专利名称：一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株重组菌，具体涉及一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达。
背景技术：
胶原蛋白具有生物吸收性、细胞粘附性、促新细胞形成、促上皮细胞形成及生物兼容性等特性，使它具有非常广泛的潜在用途，一直是生物医学材料领域关注的热点，而人源型水溶性胶原蛋白的研发生产一直是世界科学家研究的热点。类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰，转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得。它解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患(疯牛病、猪瘟疫、禽流感)等问题,并且具有良好的生物学特性和功能,相比动物体提取胶原蛋白优良，免疫排异反应低。目前，在利用大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白的过程中，乙酸等代谢副产物的积累始终是影响菌体生长及重组蛋白表达的最不利因素，传统的减少乙酸等代谢副产物的方法一般为:采用分批补料培养方式、两阶段培养方式及在位移除代谢副产物等方法。在分批-补料培养方式中，是通过控制营养物的添加速率及细胞生长速率来减少乙酸的积累，但是这就导致类人胶原蛋白的产量偏低，另外，复杂的补料策略也需要持续的对发酵过程进行监督，这就导致发酵过程十分的不方便，而且易受到人为操作失误的影响；另一种减少乙酸积累的方法是通过分离设备，如中空纤维，将部分培养基流出，并且加入新鲜的培养基以保持恒定的反应体积。但是这种方法并没有显著提高单位体积类人胶原蛋白的产量。这些方法都只是用工程学的手段来减少乙酸积累以达到提高类人胶原蛋白的产量，但是效果往往比较差，不能满足高产的目的
发明内容
本发明的目的是提供一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达，能有效减少乙酸分泌，避免乙酸积累对菌体生长和重组蛋白表达的影响。本发明所采用的技术方案是:
一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌，其特征在于:
所述的重组菌于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7331。所述重组菌是以保藏编号为CGMCC N0.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，敲除基因得到的大肠杆菌工程菌。—株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的构建方法，其特征在于: 由以下步骤实现:以保藏编号为CGMCC N0.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除基因的大肠杆菌工程菌。一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 由以下步骤实现:
1)将重组菌在LB固体平板上划线，34°C培养12h，转接于另一LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板；
2)从种子平板上挑取单菌落，接种于含50mlLB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养6h，最后以1%_8%接种量接种于终容量为50ml培养基的250ml三角瓶中，34°C，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42°C诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h-14h时发酵结束。步骤2)中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为:葡萄糖10_15g/L，酵母粉10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾 8-9g/L，磷酸二氢钠 4-5g/L，EDTA L0_1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁l-2g/L，卡那霉素0.0025-0.0035g/L，余量为水。步骤2)中，所述培养基为M9培养基。一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 由以下步骤实现:
1)将重组菌在LB固体平板上划线，34°C培养12h，转接于另一LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板； 2)从种子平板上挑取单菌落，接种于2瓶含80mlLB液体培养基的300ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于8瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34°C培养IOh，最后将640ml种子液接种于含16L灭过菌的发酵培养基的30L发酵罐中，溶解氧通过通入纯净的空气控制在25%饱和度，pH通过加入氨水控制在6.8，当底物培养基消耗光了之后开始通过补料方式补加新鲜的培养基，当0D_达到大约45 g DCW/L时，升温至42°C诱导类人胶原蛋白表达，维持3h，调节温度至39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白。步骤2)中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为:葡萄糖10_15g/L，酵母粉10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾 8-9g/L，磷酸二氢钠 4-5g/L，EDTA L0_1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁l-2g/L，卡那霉素0.0025-0.0035g/L，余量为水。本发明具有以下优点:
