抗金葡菌药物筛选系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以金黄色葡萄球菌调节蛋白（MgrA）为靶点的抗金黄色葡萄球菌感染药物的筛选系统。它是通过将MgrA蛋白N端、MgrA蛋白C端与荧光蛋白连接成融合蛋白。本发明还提供了以该融合蛋白为基础的、抗金黄色葡萄球菌感染药物的高通量筛选系统。本发明为寻找抗金黄色葡萄球菌感染药物前体提供了简捷，快速、准确的方法。
【专利说明】抗金葡菌药物筛选系统
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及细胞标靶筛选药物系统，更具体地，本发明涉及建立金黄色葡萄球菌调节蛋白(MgrA)细胞靶标快速筛选抗金黄色葡萄球菌感染药物的系统和方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌是引起人类感染性疾病的一种重要的病原菌，它能引起皮肤感染、心内膜炎、肺炎和败血症等多种疾病。抗生素治疗是其主要治疗手段，但金黄色葡萄球菌已经对几乎所有已知的抗生素产生了耐药性。日益严峻的耐药性问题迫使业界急需发现新的药物作用靶点以及发展新的对抗金黄色葡萄球菌的方法。
[0003]新近出现了一种抗细菌感染治疗的新模式一毒性蛋白(调节蛋白)靶向治疗，即用药物靶向遏制目标菌的毒性蛋白的表达、传递和黏附，进而靶向调节目标菌的毒力表达，有效预防和治疗多种感染性疾病。通过对患者施用针对病原菌毒性蛋白的药物来降低其致病性使之无害而非将其杀灭，这样就能大大降低耐药菌株出现的几率(CheungA.L.et al.1nfect Immun, 2005, 73:1423 ~1431, Clatworthy A.E., et al.Nat.Chem.B1l, 2007，3，541-548)。
[0004]金黄色葡萄球菌调节蛋白(MgrA)首次发现于2003年，是MarR (multipleantib1tic resistance regulator) /SarA (Staphylococcal accessory regulator A)蛋白家族的成员之一，调控350多个基因，并表现出多种生物活性，特别是在调节致病因子表达方面起着尤为重要的作用。mgrA基因位于金黄色葡萄球菌染色体中，包含444bp的碱基对，编码147个氨基酸的MgrA蛋白。蛋白质结构分析表明，MgrA含有螺旋-折叠-螺旋(helix-turn-helix, HTH)结构，由2个α螺旋以一定角度的拐角构成的结构域,其中一个能插入并识别DNA大沟特异碱基序列的α螺旋称为识别螺旋(recognit1n helix)；另一个α螺旋没有碱基特异性，与DNA磷酸戊糖链骨架接触。其三级结构在与DNA特异结合时，以二聚体形式发挥作用。在这个二聚体中最要的是12位的半胱氨酸，它与113位的苏氨酸和38位的酪氨酸形成氢键稳定二聚体的结构(Chen P.R.，et al, Nat ChemB1l,2006，2，591 - 595)。
[0005]理论上，有两种途径可通过抑制DNA与MgrA的结合来降低细菌的致病性。一种是找到合适的、可以选择性地烷基化半胱氨酸残基的烷化剂。另一种是利用高通量筛选来找到可以跟MgrA蛋白产生非共价键作用的小分子化合物。
[0006]高通量筛选是现代制药的一个重要的工具，使用合适的筛选方法可以有效地找到可能的药物分子结构前体，大量简化药物优化过程的工作量。目前尚无关于建立在分子构象基础上的抗金黄色葡萄球菌感染的药物的高通量筛选系统的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种方便快速、操作简单且具有良好的特异性和敏感性的筛选抗金黄色葡萄球菌感染药物的系统及其构建方法。
[0008]在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白由下列部分组成:
[0009](a) MgrA 蛋白 N 端；
[0010](b)荧光蛋白；
[0011](C)MgrA 蛋白 C 端;
[0012](d)位于(a)和(b)之间连接元件A以及位于(b)和(C)之间的连接元件B ;
[0013]所述的MgrA蛋白N端是MgrA蛋白的第I位到第110位的氨基酸序列，所述MgrA蛋白C端是MgrA蛋白的第110位到第146位的氨基酸序列。
[0014]在另一优选例中，所述的MgrA蛋白N端的氨基酸序列如SEQ ID NOl所示，所述的MgrA蛋白C端的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
[0015]在另一优选例中，所述的突光蛋白选自(但不限于)黄色突光蛋白:例如，cpVenus或 cpYFP。
[0016]在另一优选例中，所述的连接元件(包括连接元件A和连接元件B)是长度为3~8个氨基酸残基的多肽。
[0017]在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融合蛋白；或与所述的核酸分子互补。
[0018]在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID N03所示。
[0019]在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有所述的核酸分子。
[0020]在本发明的第四方面，提供了一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。
