Atm基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了ATM基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码ATM基因突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的方法、筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的系统以及用于筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的试剂盒。其中，分离的编码ATM基因突变体的核酸，与SEQ?ID?NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和c.8851_8987del。通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症。
【专利说明】ATM基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及【技术领域】。具体而言，本发明涉及ATM基因突变体及其应用。
【背景技术】
[0002]共济失调毛细血管扩张症(ataxia-telangiectasia, AT)是一种罕见的常染色体隐性遗传(autosomal recessive inherited, AR)病，又叫 Louis-Bar 综合征，于 1941 年由Louis-Bar首先报道。AT发病率约1/4万~1/10万，多于儿童期起病，临床主要表现为进行性发展的小脑性共济失调，眼球结膜和面部皮肤的毛细血管扩张，反复发作的呼吸道感染；同时还具有对射线的杀伤作用异常敏感，染色体不稳定性，易患恶性肿瘤，免疫缺陷和抗射线的DNA复制合成等特征。
[0003]Savitsky和Uziel等率先克隆AT的疾病基因(ATM)，并将其定位于llq22.3。ATM是AT唯一的致病基因，全长约150kb，而编码序列只有12kb，共有66个外显子，编码一个有3056个氨基酸残基，分子质量为350000的蛋白质。ATM基因产物ATM编码蛋白作为直接感受DNA双链断裂(DSBs)损伤信号的上游分子，以其激酶活性，催化多种重要功能底物蛋白的磷酸化，使受损的DNA停止于细胞周期检测点并对其进行修复，对维持染色体的稳定性起重要作用。
[0004]ATM基因的克隆为AT的基因诊断和症状前诊断奠定了基础，并且很大程度上解决了该病临床诊断困难的问题。ATM蛋白在胎儿和成人组织内均有广泛表达，其功能域包括磷酯酰肌醇 3-激酶(phosphoinositide_3kinase，PI3K)、Rad3、亮氨酸拉链(leucinezipper, LZ)、局部的连接区域(focaladhes1n target, FAT)、局部的连接区域C端(FATC)等。PI3K蛋白家族成员和具有Rad3结构域的蛋白家族成员参与了激活细胞周期关卡，控制端粒长度和应答DNA损伤等重要的生物学过程。
[0005]AT最显著的病理学表现是基因组的不稳定性，主要反应在高频率的染色体断裂，自发染色体末端融合和染色体内同源重组及染色体易位，以及体内、外染色体自发畸变率和辐射诱发染色体畸变率的异常增加。作为DNA损伤信号传导通路中最早的传感和中枢调控基因，ATM编码的ATM蛋白在电离辐射的诱导下被激活，并磷酸化其下游蛋白，通过调控细胞周期关卡、DNA损伤修复、细胞凋亡等维持基因组稳定性。AT细胞由于ATM基因突变，缺失了 ATM蛋白，丧失了对下游基因的调控作用，使受损的DNA的合成受抑，阻碍DNA的修复过程，从而导致染色体的断裂和基因组不稳定。
[0006]ATM基因的突变具有极高的异质性，突变方式和突变检测都极为复杂。到目前为止，国外已经报道了 400余种ATM基因突变，绝大多数AT患者为复合性杂合突变，突变形式有错义突变、无义突变、剪切位点突变、小片段插入突变、小片段缺失突变、大片段缺失和同义突变等，突变位点遍布基因全长，无突变热点。
[0007] 因而，目前对共济失调毛细血管扩张症的致病基因ATM突变基因的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0008]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的方法。
[0009]本发明是基于发明人的下列工作完成的:发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了共济失调毛细血管扩张症新的致病基因突变位点(ATM基因的 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del 突变)。
[0010]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码ATM基因突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0:1相比，具有选自下列的至少一种突变:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ 、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和c.8851_8987del (exon65del)。即相对于野生型ATM基因，本发明的ATM基因具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和c.8851_8987del(eX0n65del)的至少一种。根据本发明的实施例，发明人确定了 ATM基因的新突变体，该突变体与共济失调毛细血管扩张症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症。
[0011]根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种分离的多肽，该多肽与SEQ IDNO:2 相比，具有选自下列的至少一种突变:p.Cysl899X、p.Glu2950fs、p.Trpl026Cys、p.Val2662del、p.1lel59fs和p.2951_2995del，通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症。根据本发明的实施例，该多肽是由上述核酸编码的。
[0012]根据本发明的地三个方面，本发明提出了一种筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的方法，该方法包括以下步骤:从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有选自c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ 、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和 c.8851_8987del(exon65del)的至少一种突变是所述生物样品易患共济失调毛细血管扩张症的指示，任选地，所述生物样品为选自人体血液，任选地，所述核酸样本为全基因组DNA，任选地，所述共济失调毛细血管扩张症是常染色体隐性遗传疾病。通过根据本发明实施例的筛选易感共济失调毛细血管扩张症的生物样品的方法，可以有效地筛选易感共济失调毛细血管扩张症的生物样品。
[0013]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的系统，该系统包括:核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，是否具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del (exon65del)的至少一种突变，判断所述生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症；任选地，所述共济失调毛细血管扩张症是常染色体隐性遗传疾病。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感共济失调毛细血管扩张症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感共济失调毛细血管扩张症的生物样品。
[0014]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的试剂盒，该试剂盒含有:适于检测ATM基因突变体的试剂，其中与SEQ IDNO:1相比，所述ATM基因突变体具有选自下列的至少一种突变:c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del (exon65del)，任选地，所述试剂为核酸探针或引物，任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列，任选地，所述是常染色体隐性遗传疾病。
[0015]根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码ATM基因突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码ATM基因突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID N0:1相比具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del (exon65del)至少一种突变。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作共济失调毛细血管扩张症相关研究的模型。