本发明通过基因工程手段改造大肠杆菌葡萄糖吸收途径，减少乙酸积累，提高类人胶原蛋白的积累。通过基因敲除技术敲除了负责跨膜转运葡萄糖的基因，降低了葡萄糖的吸收速率，平衡葡萄糖的吸收和利用，减少了乙酸分泌，并提高了葡萄糖的利用率达到高产类人胶原蛋白的目的，满足了工业化的需求。利用本发明大肠杆菌生产类人胶原蛋白，其葡萄糖的消耗量比现有菌种减少了 9%-28% ;类人胶原蛋白的产量相对于现有菌种可提高20%-30% ;乙酸积累量较现有菌种降低42%-87%。
图1为敲除菌与未敲除菌蛋白产量对比。
图2为敲除菌与未敲除菌发酵液残糖对比。图3为敲除菌与未敲除菌在发酵培养基中的生长性能及乙酸积累量对比。图4为敲除菌与未敲除菌在M9培养基中的生长性能及乙酸积累量对比。图5为敲除菌与未敲除菌在30L发酵罐中蛋白表达量对比。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细的说明。在大肠杆菌的磷酸转移酶系统中，葡萄糖主要由基因编码的酶IICBek转运入细胞。利用基因工程技术构建基因敲除菌，有望降低葡萄糖的吸收速率，减少乙酸积累，并且提高类人胶原蛋白的表达。敲除基因后，细胞可通过其他转运酶的作用摄取葡萄糖，但进入糖酵解途径的总碳代谢流有所减少，使其进入TCA循环的碳代谢大体平衡，从而避免副产物乙酸的积累，使细胞在生长过程中可大量摄取葡萄糖用于菌体生长和蛋白表达。在有氧发酵过程中，乙酸的产生是由于大肠杆菌对碳源的过流代谢，也就是吸收葡萄糖的量超过了转化为生物量和产物的量，因此多余的碳就由乙酰辅酶A通过三羧酸循环转化为了乙酸。乙酸的产生不但是碳源和能量的一种浪费，而且是抑制类人胶原蛋白表达和细胞生长的主要因素。大肠杆菌在利用碳源时涉及到磷酸转移酶系统，该系统中的由
基因编码的酶EIICBek对葡萄糖的转运起重要作用。为了实现本发明目的，本发明采用基因工程方法构建/7tsG基因敲除菌，然后通过筛选的方法筛选得到一株葡萄糖消耗量低，乙酸等有害副产物积累 少的高效表达类人胶原蛋白的大肠杆菌工程菌。该基因工程构建基因敲除菌的方法是以大 肠杆菌BL21 (CGMCC N0.0743)为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶的作用再消除安普霉素抗性基因，得到了敲除基因的大肠杆菌工程菌，改变了工程菌的葡萄糖吸收和转运的模式，从而改变了碳代谢和类人胶原蛋白合成的相关代谢流。本发明所涉及的重组菌于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7331。以下描述中采用的实验试剂如无特殊说明均采用常规试剂，以下描述中采用的实验方法如无特殊说明，均采用常规方法及常规条件，如《分子克隆:实验手册》中所述的方法或厂商提供的方案进行。—、闻效表达类人I父原蛋白的/7 tsG基因敲除重组菌的构建:
I)通过PCR方法构建含安普霉素抗性基因(Apr)的打靶片段，构建方法为:
首先以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增ptsG基因N端和C端同源壁，均约350bp，其次以质粒PIJ773为模版，PCR扩增Apr抗性盒，约1.4kb，最后通过重叠PCR将基因N端同源壁，Apr抗性盒，C端同源壁连接起来，构建出左端为基因N端同源壁，中间为安普霉素抗性基因，右端为基因C端同源壁的打靶片段，约2.lkb。2)用氯化钙法将大肠杆菌BL21制成感受态细胞，将表达Red重组酶的质粒pKD46转入感受态细胞中，在含氨苄青霉素100ug/ml的LB固体平板上培养，筛选转化子。将筛选出的转化子表示为大肠杆菌BL21/pKD46。整个过程为标准化无菌操作过程。3)挑取大肠杆菌BL21/pKD46单菌落接种于新鲜的LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)中，30°C震荡培养12h，转接于50ml新鲜的LB培养基中，继续培养2h，加入L-阿拉伯糖诱导质粒PKD46表达重组酶，终浓度为lOmmol/L，继续培养至0D_=0.5 0.6，将菌液置于冰浴中15 20min，然后4°C，5000rpm离心lOmin，用灭菌的10%甘油洗涤菌体3次，将菌体重悬于0.5mL甘油中，即制成了电转感受态细胞。4)电击转化:将I)中由PCR方法制得的打靶片段IiTlOOng与IOOul感受态细胞混匀，转入已预冷的0.1cm的BTX电击杯中，进行电击，电击条件为:电阻200Ω，频率25uF，电压1.8kV，电击时间为r5ms。电击完成后迅速加入900ul冰冷的LB培养基，30°C培养lh，移取IOOul涂布于含有氨苄青霉素和安普霉素的LB平板上，30°C培养，筛选阳性转化子。通过菌落PCR技术鉴定阳性转化子，并测序鉴定，将 鉴定为阳性的转化子表示为大肠杆^BL21 AptsG:: Apr/pKD4605)消除质粒PKD46:因为质粒pKD46为温度敏感性质粒，所以可以通过高温培养将pKD46质粒消除。