专利名称：一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺。
背景技术：
传统的用于外周血淋巴细胞染色体制备采用的培养基一般为在液体状态的基础培养基(如RPMI1640)的基础上添加一定量血清和植物血球凝集素(PHA)而成。利用PHA对处于Gtl期的淋巴细胞的刺激作用，使之进入分裂周期，从而能进行染色体核型分析。但液体状态的淋巴细胞培养基不利于室温下存放，其包含的活性物质如谷氨酰胺、PHA等易失活。即使在2_8°C低温存放，经一段时间后培养基的培养的淋巴细胞中可进行核型分析的处于分裂相数目显著下降。利用冻干技术制备培养基冻干粉是解决上述问题的方法。但到目前为止，并没有发现提供具体的培养基冻干工艺或方法的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺。本发明所采取的技术方案是: 一种淋巴细胞培养基的冻干粉生产工艺，包括如下步骤:
(1)配制培养基原液；
(2)将培养基原液过滤、冷冻干燥，得到冻干粉；
(3)往冻干粉中通入含有氮气和氧气的混合气体，即得产品。所述培养基原液含有如下组分:小牛血清、L型植物血球凝集素、RPMI1640培养基干粉、谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠。所述培养基原液中各组分的浓度为:小牛血清780 820 g/L、L型植物血球凝集素为8 12 mg/L、RPMI1640培养基干粉为9.5 10.5 g /L、谷氨酰胺为40 60 mM/L、4_羟乙基哌嗪乙磺酸为45 55 mM/L、碳酸氢钠为6.8 7.2 g/L。优选的，所述培养基原液中各组分的浓度为:小牛血清800 g/L、L型植物血球凝集素为10 mg/L、RPMI 1640培养基干粉为41.0 g/L 42.0 g /L、谷氨酰胺为50 mM/L、4_羟乙基哌嗪乙磺酸为50 mM/L、碳酸氢钠为7.0 g/L。步骤(2)所述过滤是指先用Ium孔径的滤器进行预过滤，然后用0.22 um孔径的滤器进行无菌过滤。步骤(2 )冷冻干燥工艺包括:
1)预冻:箱内温度降至一35 一 45°C，保持3 5小时；
2)升华:将冷凝器的温度降到一45 一 55°C以下，对整个系统抽真空；
3)升华开始，控制真空度在IOpa以下，搁板温度控制在一19 一 21°C，升华干燥11 13小时；
4)二次干燥:提高板层温度至7 9°C干燥3 5小时。
步骤(2 )冷冻干燥工艺包括:
O预冻:箱内温度降至一 40°c，保持4小时；
2)升华:将冷凝器的温度降到一50°C以下，对整个系统抽真空；
3)升华开始，控制真空度在10Pa以下，搁板温度控制在一 20°C，升华干燥12小时；
4)二次干燥:提高板层温度至8°C干燥4小时。步骤(3)的操作为:冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到期0.9 1.1个标准大气压，然后压塞，出箱。所述混合气体中氧气和氮气的体积比为5 10:90 95。优选的，所述混合气体中氧气和氮气的体积比为7:93
由以上工艺制备得到的冻干粉，用无菌水复溶后，用于人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析。本发明的有益效果是:
(I)本发明的工艺通过在冻干阶段的二次干燥结束后通入含有一定氮氧比例的混合气体，出乎意料地提高了培养基冻干粉的活性及稳定性。即使放置一段时间后，利用冻干粉复溶液进行人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析，“淋巴细胞转化率”及“分裂相指数”这两个关键性活性指标保持稳定，且显著高于传统的液体培养基。(2)本发明的工艺制备得到的淋巴细胞培养基冻干粉保存时间长、效果稳定，贮存、携带及运输方便，实现了淋巴细胞培养基的商品化。
·
(3)本发明的冻干工艺无须加入赋形剂，可以降低赋形剂对细胞培养的不良影响，且降低生产成本。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1
本发明的冻干培养基和传统的液体培养基活性、稳定性研究结果比较1、按表I配方的顺序分别配制本发明的冻干用的5倍浓缩培养液和传统的液体培养基。其中，RPMI1640干粉来源于GIBCO公司，新生小牛血清来源于杭州四季青公司。各材料加好后用磁力搅拌子以300 rpm于室温下搅拌两小时溶解。
权利要求
