一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法

文档序号:512760阅读:611来源:国知局
一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种医学诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法,其主要特征是取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为21-三体、18-三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的贴壁生长活细胞,以转基因导入借T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和SV40LTag?DNA所构建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)质粒,使之与细胞DNA整合,G418筛选整合有重组子的细胞株,作传代扩增、冻存,再提取这些染色体数目异常细胞株,按质控所需比例混合,使原先每例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为含有一定比例的5种染色体异常的嵌合体质控细胞株,增加了鉴别诊断、嵌合体诊断的难度,备作常见染色体数目诊断的质控细胞株,标本易得且将废弃的多余细胞转化为有效的永生化质控细胞。
【专利说明】一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法,主要应用于 医学领域的产前诊断实验室作常见染色体数目异常诊断的技术考核、室内质控和室间质 评。

【背景技术】
[0002] 染色体是细胞核中的遗传物质,人类有23对染色体,其中22对为常染色体,1对为 决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因,其中DNA占90%以上,RNA含量 随细胞周期及生长情况而有所变化,一般占1%?10%。
[0003] 染色体结构异常、数目异常及嵌合体,临床上表现为染色体病,属于常见的出生缺 陷,如先天愚型、原发性闭经、两性畸型等。染色体结构异常包括染色体易位、缺失、倒位、环 状等;染色体数目异常是指多出或缺少1条或数条染色体;嵌合体核型是指同一病例个体 并存数种染色体核型。目前诊断染色体结构和数目异常的常规方法是染色体核型分析,即 用被检的组织或细胞,经过细胞培养、〇. 02 μ Ι/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、 0.075mol/L KC1低渗、甲醇-冰乙酸(3 : 1)固定等染色体制片程序后,再经胰酶消化、G 显带、染色体核型分析,从而作出染色体结构和数目是否异常的判断,但染色体核型分析需 经细胞培养和制片,一般需2?3周后才能作出诊断报告,不能达到快速诊断的目的。近年 来开展的荧光原位杂交技术,能快速作出常见染色体数目是否异常的诊断,一般在24小时 就能作出诊断报告,因为产前诊断中的重大遗传病如21-三体、18-三体、13三体、性染色体 数目异常均属常见染色体数目异常,均可经荧光原位杂交作出快速诊断,所以近年来荧光 原位杂交技术已被越来越广泛地应用于被定义为常见染色体数目异常的21-三体、18-三 体、13三体、性染色体异常(X与Y染色体)的产前诊断。
[0004] 作为所开展的各类实验诊断项目,均应有相应规范的质量控制措施。实验室的质 量控制是确保实验诊断结果准确性的前提,已成为政府行为。为了加强实验室的质量控制, 我国于1982年成立了卫生部临床检验中心,下设室间质评办公室,专职从事于实验诊断项 目的质量控制。卫生部[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标 准实施细则》以及大量的文献均指出,实验室必须有规范的质量控制标准,所开展的实验诊 断项目必须参加卫生部临床检验中心组织的室间质评。自1982年以来,在临床检验学科先 后开展了临床实验的室内质控、室间质评。包括了对各检验项目的实验前、中、后以及仪器、 试剂和实验人员的质量控制。质量控制已渗透到临检、生化、微生物、免疫、基因、细胞形态 学诊断等各个实验项目。实验室的质量控制已成为开展实验诊断项目的准入制度、成为医 院等级评审的重要标准。
[0005] 产前诊断的质量控制已引起日益重视。随着我国对生殖健康和出生缺陷工作的 是益重视,近年来各省市均建立了产前诊断中心,开展了 21三体综合症、18三体综合征、 神经管畸形等重大出生缺陷的产前筛查和产前诊断,其中与重大出生缺陷相关的胎儿羊水 染色体异常的诊断已成为目前产前诊断的主要项目。由于产前诊断是新开展的学科,大多 专业人员的技术经验较为缺乏,特别是对于疑难、罕见病例、国内外首报病例以及如猫叫综 合症等染色体异常不明显但临床后果严重的病例,误诊现象时有发生。我国国家主席令 (1994年10月27日第三十三号)公布的"产前诊断法规标准"以及国务院办公厅[国发办 (1999) 15号]转发卫生部"关于做好提高出生人口素质工作意见"的通知中均强调指出, "各省、市产前诊断中心必须加强产前诊断的质量控制、严把质量关"。