将4)中得到的阳性转化子疋coli BL21 AptsG:: Apr/pKD46接种于LB培养基中，42°C培养2h后，在37°C下划线分离培养，对每个单菌落进行氨苄青霉素和安普霉素抗性检测，挑选对氨苄青霉素敏感而对安普霉素具有抗性的克隆，得到消除PKD46的菌株，表示为大肠杆菌BL21 ΔptsG:: Apr。6)安普霉素抗性基因的去除:将质粒PCP20转入菌株大肠杆菌BL21 AptsG:: Apr中，含有氯霉素(25 g/ml)抗性平板30°C培养24h，挑取单菌落接种于LB平板42°C过夜培养，PCP20在42°C下诱导表达FLP内切酶从而将FRT位点间的抗性基因从基因组上切除掉，利用验证引物进行菌落PCR鉴定，并测序鉴定，阳性片段仅为同源臂大小，说明安普霉素抗性基因已成功消除，此时的菌株表示为大肠杆菌BL21 AptsG07)由于对原始菌株进行了多部操作，有可能造成表达类人胶原蛋白的质粒PNWCP31丢失，所以将表达类人胶原蛋白的质粒PNWCP31重新转入菌株大肠杆菌BL21 AptsG中以达到强化该质粒的目的。最终得到完全敲除基因并表达类人胶原蛋白的菌株大肠杆菌BL21 AptsG0二、高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的筛选:
I)将5株上述构建得到的大肠杆菌BL21菌株在LB固体平板上划线，34°C培养
12h，转接于另一 LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板。从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养6h，最后以1°/Γ8%接种量接种于终容量为50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，34°C，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42°C诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h-14h时发酵结束。发酵结束后测定类人胶原蛋白产量，筛选出一株高产类人胶原蛋白的大肠杆菌工程菌。上述步骤中，所有操作均为标准无菌操作过程，实验中所用到的所有器具均经过灭菌处理，灭菌过程为121°C，20min高温高压灭菌，或0.22um滤膜过滤除菌。上述步骤中，所用的发酵培养基的配方为:葡萄糖10_15g/L，酵母粉10_12g/L,硫酸铵5-6g/L，磷酸氢二钾8-9g/L，磷酸二氢钠4_5g/L，EDTA 1.0-1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁 l-2g/L，卡那霉素 0.0025-0.0035g/L，余量为水。上述实验中，5株敲除菌的最终类人胶原蛋白产量较未敲除菌有明显提高，敲除菌蛋白产量分别为0.21,0.23,0.25,0.23,0.26mg/ml，而未敲除菌蛋白产量仅为0.20mg/ml，敲除菌蛋白产量较未敲除菌提高了 5%-30%。所以我们筛选出高效表达类人胶原蛋白的大肠杆菌菌株5号菌株。二、闻效表达类人13父原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达:
(I)高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌在发酵培养基中生产类人胶原蛋
白:
O将敲除基因的菌株大肠杆菌BL21在LB固体平板上划线，34°C培养
12h，转接于另一 LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板。从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养6h，最后以1_8%接种量接种于终容量含50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，34°C，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42°C诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到14h时发酵结束。此组实验为实验组。2)将未敲除基因的原始菌株大肠杆菌BL21按照上述步骤中的相同方法处理，作为对照组，对照组所有处理方式与实验组完全相同。3)此次发酵过程为14h，在发酵过程中，每隔Ih取样一次。4)菌体浓度测定: 发酵液稀释一定的倍数后，使它的光吸收值大概在0.3^0.8，用分光光度计检测其在600nrn波长的吸收值，所得值A_乘以稀释倍数即为菌体浓度(OD600)。5)发酵液乙酸含量测定:将发酵液经过0.22 μ m滤膜过滤后，使用BioProfileanalyzer 300 (NOVA biomedical, USA)测定乙酸及残留葡萄糖含量。6)类人胶原蛋白含量测定:在发酵14h结束后，9000rpm，4°C，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次，以洗去残留的培养基成分，利用羟脯氨酸法测定类人胶原蛋白含量。羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特征氨基酸，并且在基因序列设计中羟脯氨酸占胶原蛋白总量是一定的。所以可以通过测得的羟脯氨酸的含量，计算得到类人胶原蛋白的大概含量。实验结果:
菌体0D_值:在(T6h敲除菌OD6tltl与未敲除菌OD6tltl无明显差异，比生长速率也无明显差异，然而，在7h之后，敲除菌表现出更强的生长能力，敲除菌的0D_值迅速超过了未敲除菌，在9h之后，敲除菌与未敲除菌均达到了稳定期，敲除菌比未敲除菌高f 2个OD值。发酵液乙酸含量:在发酵的整个过程中，敲除菌的乙酸含量均维持在低于1.5g/L的水平，而未敲除菌的乙酸含量在发酵过程中不断升高，在稳定期乙酸含量已达到接近
4.0g/L，这个浓度的乙酸已严重限制了菌体的生长，因此才表现出敲除菌在后期比未敲除菌生长能力更强的特点。类人胶原蛋白产量:此次实验中，在发酵培养基中敲除菌的最终类人胶原蛋白产量较未敲除菌有明显提高，敲除菌蛋白产量为0.26mg/ml，而未敲除菌蛋白产量仅为
0.21 mg/ml，敲除菌蛋白产量较未敲除菌提高了 27.3%。
综上，敲除菌较未敲除菌生长能力更强，发酵液中乙酸含量更低(高效利用了碳源，并减轻了发酵液中乙酸对细胞生长及蛋白合成的抑制作用)，类人胶原蛋白产量更高，提高了 27.3%，说明此方法为一种提高类人胶原蛋白产量的非常有效的方法。(2)高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌在发M9培养基中生产类人胶原蛋白:
O将敲除基因的菌株大肠杆菌BL21在LB固体平板上划线，34°C培养
12h，转接于另一 LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板。从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养6h，最后以1_8%接种量接种于终容量含50ml M9培养基的250ml三角瓶中，34°C，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42°C诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到14h时发酵结束。此组实验为实验组。2)将未敲除基因的原始菌株大肠杆菌BL21按照上述步骤中的相同方法处理，作为对照组，对照组所有处理方式与实验组完全相同。3)此次发酵过程为14h，在发酵过程中，每隔Ih取样一次。4)菌体浓度，发酵液乙酸含量，类人胶原蛋白含量测定方法与实施例3中的完全相同
实验结果:
菌体0D_值:在发酵前期，虽然敲除菌的生长落后于未敲除菌，但在Ilh之后，敲除菌表现出更强的生长能力，敲除菌的0D_值迅速超过了未敲除菌，在发酵结束时敲除菌比未敲除菌高大约I个OD值。 发酵液乙酸含量:在发酵的整个过程中，敲除菌的乙酸含量均维持在低于1.0g/L的水平，而未敲除菌的乙酸含量在发酵过程中不断升高，在稳定期乙酸含量已达到接近
5.5g/L，这个浓度的乙酸已严重限制了菌体的生长，因此才表现出敲除菌在后期比未敲除菌生长能力更强的特点。类人胶原蛋白产量:在M9培养基中敲除菌的最终类人胶原蛋白产量较未敲除菌也有明显提高，敲除菌蛋白产量为0.23mg/ml，而未敲除菌蛋白产量仅为0.20 mg/ml,敲除菌蛋白产量较未敲除菌提高了 15%。综上，敲除菌较未敲除菌生长能力更强，发酵液中乙酸含量更低(高效利用了碳源，并减轻了发酵液中乙酸对细胞生长及蛋白合成的抑制作用)，类人胶原蛋白产量更高，提高了 15%，说明此方法为一种提高类人胶原蛋白产量的非常有效的方法。(3)高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌在30L发酵罐中生产类人胶原蛋白:
O将敲除基因的菌株大肠杆菌BL21在LB固体平板上划线，34°C培养
12h，转接于另一 LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板。从种子平板上挑取单菌落，接种于2瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于8瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34°C培养10h，最后将640ml种子液接种于含16L灭过菌的发酵培养基的30L发酵罐中，溶解氧通过通入纯净的空气控制在25%饱和度，pH通过加入氨水控制在6.8。当底物培养基消耗光了之后开始通过补料方式补加新鲜的培养基，当OD6c 达到大约90 (45 g DCW/L)时，升温至42°C诱导类人胶原蛋白表达，维持3h，调节温度至39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白。3h之后，发酵结束，收集菌体，并测定类人胶原蛋白产量。此组实验为实验组。2)将未敲除基因的原始菌株大肠杆菌BL21按照上述步骤中的相同方法处理，作为对照组，对照组所有处理方式与实验组完全相同。3)菌体浓度，发酵液乙酸含量，类人胶原蛋白含量测定方法与实施例3中的完全相同。实验结果:
类人胶原蛋白产量:在30L发酵罐中/7 tsG敲除菌的最终类人胶原蛋白产量较未敲除菌也有明显提高，敲除菌蛋白产量为7.15 g/L，而未敲除菌蛋白产量仅为5.60 g/L，敲除菌蛋白产量较未敲除菌提高了 28%。综上，类人胶原蛋白产量更高，提高了 28%，说明此方法在分批-补料发酵过程中也为一种提高类人胶原蛋白产量的非常有效的方法。本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任 何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
权利要求
1.一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌，其特征在于: 所述的重组菌于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7331。
