专利名称：一种高催化效率木聚糖酶xyn10b及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率木聚糖酶XYNlOB及其基因和应用。
背景技术：
植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成，三者通过共价键和非共价键结合形成一个紧密的结构。半纤维素主要存在于细胞壁的表面，约占细胞干重的30% 35%。其中木聚糖是植物半纤维素的主要组成成分之一，也是自然界中除纤维素之外重要的可再生资源。木聚糖的结构复杂，其完全降解需要多种酶协同作用来进行。其中木聚糖酶是木聚糖降解中的最关键酶，它能够有效地降解木聚糖主链的连接批喃木糖的 β _1，4 糖苷键(Saha B.Hemicellulose bioconversion.J Ind MicrobiolBiotechnol, 2003, 30:279-291.)。NCBI中数据库中收录的木聚糖酶基因的分布来看，来源于微生物的木聚糖酶最多，占所有序列的80%以上。而微生物来源的序列中，细菌和真菌来源的序列又占大多数。这可能因为木聚糖的降解终产物木糖可以作为微生物的碳源和能源，而微生物要利用木聚糖，就得合成能够降解木聚糖的酶。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶归类于糖苷水解酶家族 10、11、39、43、52、62 和 67 (Henrissat B, Bairoch A.Newfamilies in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acidsequence similarities.Biochem J，1993，293:781-788.)。木聚糖酶在多个领域有着重要的应用。木聚糖酶用于纸浆漂白过程，并发现木聚糖处理后的纸浆需要的化学漂白剂的用量要比不用木聚糖酶处理少20% 40%。随后木聚糖酶在造纸工业上的研究越来越多。结果发现，用木聚糖酶预处理能够提高漂白效果、增强纸张的强度、优化和调整纸张的性能；木聚糖经木聚糖酶作用后的水解产物(低聚木糖)可用作增稠剂、脂肪替代物和抗冻食品添加剂等；饲料里添加酸性木聚糖酶可以有效地降低消化道中食糜的黏度、提高干物质的消化率和营养吸收，从而提高饲料的利用率和动物体的抗病性；木聚糖酶在工业中有着广阔的应用前景。近几年，在啤酒酿造过程中添加含有木聚糖酶等的复合酶制剂，可以有效分解麦芽汁中的木聚糖和戊聚糖，降低麦芽汁中的粘度，改善其过滤性能。处理过程中需要温度在50 80°C，pH在5.0 6.0,因此，需要添加的外源木聚糖酶应该在此条件下酶活力最好。本发明的木聚糖酶最适PH5.5，最适温度75°C，能很好的满足工业生产的要求。此外，其与现在工业生产所用的木聚糖酶相比，具有更高的催化效率，能有效发挥催化作用，从而降低能耗，提高底物利用率，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种高催化效率木聚糖酶XYN10B。本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率木聚糖酶的基因xynlOB。本发明 的另一目的是提供包含上述高催化效率木聚糖酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述高催化效率木聚糖酶基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述高催化效率木聚糖酶的方法。本发明的另一目的是提供上述高催化效率木聚糖酶的应用。本发明分离筛选出一种生产上述高催化效率木聚糖酶XYNlOB的毛壳菌C8。本发明提供了一种高催化效率木聚糖酶XYN10B，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:mhlassllflaslpmgmankgkpckkglniIakqaglkyfgaatdspgqreragyeaayaqydqimwksgefgqttptngqkwlfseptrggynftegeivtslakkhgyylrchalvwhsqlapwvettewtadeIrqvivdhithvmghwkgqcyawdvvnealnedgtyresvfykvlgeeyiklafktasevdphaklyyndynlespsgktagaanivkmlrkegiridgvglqahltaerhptldqhidaissftelgvevalteldvritmpataenlalqkesyknavgacvqvrgcigvtiwdfydpfswvpytfpgqgapIlwfdnftthpaydgvvealtnktsrgkgkgnsrraqlwsa其中，该酶包括371个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列(mhlassllflaslpmgma),因此，成熟的高催化效率木聚糖酶XYNlOB的理论分子量为38.