一种快速鉴别棉属种的方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及棉属DNA条形码及快速准确的棉种鉴定方法。所述方法包括以下步骤：取材及总DNA的提取、PCR扩增、克隆及测序、序列比对。根据本发明的方法采用棉花叶绿体基因组特有引物对总DNA进行trnT-trnL和trnH-psbA序列的特异扩增，方便快捷，无需单独提取叶绿体DNA，作为棉属DNA条形码的trnT-trnL和trnH-psbA序列组合，长度适中，对棉种识别力高，能够快速地鉴定棉种，不依赖于传统鉴定分类经验，操作简便，准确性高。
【专利说明】一种快速鉴别棉属种的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及棉属DNA条形码及快速鉴别棉属种的方法。
【背景技术】
[0002]随着全球环境、气候和能源等问题的突出，认识生物多样性是可持续发展战略的迫切需求，而对生物多样性保护和利用的基础则是对物种进行快速而准确地鉴定。DNA条形码技术(DNA barcoding)也应运而生,Paul Hebert (2003)首先提出DNA barcode,指出DNA条形码技术是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段基于其在物种种间的多样性和种内的特异性而创建的一种新的物种分类识别系统，它可以对物种进行快速地鉴定。由于叶绿体基因序列保守性强，已经被广泛用来构建系统发育树和鉴定植物物种。DNA条形码技术具有操作简便、准确性高、快速高效等特点。对于传统的分类工作，不同物种需要采取不同的技术方法，繁琐而易出现错误，而DNA条形码的出现则简化了物种分类鉴定的过程，是一个较为通用的方法。DNA条形码成为传统物种鉴定的强有力补充，使得物种分类鉴定过程简化，不过度依赖传统分类经验。通过一个标准化、较短的基因片段序列变异来鉴定物种，特别是通过叶绿体序列片段的研究，使得DNA条形码成为生命科学和生物【技术领域】进展最迅速的学科前沿之一。
[0003]研究表明，线粒体细胞色素C氧化酶I (cytochrome coxidase I,CO I)作为动物理想的DNA条形码，但对于植物，因其线粒体基因进化速率较慢，不宜用作DNA条形码，至今没有找到一个标准的DNA barcode。2007年在第二届国际条形码大会提出了 7个候选片段，分别是 rbcL、matK、trnH-psbA、rpoCl、rpoB、psbK-psbl 和 atpF-atpH。2009 年生命条形码联盟(the Consortium for the Barcode of Life, CB0L)发表了一篇 PNAS 研究论文，提议将rbcL和matK基因的组合作为植物通用的DNA条形码，而将trnH-psbA序列作为候选条形码。随后的第三届国际DNA条形码大会正式声明将rbcL和matK基因的组合作为植物DNA核心条形码，提议trnH-psbA片段和核基因片段ITS为植物DNA条形码的补充条码。2011年，第四届国际DNA条形码大会围绕生物多样性式样、生态取证、系统学和分子进化安排了四个主题报告，并分组对DNA条形码数据在这四个方面的重要科学问题开展了深入讨论。继上届会议推荐了植物条形码后，正式推荐了 ITS为真菌条形码。
[0004] 但实际上目前建议的植物DNA条形码(例如rbcL和matK基因)由于其分子进化速率较慢，在种级水平上分辨率较低，并不通用于任何物种和任何分类阶元。常用条形码在通用性上存在的局限性使得我们在不同的科属种寻找不同的DNA barcode。理想的条形码必须具备一下条件:第一，通用性，即物种均含有此片段，而且序列片段两端相对保守的区域存在一对通用引物，可以容易地获得产物；第二可读性，能够双向测序，长度适中，序列不需要过多的人为编辑；第三，识别率，即鉴定能力，有足够的变异，较高的物种识别率，将物种区分开来。
[0005]条形码在通用性上存在的局限性使得我们在棉属内寻找合适的DNA barcode。对于棉属DNA条形码，即需要具备:具有一对通用的引物，能将其在所有棉种中都得到成功扩增；此片段长度适中，一次双向测序即可以获得，不需要过多编辑；具有较高的识别力，能够区分所有棉种。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种快速而准确地鉴定棉种的方法。
[0007]本发明的再一目的是提供棉花叶绿体基因组序列用于DNA条形码的应用。
[0008]根据本发明，首先，寻找DNA条形码，通过分析已经测序的棉花叶绿体基因组序列，确定棉属DNA条形码为转运RNA T和L的基因间区(trnT-trnL)以及转运RNAH和编码Dl蛋白质的PsbA基因的基因间区(trnH-psbA)的序列组合(trnT-trnL+trnH-psbA),能够区分任何一个棉种。
