专利名称：表达疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶突变体的酵母工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程，具体地说，是以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶LGY工程菌GS-LGY为出发菌株，通过定向进化方法筛选到一株表达酶活提高的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-LGYM。
背景技术：
脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)，全称三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于生物体内。脂肪酶底物是甘油酯类，水解位点是甘油和12个碳原子以上不溶性长链脂肪酸所形成的酯键，能够分解生物产生的各类天然油和脂肪。作为一种界面酶，脂肪酶的水解反应只发生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产，其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。
疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus),它分布广泛，生长上限较高,产生的脂肪酶具有较高的工业价值。T.lanuginosus脂肪酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达产物同样具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的优良特性。定向进化具体应用到酯酶和脂肪酶的改造上的成功的方法和策略，以及近些年来，所取得了重要研究进展。定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的巨大成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。
发明内容
以表达疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶LGY的毕赤酵母工程菌GS-LGY为出发菌株，利用定向进化的方法对其进行分子改造。并通过高通量筛选方法最后筛选出一株正向突变菌株GS-LGYM，对此工程菌进行发酵，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤纯化了突变蛋白并测定酶活，结果其酶活是野生菌株所产酶活力的
2.3倍。对此突变基因进行测序，并与野生基因比较得出，GS-LGYM中脂肪酶基因较原始的脂肪酶基因Igy有三个碱基发生改变，分别是第287为由G变为T (密码子由GGG变为GTG)，第575位由T变为C (密码子由GAT变为GCA)，第741位由T变为C (密码子由CGT变为CGC)。其中前两个碱基的变化引起了氨基酸的变化，分别是第96位氨基酸由甘氨酸(Gly, G)变为缬氨酸(Val，V)，第192位氨基酸由丙氨酸(Ala，A)变为缬氨酸(Val，V)。第741位碱基虽然改变，但是编码的氨基酸都是天冬氨酸(Asp，D)未发生改变。
:图1:易错PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳泳道M:Marker-DL2000其他泳道:cDNA(ORF)
图2:平板透明圈法筛选酵母转化子图3:含G418的YPD平板筛选酵母转化子图4 =GS-LGYM 表达脂肪酶的 SDS-PAGE泳道M:低分子量蛋白Marker泳道1-7:酵母工程菌Pichia pastoris GS-LGYM的诱导7天的表达情况图5 =GS-LGY与GS-LGYM酶液的酶活力比较图6 =GS-LGY与GS-LGYM脂肪酶氨基酸序列比对
具体实施方式
:实施例1:疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶LGY突变体库的构建(I)易错PCR及 条件摸索:采用易错PCR法对目的基因进行改造。引物为:上游引物LGY-5’:5’-TTGCTACGTAAGTCCTATTCGTCGAGAG-3’ (SnaBI)下游引物LGY-3’:5’ -GGCCTAGGCTAAAGACATGTCCCAATT-3’ (AvrII)易错PCR反应体系摸索:50yL体系中含I XTaqDNA聚合酶缓冲液、0.2mmol/L
dATP 和 dGTP，1.0mmoI/L dCTP 和 dTTP，10 μ mol/L 上下游引物、4-7mmol/LMg2+、0-5mmol/L
MnCl2模板DNA从质粒扩增获得。PCR反应体系:
IOx PCR Buffer5 μ
Taq DNA聚合酶Ιμ
dCTP、dTTP 各 μΙ
dATP、dGTP 各\μΙ
模板DNA2μ
上游引物2μΙ
下游引物2pL
25 mmoL/L MgCi24-7 ^iL
5 mmoL/L MnCl20-0.5 μL
ddH20to 50 μLPCR反应条件:
权利要求
1.一种酶活提高的疏绵状嗜热丝胞菌Thermomyces Ianuginosus脂肪酶LGY突变毕赤酵母工程菌株，其特征是该菌为一种毕赤酵母，以野生工程菌GS-LGY为出发菌，采用定向进化和高通量筛选方法，获得一株是野生菌株所产脂肪酶酶活力的2.3倍的突变菌株。测序与野生基因比较，有3个碱基位点发生变化，其中两个位点引起氨基酸的变化，它们是G96V，A192V。最终将此突变工程菌株 命名为GS-LGYM。
全文摘要
本研究利用定向进化的方法对疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶LGY进行分子改造。采用易错PCR方法，建立了含有14755个转化子的突变体库。以高活力为筛选压力，通过三丁酸甘油酯平板透明圈法、G418平板、小量发酵筛选和大量发酵测酶活，最后筛选出一株正向突变菌株，对此工程菌进行发酵，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤纯化了突变蛋白并测定酶活，结果其酶活是野生菌株所产酶活力的2.3倍。对此突变基因进行测得的序列，并与野生基因比较，有3个碱基位点发生变化，其中两个位点引起氨基酸的变化，它们是G96V，A192V。将这株定点突变工程菌株最终命名为GS-LGYM。
文档编号C12R1/645GK103243038SQ20131020491
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月28日 优先权日2013年5月28日
发明者李多川, 李安娜, 韩双 申请人:山东农业大学