1.一种淋巴细胞培养基的冻干粉生产工艺，包括如下步骤: (1)配制培养基原液； (2)将培养基原液过滤、冷冻干燥，得到冻干粉； (3)往冻干粉中通入含有氮气和氧气的混合气体，即得产品。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述培养基原液含有如下组分:小牛血清、L型植物血球凝集素、RPMI1640培养基干粉、谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠。
3.根据权利要求1或2所述的生产工艺，其特征在于，所述培养基原液中各组分的浓度为:小牛血清780 820 g/L、L型植物血球凝集素为8 12 mg/L、RPMI1640培养基干粉为9.5 10.5 g /L、谷氨酰胺为40 60 mM/L、4_羟乙基哌嗪乙磺酸为45 55 mM/L、碳酸氢钠为6.8 7.2 g/L ο
4.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于，所述培养基原液中各组分的浓度为:小牛血清800 g/L、L型植物血球凝集素为10 mg/L、RPMI1640培养基干粉为41.0 g/L 42.0 g /L、谷氨酰胺为50 mM/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸为50 mM/L、碳酸氢钠为7.0 g/L。
5.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(2)所述过滤是指先用Ium孔径的滤器进行预过滤，然后用0.22um孔径的滤器进行无菌过滤。
6.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(2)冷冻干燥工艺包括: O预冻:箱内温度降至一 35 一 45°C，保持3 5小时； 2)升华:将冷凝器的温度降 到一45 一 55°C以下，对整个系统抽真空； 3)升华开始，控制真空度在10pa以下，搁板温度控制在一 19 一 21°C，升华干燥11 13小时； 4)二次干燥:提高板层温度至7 9°C干燥3 5小时。
7.根据权利要求6所述的生产工艺，其特征在于，步骤(2)冷冻干燥工艺包括: O预冻:箱内温度降至一 40°C，保持4小时； 2)升华:将冷凝器的温度降到一50°C以下，对整个系统抽真空； 3)升华开始，控制真空度在10Pa以下，搁板温度控制在一 20°C，升华干燥12小时； 4)二次干燥:提高板层温度至8°C干燥4小时。
8.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(3)的操作为:冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到期0.9 1.1个标准大气压，然后压塞，出箱；所述混合气体中氧气和氮气的体积比为5 10:90 95。
9.根据权利要求1或8所述的生产工艺，其特征在于，所述混合气体中氧气和氮气的体积比为7:93o
10.由权利要求1的工艺制备得到的冻干粉，用无菌水复溶后，用于人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析。
全文摘要
本发明公开了一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺，包括如下步骤(1)配制培养基原液；(2)将培养基原液过滤、冷冻干燥，得到冻干粉；(3)往冻干粉中通入含有氮气和氧气的混合气体，即得产品。本发明的工艺通过在冻干阶段的二次干燥结束后通入含有一定氮氧比例的混合气体，出乎意料地提高了培养基冻干粉的活性及稳定性。即使放置一段时间后，利用冻干粉复溶液进行人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析，“淋巴细胞转化率”及“分裂相指数”这两个关键性活性指标保持稳定，且显著高于传统的液体培养基。且本发明的工艺制备得到的淋巴细胞培养基冻干粉保存时间长、效果稳定，贮存、携带及运输方便，实现了淋巴细胞培养基的商品化。
文档编号C12N5/0781GK103232972SQ20131012715
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者韦剑, 黄明, 陈建农, 王灿顶, 邱壮伟, 丘力功, 符美娟, 蔡小杰 申请人:广州白云山拜迪生物医药有限公司