[0006] 产前诊断的质量控制是许多学者致力于研究的重要课题。国外有较多的文献报 道了产前诊断质量控制的重要性,Sikkema-Raddatz B等对产前细胞遗传学诊断的细胞培 养及制片过程的影响因素作了深入的研究,提出了室内质量控制的方法;Fries N和Merz E等提出了影像学产前诊断的质量控制方法;Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制; 在2002?2004年期间,Bastien P等对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间 质量评价,认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重 要的作用。
[0007] 虽然我国行政主管部门以及学术界十分重视产前诊断的质量控制(包括室内质 控和室间质评),但因没有可行的质控物,所以无法开展实质性的质量控制。也就是说,要开 展产前诊断的室间质评和室内质控,首先必须要有质控物。研制可行的质控物、开展产前诊 断质量控制是质量管理人员以及本专业技术人员长期以来想方设法解决但始终没有解决 的难题。
[0008] 我们经长期的研究和探索,设想如果能成功研发常见染色体数目异常永生化质控 细胞,再将这种细胞由主管部门分发到各级产前诊断实验室,同步于产前诊断的染色体病 诊断,开展质量控制,考核各实验人员对常见色体病数目异常的诊断能力,对增加专业人员 对疑难病例的诊断经验、控制实验条件、减少误诊、提高产前诊断的准确性,具有重要的意 义。
[0009] 国外文献报道,猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。SV40T抗原 基因的导入能加快转化细胞的生长速率,永生化细胞在体外多次传代后,仍具有相对稳定 的增殖特性和功能状态。
[0010] 在产前诊断中,常有一些诊断报告后剩余的病例活细胞,本可用作质量控制细胞, 但因为这类细胞未作特殊处理,很易死亡、难以大规模扩增以供许多实验室反复多次作质 控使用,所以就难以用作质控细胞。


【发明内容】

[0011] 为了解决产前诊断实验室作常见染色体数目异常诊断中无可行质控物的问题,本 发明人提出了本发明。
[0012] 本发明的目的是要提供一种用于医学领域的产前诊断实验室作技术考核、室内质 控和室间质评的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备方法。
[0013] 本发明的目的是这样实现的:取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊 为常见染色体数目异常之一的21-三体、18-三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的 呈贴壁生长的原代或传代活细胞,以转基因技术导入借T4DNA连接酶连接同时经BamHI 酶切的pcDNA3. 1 (-) DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA所构建的 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)重组质粒,使重组子与细胞DNA整合,以G418筛选整合有重组子的 细胞株,作传代扩增后冻存细胞株,然后提取这些常见染色体数目异常的细胞株,按质控所 需比例混合,使原先每例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为含有一定比例的5种染色 体异常的嵌合体质控细胞株,集中保存,备作荧光原位杂交等常见染色体数目异常诊断的 质控细胞株。
[0014] 本发明以因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常 之一的21-三体、18-三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代 活细胞为原始细胞,标本易得(如2012年本室发现21-三体43例、18-三体28例、13三 体7例、X染色体数目异常15例、Y染色体数目异常12例)且将废弃的剩余细胞转化为有 效的质控细胞株;以转基因技术导入SV40LTag-pcDNA3. 1(_)重组质粒建成的质控细胞株 具有永久生存、无限扩增的性能,可按需复制足够的细胞株以满足质控要求;将5类各具单 一染色体数目异常的细胞株按质控所需比例混合后,使原先每例细胞株仅有单一染色体数 目异常转变为并存一定比例的5类染色体异常的易误诊的嵌合体细胞株,从而增加了鉴别 诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性,以疑难病例考核诊断水平、作室内质控和室间质 评,对及时发现质量问题、制定改进预案、提高诊断水平具有意想不到的效果。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1是本发明制备的一种18-三体绒毛组织细胞(代表性细胞)的质控细胞系。