[0021]在本发明的第五方面，提供了所述的融合蛋白的应用，用于筛选抗金黄色葡萄球菌感染的物质。
[0022]在另一优选例中，所述的抗金黄色葡萄球菌感染的物质能够改变MgrA蛋白的构象。
[0023]在本发明的第六方面，提供了一种筛选以MgrA蛋白为靶点的抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质的方法，所述方法包括以下步骤:
[0024]( I)将候选物质与所述的融合蛋白接触；
[0025](2)观察候选物质对融合蛋白的荧光信号强度的影响；
[0026]其中，若所述候选物质可使所述融合蛋白的荧光信号强度增强，则表明该候选物质是抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质。
[0027]在另一优选例中，步骤(1)包括将候选物质与所述的基因工程化的细胞接触。
[0028]在另一优选例中，步骤(1)包括:在测试组中，在所述的细胞的培养物中添加候选物质；和/或
[0029]步骤(2)包括:检测测试组的细胞的荧光信号强度，并与对照组比较，其中，所述的对照组是不添加所述候选物质的所述的细胞。
[0030]在另一优选例中，若所述候选物质可使所述融合蛋白或基因工程化的细胞的荧光信号强度增强1.5倍以上，则表明该候选物质是抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质。
[0031]在另一优选例中，所述方法还包括步骤:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以筛选出抗金黄色葡萄球菌感染有效的物质。
[0032]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1:突光蛋白探针构建思路图。
[0034]图2:基于MgrA构象变化的荧光筛选方法。
[0035]图3:MgrA-cpYFP对MDSA的选择性荧光响应，
[0036]其中，纵坐标为相对荧光强度，
[0037]A) BL21 (DE3) /pET28-MgrA_cpYFP 对 MDSA 的选择性荧光响应，
[0038]B)融合蛋白对MDSA的选择性荧光响应。
[0039]图4 =MgrA荧光融合蛋白的构建以及其对小分子抑制剂的选择性响应。
[0040]图5:荧光倍增值在1.5倍以上的中草药提取物。
[0041]图6:基于目标蛋白构象改变筛选体系。
[0042]图7 =EMAS验证高通量筛选出的中草药提取物对MgrA-DNA结合的影响。
[0043]图8:筛选出的中草药提取物对金黄色葡萄球菌的正常生长影响。
[0044]图9:EMSA第二轮筛选出的部分中草药提取物对金黄色葡萄球菌的抗药性及对MgrA所调控的主动外排基因启动子DNA的影响。
[0045]图10:二轮筛选出的332号中草药提取物对MgrA-DNA结合的剂量效应。
[0046]图11:小鼠感染模型实验的结果。
[0047]图12:PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析
[0048]A.Vector PCR, I:SN-MgrA ；2:AS-MgrA ；3:SP-MgrA ；4:DK_MgrA。
[0049]B.1nsert PCR (cpYFP 及 cpVenus)。
[0050]图13:pET28b-MgrA-cpYFP 双酶切鉴定。
[0051]其中，VT，SD，SN，AS，SP，DK。
[0052]图14:基于荧光各向异性的高通量筛选原理。
【具体实施方式】
[0053]本发明人通过研究金黄色葡萄球菌中调节蛋白MgrA的工作机理和功能,经红外圆二色谱检测证实了小分子与MgrA蛋白结合时会引起该蛋白质本身的三级结构改变。在此基础上，本发明人设想构建一种基于靶标蛋白MgrA本身构象响应的荧光蛋白质探针以用于药物的高通量筛选，即小分子与MgrA —旦相互作用，就会改变与MgrA相融合的荧光基团的荧光强度。为此，本发明人设计了一系列黄色荧光蛋白探针用于检测靶标蛋白MgrA与DNA的结合，经过了一系列的试验和参数优化，终于成功构建了抗金黄色葡萄球菌感染药物的高通量筛选系统。
[0054]融合蛋白
[0055]本发明以MgrA靶点蛋白作为感应分子，并连接融合对外界因素敏感的荧光基团。当小分子与MgrA结合之后会导致MgrA效应蛋白的构象发生变化，同时构象变化信号可以被荧光报告基团接受，最终达到通过荧光强度的变化进行检测的目的(图1)。
[0056]在前期试验的基础上,本发明人将cpVenus/cpYFP插入到MgrA的SllO与Nlll之间形成MgrA-cpYFP融合蛋白，与本发明通过基于荧光各向异性高通量筛选得到的针对性化合物 MDSA 即 5，5’ -亚甲基二水杨酸(参见 Li, Z.，et al, Chem B1l.2011August26; 18 (8):1032 - 1041.)作用，发现MDSA使得融合蛋白的荧光强度增强到1.9倍左右(图3)，并表现一定浓度效应和选择特异性；在随后的活体细菌实验中也得到了相应的结果，证实了本发明的抗金黄色葡萄球菌感染药物的高通量筛选系统是可行的。研究表明，cpVenus/cpYFP插入到这段区域中，形成融合蛋白时，一旦小分子化合物与MgrA发生作用即会引起这个区域的α 5螺旋断裂成两段,从而拉动cpVenus/cpYFP的发色团更加靠近,使cpVenus/cpYFP的荧光信号倍增(图2)。在此基础上，通过插入位点的进一步筛选和关键位点的突变，可以提高这种检测方法的灵敏度、特异性。