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示:nkgkpckkglnilakqaglkyfgaatdspgqreragyeaayaqydqimwksgefgqttptngqkwlfseptrggynftegeivtslakkhgyylrchalvwhsqlapwvettewtadeIrqvivdhithvmghwkgqcyawdvvnealnedgtyresvfykvlgeeyiklafktasevdphaklyyndynlespsgktagaanivkmlrkegiridgvglqahltaerhptldqhidaissftelgvevalteldvritmpataenlalqkesyknavgacvqvrgcigvtiwdfydpfswvpytfpgqgapIlwfdnftthpaydgvvealtnktsrgkgkgnsrraqlwsa本发明的木聚糖酶XYNlOB在碱性范围内具有优良的pH稳定性，而且具有很高的催化效率。本发明的木聚糖酶，其最适PH值为5.5，最适温度为751:，在551:具有良好的热稳定性。本发明提供了编码上述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB。具体地，该基因的序列如 SEQ ID N0.3 所示:ATGCATCTCGCCTCCTCGCTGCTCTTCCTGGCCTCCCTGCCCATGGGGATGGCCAACAAGGGCAAGCCGTGCAAGAAGGGTCTCAACATCCTCGCTAAGCAGGCCGGTCTCAAGTACTTCGGCGCGGCCACCGACTCGCCCGGTCAGCGGGAGCGTGCCGGCTACGAGGCTGCCTACGCGCAGTATGACCAGATCATGTGGAAGTCGGGCGAGTTTGGCCAGACGACGCCCACCAACGGCCAGAAGTGGCTATTCAGCGAGCCCACGCGCGGCGGGTATAACTTCACCGAGGGCGAGATCGTAACGTCCCTGGCCAAGAAGCACGGCTACTACCTGCGGTGCCACGCGCTGGTGTGGCACAGCCAGCTTGCTCCCTGGGTCGAGACGACCGAGTGGACGGCCGACGAGCTGCGGCAGGTGATCGTCGACCACATCACACACGTGATGGGCCACTGGAAGGGCCAGTGCTACGCCTGGGACGTGGTCAACGAGGCGCTCAACGAGGATGGGACCTACCGCGAGTCTGTCTTCTACAAGGTGCTGGGCGAGGAGTACATCAAGCTGGCCTTCAAGACGGCCTCCGAGGTCGACCCGCACGCCAAGCTGTACTACAACGACTACAACCTCGAGTCGCCCAGCGGAAAGACGGCGGGGGCCGCCAATATCGTCAAGATGCTGCGCAAGGAGGGGATCCGCATCGACGGCGTCGGCCTGCAGGCGCATCTGACGGCGGAGCGCCACCCAACCCTCGACCAGCACATCGACGCCATCTCGAGCTTCACCGAGCTCGGCGTCGAGGTCGCCCTCACCGAGCTGGACGTGCGCATCACCATGCCCGCCACGGCCGAGAACCTGGCTCTGCAGAAGGAATCCTACAAGAATGCGGTCGGCGCATGCGTGCAGGTCCGCGGCTGCATCGGCGTGACCATCTGGGACTTCTACGACCCCTTCAGCTGGGTGCCCTACACCTTCCCCGGCCAGGGCGCCCCGCTGCTGTGGTTCGACAA TTTCACGACCCACCCGGCGTATGACGGTGTGGTCGAGGCGTTGACTAACAAGACGAGTCGCGGCAAGGGCAAGGGCAATAGCCGGCGCGCGCAGTTGTGGTCTGCTTGA
本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xynlOB，cDNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYNlOB基因xynlOB全长1116bp。其中，信号肽的碱基序列=Atgcatctcgcctcctcgctgctcttcctggcctccctgcccatggggatggcc
因此，成熟的木聚糖酶XYNlOB的基因序列如SEQ ID N0.4所不:aacaagggcaagccgtgcaagaagggtctcaacatcctcgctaagcaggccggtctcaagtacttcggcgcggccaccgactcgcccggtcagcgggagcgtgccggctacgaggctgcctacgcgcagtatgaccagatcatgtggaagtcgggcgagtttggccagacgacgcccaccaacggccagaagtggctattcagcgagcccacgcgcggcgggtataacttcaccgagggcgagatcgtaacgtccctggccaagaagcacggctactacctgcggtgccacgcgctggtgtggcacagccagcttgetccctgggtcgagacgaccgagtggacggccgacgagctgcggcaggtgatcgtcgaccacatcacacacgtgatgggccactggaagggccagtgctacgcctgggacgtggtcaacgaggcgctcaacgaggatgggacctaccgcgagtctgtcttctacaaggtgctgggcgaggagtacatcaagctggccttcaagacggcctccgaggtcgacccgcacgccaagctgtactacaacgactacaacctcgagtcgcccagcggaaagacggcgggggccgccaatatcgtcaagatgctgcgcaaggaggggatccgcatcgacggcgtcggcctgcaggcgcatctgacggcggagcgccacccaaccctcgaccagcacatcgacgccatctcgagcttcaccgagctcggcgtcgaggtcgccctcaccgagctggacgtgcgcatcaccatgcccgccacggccgagaacctggctctgcagaaggaatcctacaagaatgcggtcggcgcatgcgtgcaggtccgcggctgcatcggcgtgaccatctgggacttctacgaccccttcagctgggtgccctacaccttccccggccagggcgccccgctgctgtggttcgacaatttcacgacccacccggcgtatgacggtgtggtcgaggcgttgactaacaagacgagtcgcggcaagggcaagggcaatagccggcgcgcgcagttgtggtctgcttga成熟蛋白理论分子量为39.5kDa，将木聚糖酶基因xynlOB序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLBST比对，证明所述木聚糖酶基因xynlOB是一种新的木聚糖酶基因。本发明还提供了包含上述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重组载体，优选为pPIC9-xynl0Bo将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xynlOBo本发明还提供了包含上述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/XynlOB。本发明还提供了一种制备上述高催化效率木聚糖酶XYNlOB的方法，包括以下步骤:I)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN10B的表达；以及3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10B。其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115,得到重组菌株GS115/xynlOB。本发明还提供了上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的应用，优选其在水解木聚糖及其在啤酒工业中的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在啤酒、饲料工业中应用的新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适PH5.5，并在PH5.0 10.0范围内具有很好的pH稳定性；最适温度75°C，在高温下具有很高的活性。此夕卜，木聚糖酶XYNlOB可有效降解各种不同类型的木聚糖。因此,本木聚糖酶将在啤酒工业的应用中显示出其巨大的潜力。
图1重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，M:分子量标准蛋白质对照；1:纯化的XYNlOB; 2:脱糖基化的 XYN10B。图2重组木聚糖酶的最适pH。图3重组木聚糖酶的pH稳定性。图4重组木聚糖酶的最适温度。图5重组木聚糖酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体:毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂:内切酶购自TAKARA公司，连接酶购自Promega公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基: (I)重组毕赤酵母菌培养基为马铃薯汁培养基:1000mL马铃薯汁，IOg葡萄糖，25g琼脂，PH5.0。(2)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。(3) BMGY 培养基:1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 1% 甘油(V/V)。(4) BMMY培养基:除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1毛壳菌Chaetomium sp.C8产酶特性将来源于宁夏沙漠表面样品经富集培养后(富集培养基:(NH4)2S045g/L，KH2PO4Ig/L, MgSO4.7Η200.5g/L, FeSO4.7Η200.01g/L, CaCl20.2g/L,玉米芯粉 0.5 %，麸皮 0.5%,pH5.0)，按常规稀释后涂布于产酶培养基((NH4) 2S045g/L, KH2PO41g/L, MgSO4.7H200.5g/L，FeSO4.7H200.0lg/L, CaCl20.2g/L，木聚糖 0.5%，1.5% 琼脂糖，ρΗ5.0)平板上，45°C培养5 6d，挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌葡聚糖酶的菌株。