专利名称：一种饲用地衣芽孢杆菌菌剂制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种饲用益生菌剂，尤其涉及一种有效微生物为地衣芽孢杆菌的饲料添加剂。
背景技术：
饲用抗生素曾被认为是20世纪畜牧业生产中最伟大的生物技术，自从1946年首次报道了链霉素可刺激雏鸡生长，1950年美国食品与药物管理局(FDA)首次批准抗生素用作饲料添加剂后，抗生素在大量用作治疗和预防细菌性疾病的同时，还作为饲料添加剂被大范围推广和应用，对控制畜禽感染性疾病、保障现代养殖业的健康发展发挥了极其重要的作用，但随着抗生素过度滥用，其种种弊端也逐渐被人们所认识。同时，抗生素也越来越严重的危害着人们生命健康，长期摄入具有抗生素残留的食物，慢慢会使人们的身体处于亚中毒状态，集聚到一定程度，会诱发各种疾病，甚至危及生命。尤其是近年来，由饲料安全问题引发的事件越来越多，引起全世界越来越多人的关注，抗生素在饲料中的添加也越来越成为世界性的食品恐慌症的根源。抗生素在饲料中的添加也受到越来越多科学家、畜牧工作者的反对。因此，研究开发无残留无毒副作用的替代饲用抗生素的产品成为世界各国专家备受关注的课题。益生菌剂是在微生态理论指导下，由有益微生物或微生物菌群、经特殊发酵工艺研制而成的含有活菌及其代谢产物的微生物制剂，在调节肠道菌群平衡、促进机体免疫、提高饲料消化率、改善畜禽产品生产性能等方面有显著效果，被认为是无毒、无害、无副作用的绿色饲料添加剂，作为抗生素替代品具有潜在的应用价值。目前国内益生菌剂生产厂家数量众多，生产工艺多采用固体发酵，生产过程易于污染杂菌，菌体含量不易控制，产量不稳定，生产菌株退化现象严重，在畜禽养殖中实际效果不明显，造成饲用微生态菌剂产业发展缓慢。
发明内容
本发明针对上述饲用微生态行业存在的问题，筛选得到一株地衣芽孢杆菌，能在畜禽肠道中迅速定殖，分泌的杆菌肽在畜禽肠道中具有广谱抗菌作用，可以直接杀死病原菌，无任何毒素残留；该菌还可以分泌高活性的蛋白酶，提高饲料的消化利用率。本发明涉及的饲用地衣芽孢杆菌菌剂是地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis) BLBY-7经液态发酵增殖培养后经真空冷冻干燥而成。所述的地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)BLBY_7,筛选自牛的瘤胃，能在畜禽肠道中快速定植，并分泌杆菌肽和蛋白酶。所述的饲用地衣芽孢杆菌菌剂的制备方法如下:
(I)种子培养
将地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16 24 h后，转接到种子培养基中摇瓶培养16 24 h,作为种子培 养液；(2)增殖培养
将上述种子培养液按发酵培养基体积的3 10%的接种量转接到液态发酵培养基中，培养温度为35°C，培养16 24 h后，有效活菌数可达到IO8 101° CFU/mL ；
(3)离心分离
在4°C条件下将上述发酵液离心15 20min，取下层沉淀备用；
(4)真空冷冻干燥
将沉淀与冻干保护剂充分混合，在真空度6 Pa，冷冻温度-40°C，冻干时间为疒10 h的条件下冻干即可得地衣芽孢杆菌菌剂，其中冻干保护剂的用量为发酵液体积的1/1(Γ /4 ；所述的种子培养基配方为:酵母膏0.5%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1.2%，磷酸氢二钾0.3%，硫酸镁0.02%,硫酸锰0.05%,调节ρΗ7.0。所述的液态增殖发酵培养基配方为:玉米粉2.5%，豆柏粉2.0%，麸皮1.5%，硫酸铵
0.5%，硫酸镁0.05%,磷酸氢二钠0.5%，硫酸锰0.05%,发酵过程中调节ρΗ7.0。所述的冻干 保护剂配方为:脱脂奶粉10%，甘油1%，乳糖1%，胱氨酸0.15%，维生素
0.3%。本发明制得的地衣芽孢杆菌菌剂有效活菌数为8 23X 101° CFU/g。本发明制得的地衣芽孢杆菌菌剂主要用于畜禽养殖，可在常规饲料中添加
0.0I 0.05%。本发明具有如下优点:
本发明得到的饲用益生菌剂有效微生物为地衣芽孢杆菌，该微生物能分泌杆菌肽和蛋白酶，可在畜禽肠道中快速定殖，杀死肠道中的病原菌；所分泌的蛋白酶有助于提高饲料的消化利用率；另外菌剂在发酵生产过程中，也能产生杆菌肽和蛋白酶，采用真空冷冻干燥工艺，不但保证了菌种的成活率，也能使杆菌肽和蛋白酶的活性得到最大限度的保持，提高了菌剂的综合效能；该菌剂活菌数目高，活化简单，使用成本低，与抗生素相比，显著降低养殖成本。
具体实施例方式实施例1:地衣芽孢杆菌菌剂的制备
(1)一级种子培养:将地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16 24h后，转接到种子培养基中摇瓶培养16 h，作为种子培养液；
(2)液态发酵增殖培养:将上述种子培养液按发酵培养基体积的7%的接种量转接到液态发酵培养基中，培养温度为35°C，培养20 h后，有效活菌数可达到3.4X IO9 CFU/g ；