[0009]根据本发明的技术方案，设计通用引物，根据条形码序列在两侧设计叶绿体特异引物TL和HA，并使得能够对所有棉种进行有效扩增，所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL,上游引物TLF的核苷酸序列为:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物 HAR 的核苷酸序列为:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。
[0010]根据本发明的鉴定棉种的方法包括以下步骤:
[0011]根据本发明的方法包括以下步骤:
[0012]I)设计通用引物，根据条形码序列在两侧设计叶绿体特异引物TL和HA，并使得能够对所有棉种进行有效扩增，所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列为:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物 HAR 的核苷酸序列为:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA ；
[0013]2)取材及DNA的提取，取目的棉种叶片5g左右，利用CTAB法提取棉花总DNA ；
[0014]3) PCR扩增，设计扩增程序，利用设计的通用引物(TL和HA)进行降落PCR扩增；
[0015]4)PCR产物检测及克隆测序，trnT-trnL目的片段约1500bp，HA目的片段约400bp，送菌液测序；
[0016]5)序列比对，参照条形码序列，去除测得序列的两端非目的片段序列，与DNA条形码进行比对，以确定棉种。
[0017]根据本发明的方法只需提取棉种总DNA，通过PCR法特异地扩增作为棉属DNA条形码的叶绿体序列片段组合trnT-trnL+HA,方便快捷,无需单独提取叶绿体DNA。
[0018]根据trnT-trnL+HA序列与已知条形码的比对,直接确定棉种，快速准确，且不依赖于传统鉴定分类经验，简化了鉴定过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是棉属DNA条形码比对图(箭头指示显著的标记)；
[0020]图2是棉属DNA条形码的通用引物TL和HA的设计；
[0021 ] 图3是实施例中九个未知棉种的PCR扩增trnT-trnL产物；
[0022] 图4是实施例中九个未知棉种的PCR扩增trnH-psbA产物。【具体实施方式】
[0023]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0024]实施例1 二十个已知棉种的DNA条形码的获得
[0025]I材料和方法
[0026]1.1实验材料
[0027]实验材料是二十个已知棉种的叶片，分别编号1-20，来自于中国农业科学院棉花研究所，见下表:
【权利要求】
1.棉花叶绿体基因组中的转运RNAT和L的基因间区trnT-trnL以及转运RNA H和编码Dl蛋白质的psbA基因的基因间区trnH-psbA的序列组合trnT-trnL+trnH-psbA作为棉属DNA条形码。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用引物对扩增棉花DNA，其中，上游引物TLF的核苷酸序列为:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用引物对扩增棉花DNA，其中，上游引物HAF的核苷酸序列为:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。
4.一种鉴定棉种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: O设计通用引物，对已有棉种进行有效扩增，所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL,上游引物TLF的核苷酸序列为:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物 HAR 的核苷酸序列为:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA ； 2)提取目的棉种的棉花总DNA； 3)PCR扩增，利用步骤I)的通用引物对目的棉种的棉花总DNA进行降落PCR扩增； 4)PCR产物检测及克隆测序； 5)序列比对，参照条形码序列，去除测得序列的两端非目的片段序列，与DNA条形码进行比对，以确定棉种。
【文档编号】C12N15/11GK103468672SQ201310198602
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年5月26日 优先权日:2013年5月26日
【发明者】冯坤, 王坤波, 刘方, 华金平, 周忠丽, 王春英, 王玉红, 蔡小彦, 王星星, 尚明照 申请人:中国农业科学院棉花研究所