[0016] 图2是本发明提出的5种染色体数目异常细胞等比例混合的质控细胞株的荧光原 位杂交结果模拟图。
[0017] 如图1,细胞传代至第75代、培养至第9天时,呈圆形、梭形、铺满瓶底,其细胞生长 汇合率达95%以上。
[0018] 如图2,包含有5个细胞,其中细胞1为18-三体细胞,1. 1、1.2、1.3各代表1条18 号染色体,比正常细胞多了 1条18号染色体;细胞2为少1条性染色体的细胞,2. 1代表1 条X染色体,正常细胞应还有1条X染色体或1条Y染色体;细胞3为多1条Y染色体的 细胞,3. 1、3. 2各代表1条Y染色体,正常细胞只有1条Y染色体;细胞4为13-三体细胞, 4. 1、4. 2、4. 3各代表1条13号染色体,细胞内多了 1条13号染色体,正常细胞为2条13号 染色体;细胞5为21-三体细胞,5. 1、5. 2、5. 3各代表1条21号染色体,细胞内多了 1条21 号染色体,正常细胞为2条21号染色体。

【具体实施方式】
[0019] 1、原始细胞:所用的原始细胞来源于因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确 诊为常见染色体数目异常之一的21-三体、18-三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的 呈贴壁生长的原代或传代活组织细胞;其原代或传代活组织细胞也可以涉及染色体结构异 常的活组织细胞或除5种常见染色体数目异常以外的第1号至第22号染色体数目异常活 组织细胞。细胞类型为胎儿羊水、绒毛组织等细胞。
[0020] 2、SV40大T抗原DNA的提取:① SV40DNA酶切:从市售购买含有大T抗原基因的 SV40冰冻干粉或SV40质粒,溶解于适量的H20或TE缓冲液中,加2uL10X酶切缓冲液和 18uL H20,加限制性内切酶BamH I(l-5U/ugDNA),37°C温育lh,75°C加热15min,灭活酶,力口 入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0. 5mol/L EDTA)终止反应以备电泳。②SV40DNA电 泳:取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10%琼脂糖凝胶,倒入已封好的凝胶灌制平台上, 插上样品梳,待胶凝固后从制胶平台上除去封带,拔出梳子,放入加有足够电泳缓冲液的电 泳槽中,缓冲液高出凝胶表面约1mm,用适量的10X加样缓冲液制备DNA样品,然后用移液 器将样品加入样品孔中,并同时做合适的DNA分子量标准对照物,接通电极,使DNA向阳极 移动,在1-lOV/cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时,关闭电源。③从琼脂糖 中分离约2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以 防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中,向透析袋内加入2ml电 泳缓冲液,使之浸没凝胶,并排空汽泡,将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行), 加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm),接通电源,150伏电洗,在紫外灯下观察待DNA 全部移出凝胶,改变电场方向继续通电1分钟,从透析袋中吸出缓冲液于l-5ml Eppendorf 管中,加入1. 5倍体积正丁醇,混匀抽提去EB,在台式离心机上最高速2分钟,吸去上层正 丁醇溶液,如此重复二次,自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次,上 清转入另一 Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc、2倍体积预冷无水乙醇,于20°C过 夜,12000g,4°C下离心10分钟,得DNA沉淀,弃上清,加70%乙醇洗涤2次,弃干乙醇,加入 50μ 1 TE 溶解 DNA。
[0021] 3、SV40大Τ抗原DNA与pcDNA3. 1基因载体的连接:取9 μ 1上述DNA成份 (0· l-5yg)、10y 12Χ 连接缓冲液、1μ 110mmol/L ATP、T4DNA连接酶(20 ?500 粘性末端单 位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3. 1空载体混合,15°C温育24h,构建成SV40T/pcDNA3. 1 重组子。
