进行基因枪轰击转化时,植物表达载体pG II 0229-GUS比原来的植物表达载体PCAMBIA2301的瞬时表达率提高103.1%,经显著性测验,二者之间呈极显著差
巳表I农杆菌侵染转化时不同植物表达载体GUS瞬时表达率的影响
权利要求
1.一种植物表达载体pG II 0229-GUS的构建方法,包括引物设计、PCR扩增和载体构建;其特征在于: (O引物设计:人工设计合成特异引物序列Forward primer: 5’ - GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’Reverse primer: 5’ - GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’ ; (2) PCR 扩增:PCR 反应体系是 IOXPCR Buffer 2.5 μ I, dNTP 2.0 μ 1,10μ mol/L 的 Forward primer 1.0 μ I, 10 μ mol/L 的 Reverse primer 1.0 μ I, 5 U/ μ I的 Ex Taq 酶 0.125 μ 1,100 ng/ μ I 的 DNA 模板 1.0 μ 1,加 ddH20 至终体积 25 μ I ;PCR程序是95 °C预变性5 min,95 °C变性30 s,56°C退火30 s,72°C延伸3 min,30个循环,最后72°C延伸10 min ;所述DNA模板是以pCAMBIA2301质粒为DNA模板; (3)载体构建:将步骤(2)的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,回收目的片段I,并将获得的目的片段I用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切,回收目的片段II,同时将pGreenI10229质粒DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切,回收目的片段III,将回收的目的片段II和目的片段III用T4-DNA连接酶进行连接,并将连接产物转化至大肠杆菌DH5ci中,挑取阳性克隆验证,获得pG II 0229-GUS载体;所述目的片段I是指用特异引物扩增出的含有35s启动 子、GUS瞬时表达基因和nos终止子的核酸片段;目的片段II是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切目的片段I后2927bp的核酸片段;目的片段III是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切pGreenI10229质粒DNA后4406bp的核酸片段。
2.一种植物表达载体pG II 0229-GUS在农杆菌侵染转化上应用。
3.一种植物表达载体pG II 0229-GUS在基因枪轰击转化上应用。
全文摘要
本发明涉及一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用。植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法,包括引物设计、PCR扩增和载体构建。本发明设计的特异引物通过PCR扩增获得的目的片段,包含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和NOS终止子,是一个完整的基因表达盒;植物表达载体pGⅡ0229-GUS只有7333bp,载体质粒小,含有左右边界,可以在农杆菌侵染转化上应用,也可以在基因枪轰击转化上应用。在遗传转化甘蔗时,GUS的瞬时表达率达到65%以上,适用于甘蔗,也适用于其他植物。
文档编号C12N15/66GK103146736SQ201310102319
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者高世武, 林庆良, 郭晋隆, 许莉萍, 王天池, 阙友雄 申请人:福建农林大学
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