[0016]根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作共济失调毛细血管扩张症相关研究的模型。
[0017]对于本发明中所述核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明的实施例中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO: 1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0018]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0020]图1:显示了根据本发明一个实施例的筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，
[0021]A为根据本发明实施例的筛选易患共济失调毛细血管扩张症患者的生物样品的系统的示意图，
[0022]B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，
[0023]C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图。
[0024]图2:显示了根据本发明一个实施例的共济失调毛细血管扩张症患者的家系图
-1'TfeP曰。
[0025]图3:显示了根据本发明一个实施例的AT家系I的ATM基因突变体的Sanger法测序结果。
[0026]图4:显示了根据本发明一个实施例的AT家系2的ATM基因突变体的Sanger法测序结果。
[0027]图5:显示了根据本发明一个实施例的AT家系3的ATM基因突变体的Sanger法测序结果。
[0028]图6:显示了根据本发明一个实施例的AT家系I的ATM基因突变体的QPCR的结果图。图7:显示了根据本发明一个实施例的AT家系2的ATM基因突变体的Sanger法测序结果。
【具体实施方式】
[0029]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0030]ATM基因突变体
[0031]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码ATM基因突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0:1相比，具有选自下列的至少一种突变:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC和c.8851_8987del (exon65del)。即相对于野生型ATM基因，本发明的ATM基因具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和c.8851_8987del (eX0n65del)突变的至少一种。根据本发明的实施例，发明人确定了 ATM基因的新突变体，该突变体与共济失调毛细血管扩张症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症。
[0032]在本文中所使用的表达方式“编码ATM突变体的核酸”，是指与编码ATM突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与ATM突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码ATM突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了 ATM基因的新突变体，这些新突变体与共济失调毛细血管扩张症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患共济失调毛细血管扩张症。
[0033]该编码ATM突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的共济失调毛细血管扩张症的致病基因上的新突变。该突变位点在现有技术中并未被提到。
[0034]其中，野生型ATM基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
【权利要求】
1.一种分离的编码ATM基因突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID N0:1相比， 所述核酸具有选自下列的至少一种突变:c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del。
2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变:p.Cysl899X、p.Glu2950fs、p.Trpl026Cys、p.Val2662del、p.1lel59fs 和p.2951_2995del, 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3.一种筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤: 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有选自c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del 的至少一种突变是所述生物样品易患感共济失调毛细血管扩张症的指示， 任选地，所述生物样品为选自人体血液， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA， 任选地，所述共济失调毛细血管扩张症是常染色体隐性遗传疾病。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括: 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ；以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括: 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序， 任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括: 利用ATM基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，所述ATM基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列。
6.一种筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的系统，其特征在于，包括: 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与 SEQ ID NO:1 相比，是否具有 c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del 的至少一种突变，判断所述生物样品是否易患共济失调毛细血管扩张症； 任选地，所述共济失调毛细血管扩张症为常染色体隐性遗传疾病。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括: RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及 反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连,用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括: 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地,所述文库构建单元 进一步包括: PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有ATM基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种。
9.一种用于筛选易患共济失调毛细血管扩张症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有: 适于检测ATM基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，所述ATM基因突变体具有选自下列的至少一种突变:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和 c.8851_8987del, 任选地，所述试剂为核酸探针或引物， 任选地,所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列， 任选地，所述共济失调毛细血管扩张症为常染色体隐性遗传疾病。
10.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码ATM基因突变体的核酸。
11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求10所述的构建体转化受体细胞而获得的。
【文档编号】C12N15/12GK104178487SQ201310188517
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】江泓, 陈召, 师玉亭, 唐北沙, 肖晶晶, 管李萍, 王俊 申请人:中南大学湘雅医院, 深圳华大基因科技有限公司