[0022] 4、SV40T/pcDNA3. 1重组子的扩增、分离与鉴定:①大肠杆菌感受态的制备:其基 本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化,用 CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌,本法适用于大 多数大肠杆菌菌株,操作过程简述如下:从37°C培养16?20h的新鲜平板中挑取一个单菌 落(如大肠杆菌DH52),或lml新鲜的16?20h过夜培养物,转到一个含有lOOmlLB培养基 的1L或500ml烧瓶中,于37°C剧烈振摇培养约2?3h (旋转摇床200?300r/min),每隔 20?30min测量0D600值?0. 4,在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯 离心管中,在冰上放置10?20min,于4°C用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头) 以4000r/min离心10min,以回收细胞,倒数培养液,将管倒置lmin以使最后残留的痕量培 养液流尽,以l〇ml用冰预冷的0. lmMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上,于4°C用SorvallGS3 转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞,倒出培养液,将管倒置 lmin以使最后残留的痕量培养液流尽,每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0. 1M CaCl2重悬 每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70°C贮存备用,用冷却的无菌 吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ 1转移到无菌的微量离心管中,每管加入DNA或连 接反应混合物(体积彡1〇μ 1,DNA彡50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min,将 离心管放到预加温到40°C的循环水浴中的试管架上,放置90s?2min,不要摇动试管,快速 将管转移到冰浴中,使细胞冷却1?2min,每离心管加800 μ 1S0C培养基,用水浴将培养基 加温到37°C,然后将管转移到37°C摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗 生素抗性标记基因,将适当体积(每个90mm平板可达200μ1)已转化的感受态细胞转移到 含200mmol/LMgS04和相应抗生素的S0B培养基上,将平板置于室温至液体被吸收,倒置平 皿,于37°C培养,12?16h后可出现菌落。②重组子的筛选、扩增与提取:用无菌牙签或灭 菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级 肉汤培养基)中,培养过夜后,再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶 中,再于37°C培养至饱和状态(0D 6C4,为提高产量,应采用表面积较大及带折流板的烧 瓶以尽量增大通气度,振摇速度应大于400r/min),于4°C,6000g离心lOmin,用4mL GTL溶 液重悬沉淀,并转移到一个容积彡20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20°C或_70°C 无限期保存),加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液,重悬沉淀,于室温放置lOmin, 加入10mL新配NaOH/SDS溶液,并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠,于冰上放置 lOmin,加入7. 5mL乙酸溶液,用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放 置lOmin,于4°C,20000g离心lOmin,将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中,如果有可 见的飘浮物可用数层纱布过滤,加入0. 6倍体积的异丙醇,颠倒混匀,室温放置5?lOmin, 于室温,1500g离心lOmin,加入2mL70%乙醇轻轻洗涤沉淀,然后短暂快速离心,吸去乙醇, 并真空干燥(沉淀可在4°C长期保存)。③重组子的鉴定:上述从感受态大肠杆菌中提取的 DNA (含重组子SV40T/pcDNA3. 1),同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切,10g/L琼脂糖凝 胶电泳鉴定,获得大小约2600bp及5600bp的2条带,前者符合GenBank中SV40T片段的大 小。