2.根据权利要求1所述的一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌，其特征在于: 所述重组菌是以保藏编号为CGMCC N0.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，敲除基因得到的大肠杆菌工程菌。
3.一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的构建方法，其特征在于: 由以下步骤实现: 以保藏编号为CGMCC N0.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除基因的大肠杆菌工程菌。
4.一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 由以下步骤实现: 1)将重组菌在LB固体平板上划线，34°C培养12h，转接于另一LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板； 2)从种子平板上挑取单菌落，接种于含50mlLB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34°C培养6h，最后以1%_8%接种量接种于终容量为50ml培养基的250ml三角瓶中，34°C，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42°C诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h-14h时发酵结束。
5.根据权利要求4所述的一株高效表达类人胶原蛋白的/7tsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 步骤2)中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为:葡萄糖10-15g/L，酵母粉10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾 8-9g/L，磷酸二氢钠 4_5g/L，EDTA 1.0-1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁l-2g/L，卡那霉素0.0025-0.0035g/L，余量为水。
6.根据权利要求4所述的一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 步骤2)中，所述培养基为M9培养基。
7.一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 由以下步骤实现: 1)将重组菌在LB固体平板上划线，34°C培养12h，转接于另一LB固体平板，34°C继续培养12h，得到活化的种子平板； 2)从种子平板上挑取单菌落，接种于2瓶含80mlLB液体培养基的300ml三角瓶中，34°C培养12h，转接于8瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34°C培养10h，最后将640ml种子液接种于含16L灭过菌的发酵培养基的30L发酵罐中，溶解氧通过通入纯净的空气控制在25%饱和度，pH通过加入氨水控制在6.8，当底物培养基消耗光了之后开始通过补料方式补加新鲜的培养基，当0D_达到大约45 g DCW/L时，升温至42°C诱导类人胶原蛋白表达，维持3h，调节温度至39°C，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的一株高效表达类人胶原蛋白的基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于: 步骤2)中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为:葡萄糖10-15g/L，酵母粉10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾 8-9g/L，磷酸二氢钠 4-5g/L，EDTA L0_1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml`，硫酸镁l-2g/L，卡那霉素0.0025-0.0035g/L，余量为水。
全文摘要
本发明涉及一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达。利用大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白时，乙酸积累会影响菌体生长及蛋白表达，而现有减少乙酸副产物的方法会降低胶原蛋白产量。本发明以保藏编号为CGMCCNo.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的ptsG基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除ptsG基因的大肠杆菌工程菌CGMCCNo.7331。本发明通过基因工程手段改造大肠杆菌葡萄糖吸收途径，减少乙酸积累，提高类人胶原蛋白的积累，葡萄糖的消耗量减少9%-28%，类人胶原蛋白的产量可提高20%-30%。
文档编号C12P21/02GK103224901SQ20131015741
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月2日 优先权日2013年5月2日
发明者范代娣, 骆艳娥, 马晓轩 申请人:西北大学