专利名称：一种地衣芽孢杆菌7172及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌7172及其应用。
背景技术：
香兰素(vanillin)，学名4_羟基_3_甲氧基苯甲醛，分子式C8H8O3，相对分子量152.15。香兰素的纯品通常为白色或微黄色针状结晶，具有香荚兰豆特有的芳香味。微溶于水，易溶于乙醇、氯仿、乙醚、冰醋酸、吡啶等有机溶剂和强碱溶液中。香兰素的化学性质不太稳定，易受光的影响，在空气中逐渐氧化为香草酸，在碱性溶液中易变色。无毒，对人和动物无害，对皮肤和粘膜有局部的刺激。香兰素是一种世界上产量最大、用途最多的广谱型高档香料，已广泛应用于食品、医药、工业、农业等各个行业中。在食品方面，因其具有特殊的香型，被誉为“食品香料之王”，广泛用作咖啡、名酒等高档食品的调香原料。在医药方面，香兰素是合成许多药物及其药物中间体的重要原料。在工业方面，香兰素被广泛的应用于牙膏、香水及化妆品的制备中；香兰素用作电镀添加剂，可加快电镀速度，增加镀件表面的光泽。在农业方面，香兰素可作为农作物的增产剂、催熟剂等。香兰素目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香兰素不是天然香料。天然香兰素可以从香子兰的花荚中提取，但这样得到的香兰素量少而价高，不能满足日益增长的需求，从而促使研究人员去寻找生产天然香兰素的替代方法。国外(例如欧洲)的立法机构认为采用生物活细胞或其中的组成部分(例如酶)等生物资源所生产的物质均属于天然产物。因此利用生物转化法生产天然香兰素是很有前途的替代方法之一。目前，利用微生物转 化法生产香兰素所选用的天然底物主要有阿魏酸、丁香酚、异丁香酚、芳香族氨基酸、香草酸等。阿魏酸因其对微生物的毒性作用小，并且在自然界广泛分布，被认为是一种较好的底物。迄今为止，以阿魏酸为底物生产香兰素的微生物种类很多，在细菌、真菌、放线菌中都有发现。但大多数微生物转化得到的香兰素的产量很低，或者是香兰素很快转化成其它的代谢产物，导致香兰素在培养液中很难积累下来。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌7172及其应用。技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 7172,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7172，保藏日期2013年I月18日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。地衣芽孢杆菌7172的生理学特征是:革兰氏阳性，好氧，产芽孢，平坦，不透明，可利用麦芽糖、淀粉、葡萄糖。
取地衣芽抱杆菌7172 的 16S rRNA 序列与 Bacillus licheniformis 的 16S rRNA序列比对，相似性达到100%,因此鉴定为地衣芽孢杆菌licheniformis.、
所述的地衣芽孢杆菌在生物转化阿魏酸生产天然香兰素中的应用。所述的应用，其特征在于，包括以下步骤:
(1)斜面培养:将地衣芽孢杆菌7172接种到斜面培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养24h ；
(2)制备种子培养液:用步骤(I)所得到的斜面培养物，接种到种子液培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养24h，连续转接I 3次，制得种子培养液；
(3)菌体的发酵培养:使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比1%的接种量接入发酵培养液中，在50°C条件下，200rpm振荡培养20h ；
(4)菌体的收集:将步骤(3)所得到的发酵液在6000rpm的条件下离心，弃上清，得到沉淀物，即菌体；
(5)菌体的转化:将步 骤(4)所得的菌体用磷酸盐缓冲液冲洗三次，再用相同的磷酸盐缓冲液进行悬浮培养，同时加入8g/L的阿魏酸钠溶液，在50°C条件下，200rpm振荡培养5d，
获得天然香兰素。所述斜面培养基配方为:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠5g/L,琼脂18g/L。所述种子液培养基配方为:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠5g/L。所述发酵培养基配方为:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠5g/L;pH调至7。所述磷酸盐缓冲液的成份为:4.2mM Na2HPO4, 2.2mM KH2PO4,0.9mM NaCl, 1.9mMNH4Cl, pH 为 7。所述的阿魏酸钠溶液是将阿魏酸溶于磷酸盐缓冲液中，再用NaOH调节pH至7。有益效果:与现有技术相比，本发明的地衣芽孢杆菌7172及其应用，使用地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素是在高温条件下进行的，可以有效控制杂菌的生长，有利于工业生产。同时采用该方法环境污染小，生产周期短，产品环境友好，安全可靠，克服了长期以来采用化学合成法生产香兰素的弊端，具有广泛的应用前景。