[0023] 5、SV40T/pcDNA3. 1重组子导入染色体异常组织细胞及其阳性克隆的筛选与扩 增:①染色体异常组织细胞的收集与培养:以无菌操作提取在作其他实验或其他检查后多 余、废弃的染色体异常组织细胞,以细胞终浓度约为lXl〇5/mL备用,取上述呈单个分散 的细胞或经处理后成为单个分散的细胞接种于含5?10nm 〇l/L胰岛素、20%胎牛血清的 RPMI1640液中或接种于含20 %胎牛血清、5?10nm〇l/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基 中,置于37°C,体积分数5 % C02培养箱内,细胞贴壁培养约3?4天、细胞形态为梭形、小 园形细胞不到10%、贴壁细胞的汇合率达75%?85%、处于刚进入对数生长期时,即考虑 收集培养细胞,先吸干净培养瓶中的培养液,加入l_2ml0. 01 %的胶原酶II液(以消化液 能覆盖整个瓶底为准),静置2-10min (显微镜下动态监测),吸去胶原酶II液,加入低糖 DMEM或RPMI1640培养液,用吸管吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,形成细胞悬液,转入 离心管离心沉淀,去上清液,细胞沉淀用上述培养液清洗2次后,制成悬液,用作重组子导 入。②SV40T/pcDNA3. 1的导入:在上法分离所得细胞中,选用脂质体转染法,将上述2X105 个细胞接种于35mm培养皿中,在37°C C02培养箱培养24?36h,使细胞生成单层、细胞形 态为梭形、仅见少于10%小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55%?65%、处于将进入或刚 进入对数生长期时,即转染重组子SV40T/pcDNA3. 1,在1. 5ml微量离心管中制备下列溶液: 管A,将SV40T/pcDNA3. 1溶于100 μ 1无血清培养液中;管B,将20 μ 1 Lipofectamine溶 于80 μ 1无血清培养液中,将管A和管B混匀,室温下置45min,吸去细胞培养液后,用无血 清培养液洗涤细胞2次,在Lip〇f ectamine-SV40T/pCDNA3. 1混合物中加入lml无血清培养 液,轻轻混匀,再滴加至细胞培养皿内,然后加入lml无血清培养液,在C02培养箱培养10h, 吸出转染液,加4ml完全培养液继续培养16h,弃去培养液,更换浓度为400mg · Γ1的G418 培养液继续培养,8?10天后选择单个细胞集落进行亚克隆,扩大培养后再加大G418浓度 到800mg · Γ1,将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代扩增,另外染色体异 常组织细胞与SV40或EB病毒共同培养后,感染了病毒DNA并发生整合的染色体异常组织 细胞进行传代扩增。
[0024] 6、染色体数目异常组织细胞株的传代、扩增:收集上述经脂质体转染法导入SV40 大T抗原基因的阳性单克隆细胞集落,以低糖DMEM或RPMI1640培养基配成约1 X 105/mL的 细胞悬液,接种于数瓶20?50cm2培养瓶中,加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nm 〇l/L胰岛 素的低糖DMEM或RPMI1640培养基,如图1所示,使细胞贴壁生长,至汇合率达80?85%、 处于对数生长期的前期时收集细胞,再按上述步骤传代培养,如此反复传代接种、培养,记 录代数并观察细胞生长特点。如图1所示,细胞传代至第75代、培养至第9天时,呈圆形、 梭形、铺满瓶底,其细胞生长汇合率达95%以上,从第76代以后,传代细胞生长减慢、贴壁 稀疏。
[0025] 7、原液质控细胞株的制备:(1)原液活质控细胞株的制备:取生长状态良好、处于 对数生长期的不同世代的贴壁细胞,经过消化、终止和离心分离(1200r/min,6min),用含 二甲亚砜的冻存液0. 5?lml重悬细胞,细胞密度为5X105个/ml,加入冻存管,经4°C, 0. 5h ;-20°C,2h ;-70°C,过夜,入_196°C液氮冻存。(2)原液固定质控细胞的制备:(1)终止 培养、收获细胞前2?3h,加入浓度为20 μ g/ml的秋水仙素,每5ml培养基中用7号针头, 力口 3?4滴使最终浓度为0. 1 μ g/ml。轻轻摇匀后,再放入恒温箱内,继续培养2?3h,以积 累较多停止在中期的分裂象。(2)收获细胞:由恒温箱取出培养瓶,以0.25%胰蛋白酶消化 贴壁细胞5分钟,每次收获1瓶,用吸管充分吹打培养瓶瓶壁,使细胞全部脱离瓶壁,然后将 细胞液移至锥形离心管内,1500转/min,离心lOmin,去上清液。(3)低渗处理:加入37°C预 温的〇· 〇75mol/LKC18ml,反复吹打(约一百次)后,置37°C水浴箱中低渗处理25min左右。 (4)预固定:加入新鲜制备固定液lml (甲醇:冰醋酸=3 : 1),轻轻混匀。(5)离心:2000 转/min,离心lOmin,吸弃上清液。(6)固定:沿离心管壁慢慢加入固定液8ml,轻轻混勻,固 定lOmin。(7)离心:同上,吸去上清液。(8)再固定:加固定液8ml,混勻,固定lOmin。(9) 离心:同上,吸去上清液。(10)制备原液质控细胞悬液:根据细胞量多少,加入适量固定液, 充分混匀,制成浓度为l〇 5/ml的细胞悬液,保存备用。