(3)离心分离:在4°C条件下将上述发酵液离心15min，取下层沉淀备用；
(4)添加冻干保护剂真空冷冻干燥:在沉淀中加入发酵液体积的10%冻干保护剂，充分混合后，在真空度6 Pa，冷冻温度-40°C，冻干时间为8 h制得地衣芽孢杆菌菌剂，有效活菌数为 12 X 101° CFU/g ；
实施例2:地衣芽孢杆菌菌剂的制备
(1)一级种子培养:将地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16 24h后，转接到种子培养基中摇瓶培养20 h，作为种子培养液；
(2)液态发酵增殖培养:将上述种子培养液按发酵培养基体积的3%的接种量转接到液态发酵培养基中，培养温度为35°C，培养24 h后，有效活菌数可达到5.6 X IO9 CFU/mL ；
(3)离心分离:在4°C条件下将上述发酵液离心20min，取下层沉淀备用；
(4)添加冻干保护剂真空冷冻干燥:在沉淀中加入发酵液体积的20%冻干保护剂，充分混合后，在真空度6 Pa，冷冻温度-40°C，冻干时间为10 h制得地衣芽孢杆菌菌剂，有效活菌数为 18 X 101° CFU/g ；
实施例3:地衣芽孢杆菌菌剂的应用
选取100头30日龄断奶、平均体重7.20±0.30 kg的三元(杜洛克X长白X大白)杂交仔猪，根据平均体重，随机分成2组，一组只使用常规饲料配方，不添加抗生素和本发明菌剂产品，另一种在常规饲料中添加本发明产品0.03%，按常规方法进行驱虫、免疫和饲料管理，连续饲养I个月，发现在常规饲料中添加本发明地衣芽孢杆菌菌剂的一组比另一组腹泻率降低62%，蛋白消化率提 高6.3%，料肉比降低3.4%。
权利要求
1.一种饲用地衣芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于将地衣芽孢杆菌经液态发酵增殖培养后真空冷冻干燥而成。
2.如权利要求1所述的饲用地衣芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis) BLBY-7,筛选自牛的瘤胃，能在畜禽肠道中快速定植，并分泌杆囷妝和蛋白酶。
3.如权利要求1所述的饲用地衣芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂是通过以下步骤制得的: (1)种子培养 将地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16 24 h后，转接到种子培养基中摇瓶培养16 24 h,作为种子培养液； (2)增殖培养 将上述种子培养液按发酵培养基体积的3 10%的接种量转接到液态发酵培养基中，培养温度为35°C，培养16 24 h后，有效活菌数可达到IO8 101° CFU/mL ； (3)离心分离 在4°C条件下将上述发酵液离心15 20 min，取下层沉淀备用； (4)真空冷冻干燥将沉淀与冻干保护剂充分混合，在真空度6 Pa，冷冻温度-40°C，冻干时间为疒10 h的条件下冻干即可得地衣芽孢杆菌菌剂，其中冻干保护剂的用量为发酵液体积的1/1(Γ /4 ；其中，所述的种子培养基配方为:酵母膏0.5%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1.2%，磷酸氢二钾0.3%，硫酸镁0.02%,硫酸锰0.05%,调节ρΗ7.0 ； 所述的液态发酵培养基配方为:玉米粉2.5%，豆柏粉2.0%，麸皮1.5%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.05%,磷酸氢二钠0.5%，硫酸锰0.05%,发酵过程中调节ρΗ7.0 ； 所述的冻干保护剂配方为:脱脂奶粉10%，甘油1%，乳糖1%，胱氨酸0.15%，维生素0.3%。
4.如权利要求1所述的饲用地衣芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌菌剂主要应用于畜禽养殖领域，添加量为0.0Γ0.05%。
全文摘要
本发明公开了一种饲用地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)菌剂的制备方法及应用，属于饲料添加剂领域。所述地衣芽孢杆菌BLBY-7，筛选自牛的瘤胃，能分泌杆菌肽，在畜禽肠道中具有广谱抗菌作用，可以直接杀死病原菌，无任何毒素残留，还可以分泌高活性的蛋白酶，从而能提高饲料的消化利用率；所述菌剂中含地衣芽孢杆菌8~23×1010CFU/g以上，在畜禽常规饲料中按重量百分比0.01~0.05%添加使用，可有效提高畜禽对常规疾病的抵抗能力，减少抗生素的使用量。
文档编号C12R1/10GK103232959SQ20131014100
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者刘宗利, 王乃强, 胥九兵, 刘海玉, 李克文, 孔健, 施安辉, 季明杰, 李方华 申请人:保龄宝生物股份有限公司