图1是地衣芽孢杆菌7172在平板培养基上的生长 图2是地衣芽孢杆菌转化阿魏酸生成的代谢产物的薄层层析图；图中，I为阿魏酸标样,2为香兰素标样，3为4-乙烯基愈创木酚标样，4为培养IOh的发酵液，5为培养2d的发酵液；
图3是气相色谱-质谱联用检测发酵液中代谢产物结果 图4是地衣芽孢杆菌转化阿魏酸生产香兰素的过程中阿魏酸和香兰素的变化曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1取蘑菇种植地中的堆肥样品，称取6g，剪碎，加入60mL蒸馏水，混匀制成悬浊液，于30°C条件下震荡培养30min。取上述制得的悬浊液转接到阿魏酸的浓度分别为0.1%，0.2%，
0.3%，0.4%，0.5%的基本培养基中，将三角瓶置于50°C水浴摇床中振荡培养，并观察其生长状况。将上述初筛的阿魏酸浓度为0.1%-0.5%的培养液各取lmL，转接到新配置的阿魏酸浓度为0.4%，0.5%，0.6%, 0.7%, 0.8%的复筛培养基中，进一步提高阿魏酸的浓度，将三角瓶置于50°C水浴摇床中振荡培养。从上述阿魏酸浓度为0.1%-0.8%的培养液中各取IOML菌液，并用无菌蒸馏水适当稀释后涂板，50°C高温水浴摇床培养l-3d，然后从板上挑取形态不同的单个菌落，采用平板划线法进行纯化，连续纯化3次，以确保得到单一菌落。将长出的单菌落分别接种到含5g/L阿魏酸的基本培养基中，振荡培养24小时后，筛选出能够转化阿魏酸生成香兰素菌株，最终获得一株降解能力较好、能大量积累香兰素的菌株。采用菌落PCR法获得该菌株的16SrDNA，具体如下:
1)16sRNA扩增引物使用细菌16sRNA通用引物，
正向引物 F27:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物 R1492:5’ -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3
2)PCR体系(25ML):2.5ML IOXbuffer (Mg2+ Free)，2ML dNTP，1.5ML MgCl2，0.3ML 正向引物F27，0.3ML反向引物R1492，5ML模板(单菌落)，0.3ML T aq DNA酶，13.1ML无菌蒸馏水；
3)反应程序:95°C预变性5min;95°C变性30S ;55°C退火Imin ;72°C延伸2min ；30个循环；72°C再延伸IOmin ;4°C保存。将PCR产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳验证，并由南京思普金生物科技公司完成测序。·利用BLAST (http://wwwncb1.nlm.nih.gov/blast)将所测定菌株的 16SrDNA 序列，与Genbank数据库中已知细菌的16SrDNA/rRNA序列进行比较鉴定，最终测得该菌株与地衣芽孢杆菌的同源性达到100%。因此命名为地衣芽孢杆菌licheniformis)7172。该菌株于2013年I月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，编号为 CGMCC N0.7172。如图1所示，该菌株的菌落平坦，不透明，呈乳白色，好氧，产芽孢，革兰氏阳性，可利用麦芽糖、淀粉，葡萄糖。在上述筛选转化阿魏酸生产香兰素的菌株的方法中，使用的基本培养基配方为:硫酸铵1.3g/L，氯化铁0.02g/L，硫酸镁0.125g/L，酵母提取物0.lg/L，磷酸氢二钾
0.37g/L，氯化钙0.0525g/L，调节pH至7，121°C条件下灭菌20min。在上述筛选转化阿魏酸生产香兰素的菌株的方法中，使用的固体培养基配方为:酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L。121°C条件下灭菌20min。实施例2
地衣芽孢杆菌菌体在种子培养24h后，以体积百分比1%接种量接入LB培养基中，菌体培养20h后收集菌体，加入含5g/L阿魏酸的磷酸盐缓冲液中，在50°C条件下160转/分钟振荡培养，取样，通过TLC对阿魏酸的降解、香兰素的生成进行快速的鉴定，本实施例的地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素，其涉及的详细步骤如下:
(I)斜面培养:将地衣芽孢杆菌7172接种到LB固体培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养24h ；
(2)制备种子培养液:用步骤(1)所得到的斜面培养物，接种到种子培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养24h，连续转接1 3次，制得种子培养液；
(3)菌体的发酵培养:使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比1%的接种量接入发酵培养液中，在50°C条件下，160rpm振荡培养20h ；
(4)菌体的收集:将步骤(3)所得到的发酵液在6000rpm的条件下离心，弃上清，得到沉淀物，即菌体；
(5)菌体的转化:将步骤(4)所得的菌体用磷酸盐缓冲液(4.2mM Na2HPO4, 2.2mMKH2PO4,0.9mM NaCl, 1.9mM NH4Cl, pH为7)冲洗三次，再用相同的磷酸盐缓冲液进行悬浮培养，同时加入5g/L的阿魏酸钠溶液，在50°C条件下，160rpm振荡培养，在培养IOh和2d时取样；
(6)薄层层析(TLC)快速鉴定:将阿魏酸、4-乙烯基愈创木酚、香兰素标样溶于甲醇溶液，将发酵液在13000rpm条件下离心5min,去沉淀,得上清,点样。薄层层析使用的展开剂的体积比为:氯仿:环已烷:甲醇:甲酸(15:15:5:0.2);显色剂:5%浓H2SO4溶于无水乙醇。结果如图2所示，图中，1为阿魏酸标样，2为香兰素标样，3为4-乙烯基愈创木酚标样，4为培养IOh的发酵液，5为培养2d的发酵液；可见，发酵液中存在香兰素，且量逐渐增加，阿魏酸的量逐渐减少。实施例3
地衣芽孢杆菌菌体在种子培养24h后以体积百分比1%接种量接入LB培养基中，菌体培养20h后收集菌体，加入含5g/L阿魏酸的磷酸盐缓冲液中，在50°C条件下160rpm振荡培养两天取样，通 过气质联用仪对代谢产物进行检测分析。本实施例的地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素，其涉及的详细步骤如下:
(1)斜面培养:将地衣芽孢杆菌7172接种到LB固体培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养24h ；
(2)制备种子培养液:用步骤(1)所得到的斜面培养物，接种到种子培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养24h，连续转接1 3次，制得种子培养液；
(3)菌体的发酵培养:使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比1%的接种量接入发酵培养液中，在50°C条件下，160rpm振荡培养20h ；
(4)菌体的收集:将步骤(3)所得到的发酵液在6000rpm的条件下离心，弃上清，得到沉淀物，即菌体；
(5)菌体的转化:将步骤(4)所得的菌体用磷酸盐缓冲液冲洗三次，再用相同的磷酸盐缓冲液进行悬浮培养，同时加入5g/L的阿魏酸钠溶液，在50°C条件下，160rpm振荡培养2d，取样；
(6)代谢产物的鉴定:取得的转化样品经氯仿抽提后，使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测发酵液中代谢产物。GC-MS的参数设置为:初始温度为50°C (保持lmin)，50-260°C每分钟上升10°C ;然后260°C的条件下保持5min ;载气N2:lml/min ;入口温度为250°C。结果如图3所示，可见，代谢产物中主要含有4-乙烯基愈创木酚、香兰素等。实施例4
地衣芽孢杆菌菌体在种子培养24h后以体积百分比1%接种量接入LB培养基中，菌体培养20h后收集菌体，加入含5g/L阿魏酸的磷酸盐缓冲液中，在50°C条件下160rpm振荡培养。每隔一天取样，并用HPLC测定阿魏酸和香兰素的浓度。本实施例的地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素，其涉及的详细步骤如下:
(1)斜面培养:将地衣芽孢杆菌7172接种到LB固体培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养24h ；
(2)制备种子培养液:用步骤(I)所得到的斜面培养物，接种到种子培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养24h，连续转接I 3次，制得种子培养液；
(3)菌体的发酵培养:使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比1%的接种量接入发酵培养液中，在50°C条件下，160rpm振荡培养20h ；