[0026] 8、应用质控细胞株的制备:⑴应用活质控细胞株的制备:提取5例在不同时间制 备的、冻存于_196°C液氮中的染色体数目异常的原液活质控细胞株,以5例之比均为1 : 1 的等浓度、等体积或细胞数进行混合(如各取lml,混合液总体积为5ml),制成等比应用活 质控细胞株,理论上21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20%; 另外根据需要,取1例原液活质控细胞株与另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的体积比例 或细胞数比例进行混合,制成不等比应用活质控细胞株,含有不同类型和比例的染色体数 目异常,如某1例取lml与另1例取50ml混合,则理论上前者的嵌合体比例为2%,后者为 98% ;如某1例取lml与另外1例染色体正常的同浓度细胞悬液50ml混合,则理论上前者 的嵌合体比例为2%。此外,应活质控细胞株还可进行传代扩增后使用。(2)应用固定质控 细胞的制备:提取5例在不同时间制备的染色体数目异常的原液固定质控细胞,以5例之 比均为1 : 1的等浓度、等体积或细胞数进行混合(如各取lml,混合液总体积为5ml),制 成等比应用固定质控细胞,理论上21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的 核型各占20% ;另外根据需要,取1例原液固定质控细胞与另外的1例、2例、3例或4例按 1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ? 50的体积比例或细胞数比例进行混合,制成不等比应用固定质控细胞,含有不同类型和比 例的染色体数目异常,如某1例取lml与另1例取50ml混合,则理论上前者的嵌合体比例 为2%,后者为98%;如某1例取lml与另外1例染色体正常的同浓度细胞悬液50ml混合, 则理论上前者的嵌合体比例为2%。经如此反复传代扩增和混合不同病例的染色体数目异 常细胞所制备的质控细胞(株),不但数量足够的多,达到用之不尽,而且使原先一般每份 原液活质控细胞株或原液固定质控细胞中只有一种染色体数目异常转变为具有在同一份 应用活质控细胞株或应用固定质控细胞中同时含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染 色体数目异常的特征,从而增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性,标本易得 且将废弃的多余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室内质控及室间质评,在 室内质量控制、室间质量评价、提高诊断水平的应用中具有显著的效果。
[0027] 9、染色体数目异常永生化质控细胞库的建立:将上述在不同时间制备的固定质控 细胞(原液固定质控细胞和应用固定质控细胞)以(甲醇:冰醋酸=3 : 1的)固定液 配成浓度为l〇5/ml的细胞悬液,经分装、加满固定液至管口和封口后,按年、月、日的制备日 期及标本来源地址的大写英文字母编号,集中保存于_2〇°C,备作染色体数目诊断的质量控 制之用。同时将相应的5种染色体数目异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以 及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机,使用时从计算机中抽取待用质控细胞编 号,然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价;活质控细胞株(原液活质控细 胞株和应用活质控细胞株)以冻存液(5%二甲亚砜、95%胎牛血清)配成浓度为10 5/ml的 细胞悬液,经每管lml分装后,按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编 号,集中保存于_196°C液氮中,备作染色体数目诊断的质量控制之用。同时将相应的各种染 色体数目异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字 母编号录入计算机,使用时从计算机中抽取待用质控细胞编号,然后从质控细胞库中找出 相应的质控细胞作质量评价
[0028] 10、室内质控中的应用:从计算机中抽取质控细胞编号,然后从质控细胞库中找出 相应的质控细胞,发送到各实验室或相关专业技术人员,在收到质控细胞后,作为室内质控 物,与临床待作染色体数目异常诊断的标本在相同条件下作同步染色体数目诊断。如果质 控细胞的染色体数目诊断结果没有达到要求,则说明诊断方法的试剂、仪器、操作方法等方 面有问题,应查明原因、重新检测后报告结果。
[0029] 11、室间质评中的具体应用:
[0030] ①准备质控细胞:取1例或数例质控细胞,按需要的例次或比例混合,混合的质控 细胞株还可经扩增后发放使用。现以5例染色体数目异常质控细胞株等比例细胞数混合为 例,每种染色体数目异常的细胞各占20%。然后将质控细胞发送到各受试对象做室间质量 评价。