产透明圈最大的菌株经划线分离纯化后定名为C8,经18S rDNA鉴定该菌株为毛壳菌,命名为Chaetomium sp.C8。在PDA培养基培养5天后观察，菌落浅色，气生菌丝浅色。子囊果表生，球形，卵圆形，顶端有一孔口，子囊壳壁膜质，透明或不透。须根根状，起固定子囊壳和吸收养分的作用，侧生附属丝较短，似刚毛。内含8个子囊抱子，无隔，单细胞，球形、椭圆形等，成熟前多为灰白色，成熟后呈褐色，柠檬形，厚壁，两侧平滑，两端突起，有一个明显的顶生萌发孔。实施例2木聚糖酶编码基因XYNlOB的克隆提取毛壳菌C8 (Chaetomium sp.C8)基因组 DNA:培养3天后将菌丝离心后取入研钵中，液氮冻制研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，加入2mL CTAB提取液，70°C水浴锅裂解2h，每隔IOmin混匀一次，在4°C下12000rpm离心lOmin。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置IOmin后，4°C下12000rpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗漆两次，真空干燥，加入0.2mL TE溶解，置于_20°C备用。根据第十家族木聚糖酶基因的保守序列(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)设计合成了简并引物P1，P2
Pl:5' -TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3'；P2:5’-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3’ 。以毛壳菌C8(Chaetomium sp.C8)基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为:94°C变性5min ;然后94°C变性30sec，50 °C降落45°C(每个循环降落0.5 °C )退火30sec，72°C延伸30s，十个循环；94°C变性30s，48°C退火30s，72 °C延伸30s，30个循环，72 °C保温IOmin0得到一约256bp片段，将该片段回收后与pEBSY_T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各二条TAIL-PCR特异性引物:设计方向为需要扩增的未知区域方向，第二条引物的位置设计在第一条引物的内侧。每两个引物之间的距离为50bp左右，引物长度一般20 30nt，退火温度在60°C。并将它们分别命名为uspl, usp2, usp3(上游特异性引物),dspl, dsp2, dsp3 (下游特异性引物)见表I。表1.木聚糖酶XYNlOB TBIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种高催化效率木聚糖酶XYN10B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQID N0.2 所示。
2.一种高催化效率木聚糖酶基因xynlOB，其特征在于，编码权利要求1所述的高催化效率木聚糖酶XYN10B。
3.根据权利要求2所述的高催化效率木聚糖酶基因xynlOB，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3或4所示。
4.包含权利要求2或3所述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-xynlOB。
6.包含权利要求2或3所述高催化效率木聚糖酶基因xynlOB的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。
8.一种制备高催化效率木聚糖酶XYNlOB的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYNlOB的表达；以及 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10B。
9.权利要求1所述 高催化效率木聚糖酶XYNlOB的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率木聚糖酶XYN10B及其基因和应用。本发明提供了一种新的高催化效率木聚糖酶XYN10B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高催化效率木聚糖酶XYN10B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的木聚糖酶最适pH5.5，并在pH4.0～10.0范围内具有80%以上的酶活力；最适温度75℃，具有很高的催化效率为3710ml s-1mg-1。此外，木聚糖酶XYN10B可有效降解各种不同类型的木聚糖。因此，本木聚糖酶将在饲料和食品工业的应用中显示出其巨大的潜力。
文档编号C12R1/84GK103232985SQ20131015090
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者詹志春, 张菁, 陈小燕 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司