一种基因测序方法

文档序号:512795阅读:342来源:国知局
一种基因测序方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因测序方法,其步骤如下:一、将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上;二、将互补的DNA引物与通用的DNA序列配对,并且引物上设有3’-OH官能团进行DNA延长的化学反应;三、通过DNA聚合酶的催化,把与待测序的DNA链碱基互补的荧光修饰核酸分子加入到引物链上;四、通过成像系统,读出每段DNA上带有的不同荧光信号;五、化学切除保护基团;六、进行下一轮的测序。本发明采用一种新的核苷酸修饰分子进行合成测序,用K2CO3水溶液进行化学切除,让边合成边测序得以顺利实现;采用3种荧光分子标记核苷酸,减少了荧光修饰分子和激光的使用,节约了成本,且测序过程更稳定。
【专利说明】一种基因测序方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因测序方法,主要用于生物的基因测序。
【背景技术】
[0002]在基础生物学研究和众多的应用领域,如诊断,生物技术,法医生物学,生物系统学中,基因序列已成为不可缺少的知识。具有现代的基因测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列,或多种类型的基因组测序和生命物种,包括人类基因组和其他许多动物,植物和微生物物种的完整基因序列。
[0003]如今基因测序正处在日新月异的进步之中,其突出特点是,测序通量大幅增长,原始数据中每个碱基的测序成本急剧下降。以前非常耗时耗资的研究项目如个人基因组测序,外显子基因组学研究以及对大量重要物种的测序等等在在短短几年之间变得越来越切实可行了。
[0004]第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格(Sanger)开创的双脱氧终止法。后来经过改进成为四色荧光桑格测序法,用在自动毛细管电泳测序系统中。此种方式不仅耗资庞大,花费人力无数,而且历时超过十年,但是由于其准确性高,所以作为基因组的"参照"序列而被采用。
[0005]之后出现了第二代基因测序技术,主要是Roche公司的焦磷酸测序法,Illumina公司的DNA合成终止法测序以及Life Technologies公司的DNA连接测序法。这些公司利用商业化提供的仪器,以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式,可以每周测出数十亿碱基对(Gbp)的DNA序列。以上方法得到一个人的基因组数据成本仍然在数十万美元
左右。

【发明内容】

[0006]本发明为了解决上述问题,提供一种基因测序方法。
[0007]为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:一种基因测序方法,其步骤如下:
[0008]一、将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上,然后固定在玻璃基底表面;
[0009]二、将互补的DNA引物与通用的DNA序列配对,并且引物上设有3’_0H官能团进行DNA延长的化学反应;
[0010]三、通过DNA聚合酶的催化,把与待测序的DNA链碱基互补的荧光修饰核酸分子加入到引物链上,其中,三种核酸分子具有荧光,一种没有荧光;
[0011]四、通过成像系统,读出每段DNA上带有的不同荧光信号,使用三种波长的激光分别先后照射样品,每种激光会激发相应的荧光基团,并且产生相应的荧光,通过滤波片后可以收集到该荧光信号,玻璃表面的每一点产生的信号都会被记录;
[0012]五、化学切除保护基团,3’ -OH上的终止基团,以及荧光分子和碱基之间的连接分子;
[0013]六、进行下一轮的测序。[0014]进一步的,所述步骤二中每条DNA链上每次只能加入一个核酸分子。
[0015]进一步的,所述步骤二中,在测序的玻片中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶,缓冲溶液,Mn2+在引物处进行扩增,缓冲溶液100mmol/L Tris-HCl pH = 7.8,20mmol/LMnCl2, 2mmol/L四种突光标记的dNTP, I单位的DNA聚合酶Thermosequenase,在恒温60°C,避光条件下反应30min。
[0016]进一步的,所述步骤三中,停止反应,用去离子水多次冲洗除去玻片表面的反应溶液。然后用lOOmmol/L Tris-HCl (pH = 7.8)缓冲溶液冲洗玻片表面。再用去离子水多次冲洗。最后用氮气吹干玻片表面。
[0017]进一步的,所述步骤四中,运行激光激发玻片程序,四种激光依次打开,每次一束激光通过预设光路进入物镜,并且聚焦到玻璃片表面,一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。
[0018]进一步的,所述步骤五中,使用饱和K2CO3水溶液与玻璃表面的DNA分子反应,完全切割荧光基团以及3’ -OH的保护基团。
[0019]进一步的,所述步骤二中,荧光修饰的核酸分子分子结构:
[0020]
【权利要求】
1.一种基因测序方法,其特征在于,步骤如下: 一、将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上,然后固定在玻璃基底表面; 二、将互补的DNA引物与通用的DNA序列配对,并且引物上设有3’-0H官能团进行DNA延长的化学反应; 三、通过DNA聚合酶的催化,把与待测序的DNA链碱基互补的荧光修饰核酸分子加入到引物链上,其中,三种核酸分子具有突光,一种没有突光; 四、通过成像系统,读出每段DNA上带有的不同荧光信号,使用三种波长的激光分别先后照射样品,每种激光会激发相应的荧光基团,并且产生相应的荧光,通过滤波片后可以收集到该荧光信号,玻璃表面的每一点产生的信号都会被记录; 五、化学切除保护基团,3’-OH上的终止基团,以及荧光分子和碱基之间的连接分子; 六、进行下一轮的测序。
2.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤二中每条DNA链上每次只能加入一个核酸分子。
3.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤二中,在测序的玻片中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶,缓冲溶液,Mn2+在引物处进行扩增,缓冲溶液100mmol/LTris-HCl pH = 7.8, 20mmol/LMnCl2, 2mmol/L 四种突光标记的 dNTP, I 单位的 DNA聚合酶Thermosequenase,在恒温60°C,避光条件下反应30min。
4.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤X中,停止反应,用去离子水多次冲洗除去玻片表面的反应溶液。然后用lOOmmol/L Tris-HCl (pH = 7.8)缓冲溶液冲洗玻片表面。再用去离子水多次冲洗。最后用氮气吹干玻片表面。
5.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤四中,运行激光激发玻片程序,四种激光依次打开,每次一束激光通过预设光路进入物镜,并且聚焦到玻璃片表面,一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。
6.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤五中,使用饱和K2CO3水溶液与玻璃表面的DNA分子反应,完全切割荧光基团,恢复碱基的原本结构不带任何其他修饰,以及切除3’ -OH的保护基团,恢复羟基结构。
7.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤X中,荧光修饰的核酸分子分子结构:
8.根据权利要求1所述的基因测序方法,其特征在于:所述步骤X中,荧光修饰的核酸分子分子结构:
【文档编号】C12Q1/68GK103602719SQ201310115492
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年4月7日 优先权日:2013年4月7日
【发明者】伍建 申请人:北京迈基诺基因科技有限责任公司
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