(4)菌体的收集:将步骤(3)所得到的发酵液在6000rpm的条件下离心，弃上清，得到沉淀物，即菌体；
(5)菌体的转化:将步骤(4)所得的菌体用磷酸盐缓冲液冲洗三次，再用相同的磷酸盐缓冲液进行悬浮培养，同时加入5g/L的阿魏酸钠溶液，在50°C条件下，160rpm振荡培养7d,
每隔一天取一次样；
(6)香兰素和阿魏酸浓度的测定:每天取得到的转化样品经分析纯乙酸乙酯萃取后使用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中香兰素和阿魏酸的浓度。高效液相色谱的色谱条件为:流动相为甲醇:7jC:冰醋酸(体积比为35:65:0.05);流速为0.80ml/min ;检测波长为260nm和280nm ;柱温为室温；进样量为20ML ;等梯度洗脱。以保留时间定性，以峰面积定量。结果如图4所示，可见，阿 魏酸的量逐渐减少，香兰素的量先增加后减少。
权利要求
1.一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌licheniformis') 7172,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 7172，保藏日期2013年I月18日，保藏地址中国北京。
2.权利要求I所述的地衣芽孢杆菌在生物转化阿魏酸生产天然香兰素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤 (1)斜面培养将地衣芽孢杆菌7172接种到斜面培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养24h ； (2)制备种子培养液用步骤(I)所得到的斜面培养物，接种到种子液培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养24h，连续转接I 3次，制得种子培养液； (3)菌体的发酵培养使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比1%的接种量接入发酵培养液中，在50°C条件下，200rpm振荡培养20h ； (4)菌体的收集将步骤(3)所得到的发酵液在6000rpm的条件下离心，弃上清，得到沉淀物，即菌体； (5)菌体的转化将步骤(4)所得的菌体用磷酸盐缓冲液冲洗三次，再用相同的磷酸盐缓冲液进行悬浮培养，同时加入8g/L的阿魏酸钠溶液，在50°C条件下，200rpm振荡培养5d，获得天然香兰素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述斜面培养基配方为酵母提取物5g/I,Tryptone 10g/L,氯化钠 5g/L,琼脂 18g/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子液培养基配方为酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠 5g/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基配方为酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠 5g/L;pH 调至 7。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的成份为4.2mMNa2HPO4, 2. 2mM KH2PO4,0. 9mM NaCl, I. 9mM NH4Cl, pH 为 7。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的阿魏酸钠溶液是将阿魏酸溶于磷酸盐缓冲液中，再用NaOH调节pH至7。
全文摘要
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)7172，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7172，保藏日期2013年1月18日，保藏地址中国北京。本发明的地衣芽孢杆菌7172及其应用，使用地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素是在高温条件下进行的，可以有效控制杂菌的生长，有利于工业生产。同时采用该方法环境污染小，生产周期短，产品环境友好，安全可靠，克服了长期以来采用化学合成法生产香兰素的弊端，具有广泛的应用前景。
文档编号C12R1/10GK103255084SQ201310140820
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者丁少军, 保华荣, 胡宏飞 申请人:南京林业大学