[0031] ②荧光原位杂交(FISH)检测质控细胞染色体数目及结果判定:各受试对象收到 质控细胞后,如为活质控细胞株,则可酌情对质控细胞株进行传代扩增后测试,以增加细 胞数;如为固定质控细胞,则直接测试。试剂采用瑞士雅培制药有限公司的AneuVysion 试剂盒,含有两个不同的杂交区域,共完成5条染色体的数目分析:第18号(Spectrum Aqua,青色)、X(Spectrum Green,绿色)、Y(Spectrum Orange,红色)号染色体为计数探 针(Chromosome Enumerating Probe,CEP),混合后杂交第 1 个区域;第 13 号(Spectrum Green,浅绿色)和21 (Spectrum Orange,紫红色)号染色体为区域特异性探针(Locus Specific Identifier,LSI),混合后杂交第2个区域。方法是取13和21号染色体为位点 特异探针,18、X和Y染色体为着丝粒探针,将质控细胞株(与实验室被检标本)同步,经 2000r/min离心lOmin,去上清,留沉淀0. 2ml,离心管中加入4ml胶原酶37°C温浴30min, 2000r/min离心lOmin,去上清,然后加入5ml预温的15mol/L KC1,在37水浴中低渗25min, 2000r/min离心lOmin,去上清。加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3 : 1)固定lOmin, 离心2000r/min离心lOmin去上清,反复两次。滴片,自然干燥老化。将制备好的标本片自 冰柜中取出,依次放人70 %、85 %、100 %乙醇中脱水,室温干燥,预处理好的玻片置73 °C, 70%甲酰胺中5min。在暗室中将两种探针混合液各10 μ 1加在玻片的靶区域,盖上盖玻片, 避免产生气泡,封片胶将盖玻片封好,置暗湿盒中42°C杂交过夜,清洗,在高倍镜下观察杂 交效果,每例标本计数60?100个细胞,记录杂交信号数目并采集图像,要求细胞核膜必须 完整,核内杂交信号明亮清晰无重叠,信号弥散及微弱均不作统计。
[0032] ③测试结果:经探针杂交后,细胞内的18号染色体显示青色的点,每条18号显示 1个青色的点,2条则显示2个青色的点,3条则显示3个青色的点;细胞内X(女性)染色 体显示绿色的点,每条X染色体显示1个绿色的点,2条则显示2个绿色的点,3条则显示3 个绿色的点;细胞内Y(男性)染色体显示红色的点,每条Y染色体显示1个红色的点,2条 则显示2个红色的点,3条则显示3个红色的点;细胞内的13号染色体显示浅绿色的点,每 条13号显示1个浅绿色的点,2条则显示2个浅绿色的点,3条则显示3个浅绿色的点;细 胞内的21号染色体显示紫红色的点,每条21号显示1个紫红色的点,2条则显示2个紫红 色的点,3条则显示3个紫红色的点。
[0033] 图2为5种染色体数目异常质控细胞等浓度等量混合、制片、荧光原位杂交所得结 果模拟图,如图2所示,细胞1为18-三体细胞,1. 1、1. 2、1. 3各代表1条18号染色体,细胞 内多了 1条18号染色体,有3个青色的点,正常细胞为2条18号染色体、2个青色的点;细 胞2为少1条性染色体的细胞,2. 1代表1条X染色体,只有1个绿色的点,正常细胞应还有 1条X染色体(1个绿色的点)或1条Y染色体(1个红色的点);细胞3为多1条Y染色体 的细胞,3. 1、3. 2各代表1条Y染色体,正常细胞只有1条Y染色体、1个红色的点;细胞4 为13-三体细胞,4. 1、4.2、4. 3各代表1条13号染色体,细胞内多了 1条13号染色体,有3 个浅绿色的点,正常细胞为2条13号染色体、2个浅绿色的点;细胞5为21-三体细胞,5. 1、 5. 2、5. 3各代表1条21号染色体,细胞内多了 1条21号染色体,有3个紫红色的点,正常细 胞为2条21号染色体、2个紫红色的点。
[〇〇34] ④结果评价:各受试实验室将结果包括染色体数目异常的种类、比例回报室间质 评组织者,由组织者对各室结果作统一评比成绩,找出误诊原因、讨论改正措施,以动态发 现质量问题、加强质量管理、提高诊断质量。
【权利要求】
1. 一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊断质控细胞株及其制备 方法,其主要特征是取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目 异常的剩余的贴壁生长活细胞,以转基因导入借T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的 pcDNA3. 1 (-)DNA 和 SV40LTag DNA 所构建的 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)质粒,使之与细胞 DNA 整合,G418筛选整合有重组子的细胞株,作传代扩增、冻存,再提取这些染色体数目异常细 胞株,按质控所需比例混合,制成疑难的常见染色体数目异常诊断质控细胞株,所用原始细 胞易得,且将废弃的多余细胞转化为可永久生存、无限扩增的永生化质控细胞,可按需复制 足够的细胞株以满足质控要求,多种染色体数目异常细胞按质控所需比例混合后使原先每 例细胞株仅有单一染色体数目异常转变为含有一定比例的多种染色体数目异常的嵌合体 质控细胞株,增加了鉴别诊断、嵌合体诊断的难度,用以染色体数目检测室内质控、室间质 评及技术水平考核,具有更有效的质量控制效果。