[0057]本发明人以MDSA为模式化合物的研究结果表明，有些融合荧光探针，如SP-MgrA-cpYFP 和 VT-MgrA-cpYFP 等对 MDSA 无响应或者效果差，SN-MgrA-cpYFP 或者SN-MgrA-cpVenus效果明显。而SN-MgrA_cpYFP (C12S)则是活性最好的一个探针，对MDSA的响应最明显，而且表现出显著特异性。经过反复探索，本发明人终于获得荧光探针融合蛋白探针SN-MgrA-cpYFP，此融合蛋白在大肠杆菌中可以有效表达并用作小分子对MgrA-DNA相互作用的特异性的监测探针(图4)。
[0058]进而,本发明提供了一种融合蛋白，其包括MgrA蛋白N端、突光蛋白和MgrA蛋白C端以及位于MgrA蛋白N端(C端)和荧光蛋白之间的连接元件。它们的组装是通过基因编码的形式，把荧光蛋白的基因序列整体插入到MgrA的基因序列中。这样MgrA蛋白被分成了二个部分即N端蛋白和C端蛋白。
[0059]其中，MgrA即金黄色葡萄球菌调节蛋白，其蛋白序列登录号为YP_001441273。MgrA编码基因的碱基序列登录号为RefSeq:NC_009782.1。
[0060]如本发明所用，“MgrA蛋白N端”是指与SEQ ID NOl的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。这些保守性变异多肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0061]如本发明所用，“MgrA蛋白C端”是指与SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。这些保守性变异多肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0062]表1性质相近的氨基酸取代
[0063]
【权利要求】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由下列部分组成: (a)MgrA蛋白N端； (b)荧光蛋白； (c)MgrA蛋白C端； (d)位于(a)和(b)之间的连接元件A以及位于(b)和(c)之间的连接元件B； 所述的MgrA蛋白N端是MgrA蛋白的第I位到第110位的氨基酸序列,所述MgrA蛋白C端是MgrA蛋白的第110位到第146位的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的MgrA蛋白N端的氨基酸序列如SEQ ID NOl所示，所述的MgrA蛋白C端的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的荧光蛋白是黄色荧光蛋白。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接元件A和连接元件B是长度为3~8个氨基酸残基的多肽。
5.—种核酸分子,其特征在于， (i)所述的核酸分子编码如权利要求1所述的融合蛋白；或者 (?)所述的核酸分子与(i)所述的核酸分子互补。
6.如权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如SEQID N03所示。
7.—种载体，其特征在于，它含有如权利要求5所述的核酸分子。
8.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞含有如权利要求7所述的载体；或者 所述的细胞基因组中整合有如权利要求5所述的核酸分子。
9.权利要求1所述的融合蛋白的应用，其特征在于，用于筛选抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质能够改变MgrA蛋白的构象。
11.一种筛选以MgrA蛋白为靶点的抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将候选物质与权利要求1所述的融合蛋白接触； (2)观察候选物质对融合蛋白的荧光信号强度的影响； 其中，若所述候选物质可使所述融合蛋白的荧光信号强度增强，则表明该候选物质是抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括将候选物质与权利要求8所述的细胞接触。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于， 步骤(1)包括:在测试组中，在权利要求8所述的细胞的培养物中添加候选物质；和/或 步骤(2)包括:检测测试组的细胞的荧光信号强度，并与对照组比较； 其中，所述的对照组是不添加所述候选物质的权利要求8所述的细胞。
14.如权利要求11~13所述的任一方法，其特征在于，若所述候选物质可使所述融合蛋白或细胞的荧光信号强度增强1.5倍以上，则表明该候选物质是抗金黄色葡萄球菌感染的潜在物质。
15.如权利要求11~13所述的任一方法，，其特征在于，所述方法还包括步骤(3):对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以筛选出抗金黄色葡萄球菌感染有效的 物质。
【文档编号】C12N15/62GK104163868SQ201310185248
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】徐宏喜, 李子刚, 谭红胜, 梁宇杰, 胡冬冬, 劳远至, 王雨洁 申请人:上海中医药大学