2. 根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊 断质控细胞株及其制备方法,其特征是常见染色体数目异常包含21-三体、18-三体、13三 体、X和Y染色体数目异常5类。
3. 根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊 断质控细胞株及其制备方法,其特征是SV40大T抗原DNA与常见染色体数目异常细胞DNA 整合制成了能传代至第75代、培养至第9天、仍呈圆形、梭形、铺满瓶底,其细胞生长汇合率 达95%以上的质控细胞株。
4. 根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊 断质控细胞株及其制备方法,其特征是按质控所需比例混合包含: 以5例染色体数目异常原液活质控细胞株之比均为1 : 1的等浓度、等体积或细胞数 进行混合(如各取lml,混合液总体积为5ml),制成等比应用活质控细胞株,理论上21-三 体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20% ; 以1例原液活质控细胞株与另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的体积比例或细胞数 比例进行混合,制成不等比应用活质控细胞株,含有不同类型和比例的染色体数目异常; 以5例染色体数目异常的原液固定质控细胞,以5例之比均为1 : 1的等浓度、等体积 或细胞数进行混合(如各取lml,混合液总体积为5ml),制成等比应用固定质控细胞,理论 上21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20% ; 以1例原液固定质控细胞与另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的体积比例或细胞数 比例进行混合,制成不等比应用固定质控细胞,含有不同类型和比例的染色体数目异常,如 某1例取lml与另1例取50ml混合,则理论上前者的嵌合体比例为2%,后者为98%。
5. 根据权利要求1、4所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常 诊断质控细胞株及其制备方法,其特征是每1份质控细胞包含有1?5种不同的染色体数 目异常,可同时用于相对应的1?5种染色体数目异常检测的质量控制,无需备用多份质控 物,使用方便、经济。
6. 根据权利要求1、4所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常 诊断质控细胞株及其制备方法,其特征是每1份质控细胞由1?5种不同比例的染色体数 目异常细胞组合而成,能设定染色体数目异常检出率(百分比)的界限和质量指标;5种染 色体数目异常质控细胞之间以及与正常细胞之间可配制2%?100%的某1种或数种染色 体数目异常的嵌合体质控细胞,能反映、控制低比例染色体数目异常的检测质量,或达到与 低比例染色体数目异常的实际病例的同步检测,具有更有效的质量控制和质量评价效果。
7. 根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊 断质控细胞株及其制备方法,其特征是染色体数目异常永生化质控细胞库包含:以固定液 (甲醇:冰醋酸=3 : 1的)为媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源 地址的大写英文字母编号的、细胞浓度为l〇5/ml的、由原液固定质控细胞和应用固定质控 细胞构成的固定质控细胞;以冻存液(5%二甲亚砜、95%胎牛血清)为媒介的、-196°C液氮 保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号的、细胞浓度为1〇 5/ ml的、由原液活质控细胞系和应用活质控细胞系构成的活质控细胞系。
8. 根据权利要求1所述的一种用于医学实验诊断质量控制的常见染色体数目异常诊 断质控细胞株及其制备方法,其特征在于,涉及以染色体结构异常、除5种常见染色体数目 异常以外的第1号至第22号染色体数目异常的细胞为原始细胞所制备的质控细胞株。
【文档编号】C12N15/85GK104059883SQ201310109781
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】翁炳焕 申请人:翁炳焕
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