专利名称：花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20oxl与应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
赤霉素(gibberellins,简称GAs)属于四环二職类化合物,是一种植物激素,至今已发现 130 余种(参见 Israelsson et al.Plant Physiol, 135 (I) 221-30，2004)。赤霉素具有促进种子萌发、促进茎的伸长和叶的生长、诱导开花及种子和果实生长等多种生理功能，其对生长发育过程的调节是植物生存和作物生产必不可少的。二十世纪七十年代，育种家培育出植株矮化和抗倒伏的作物新品种，此品种的莖杆缩短，但是生物合成量不变，作物产量增加(参见Schwender etal.Biochem, 31673-80, 1996)。这些表型通常是由于赤霉素合成代谢或信号传导的相关基因突变引起的。因此，研究赤霉素生物合成途径基因的功能及其在作物改良中的应用具有
重要意义。根据赤霉素生物合成参与酶系的不同以及参与酶的细胞区隔化，将整个合成途径分为以下3个步骤:第一步发生在高等植物的原质体内；第二步发生在内质网上；第三步发生在细胞质内，在不同酶的氧化作用下转变为不同种类的GAs。赤霉素生物合成涉及多种酶的催化作用。其中，GA20-氧化酶催化生成了具有生物活性的GAs，因此，GA20-氧化酶是赤霉素生物合成途径最重要的限速酶(参见Croker et al.Plant Physiol, 94 (I) 194-200, 1990;Martin et al.Planta, 200(2) 159-66, 1996)，对 GA20-氧化酶基因的克隆和功能确认，并最终应用于农作物种质创新具有重要价值。
在模式植物拟南芥和主要农作物如水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zea mays L.)等中进行了该基因的分离和功能鉴定(参见Spielmeyer etal.PNAS, 999043-9048, 2002; Appleford et al.Planta, 223568-582，2006)，人们对该基因也有了进一步的了解。在许多植物中该酶是由多基因家族编码的，其氨基酸序列的同源性较低，家族的不同成员之间在表达上具有组织特异性。GA20-氧化酶基因的表达受到多种因素的调节。GA20-氧化酶基因在长日照下的转录水平高于短日照下的转录水平。当拟南芥从短日照转到长日照后，GA20-氧化酶活性增加。高温能促进GA20-氧化酶基因的表达，导致柑橘(Carrizo citrange)果实和叶片中有活性的GAl含量升高(参见Vidal et al.Planta, 217 (3) 442-8，2003)。GA20-氧化酶是典型的受负反馈调节的酶，在赤霉素生物合成突变体内转录水平非常高，而当外加活性GA处理时，GA20oxl的转录受到显著的抑制(参见Yamaguchi et al.PlantCell,102115-2126，1998;Thomas et al.Proc.Natl.Acad.Sc1., 964698-4703，1999)。通过有效操控GA20-氧化酶基因的表达可实现植物株型的改变。抑制GA20-氧化酶基因的表达能得到矮化或半矮化的转基因植株，解决了农作物高产和倒伏的矛盾(参见 Niki et al.Plant Physiol, 126 (3) 965-972, 2001; Sakamoto et al.NatBiotechnol,21909-913,2003;Xiao et al.Plant Growth Regul, 50179-189，2006)。而过量表达GA20ox能促进赤霉素的过量合成，导致单性结实、加快植株生长。例如，在番爺中过量表达该基因致单性结实，增加了果实产量(参见Garci a-Hurtado etal.J Exp Bot, 63 (16) 5803-13, 2012);在树木中的应用可使木质部纤维细胞的数量增多、纤维变长，最终增加了转基因植株的生物量(参见Eriksson et al.NatureBiotechnology, 18784-788，2000)。最新研究发现，GA20ox不仅参与植物株型的改变，还与植物抵抗病虫害有关。水稻0sGA20oX3超表达植株不仅表现出种子萌发快、节间伸长生长旺盛、早花、成熟植株株高增高等赤霉素超量合成表型，在接种稻痕菌(Magnaporthegrlsea.)和纹枯菌(Rhizoctonia solan)后发病级数显著高于野生型,说明0sGA20ox3作为一种负调控因子参与水稻幼苗对病原真菌的防卫反应(参见Oikawa et al.Plant MolBiol,55 (5)687-700, 2004;Qin et al.Mol Plant Microbe Interact, 26(2)227-39，2013)。由此可见，GA20ox在植物的生长发育中发挥重要的作用，利用转基因技术控制该基因的表达是改良作物品质的有效方法。花生是我国重要的油料作物之一，我国花生总产占全国油料作物总产量的1/2。然而，我国花生产业仍面临着十分严峻的问题，花生产量和含油量的进一步提高仍然是我国花生品种培育的最重要课题。加大生物技术在种质创新和品种培育中的力度是实现我国花生品种改良新飞跃的关键。然而，由于对花生重要农艺性状形成的分子机理知之甚少，花生的分子生物学研究也远落后于其他农 作物，为了促进花生在我国油料产业中发挥更重要的作用，缓解我国油料及食用油短缺的现状，必须加快推动花生的分子生物学研究进程，在理论上阐明决定高产、优质与抗逆性状的遗传与分子基础。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20oxl 与应用。一种花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。编码花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示的编码花生6八20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因。该载体可购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID N0.2导入载体，SP可获得含有SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的重组载体。一种重组细胞，含有上述编码花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因或者上述
重组载体。上述编码花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物品质中的应用。有益效果本发明首次发现了花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20oxl，通过构建AhGA20oxl过量表达载体转化烟草，研究转基因植株，确认了所克隆基因的功能。通过分析AhGA20oxl基因在花生不同组织以及在果针不同时期的表达差异，发现AhGA20oxl基因在花生生长发育过程中起重要作用；为阐明赤霉素影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术通过控制赤霉素创新作物新种质奠定了基础。
图1、荧光定量PCR分析AhGa20oxl在花生不同组织中的表达量的柱状图；其中:JS、幼年茎(15天)，AS、成年茎(40天)，几、幼年叶片(15天)，AL、成年叶片(40天)，JR、根，F、花，G0、未入土的果针，G3、入土 3天的果针，G9、入土 9天的果针，S、未成熟种子；图2、植物表达载体pCAMBIA2300_AhGa20oxl的构建过程示意图；图3、通过PCR分·子检测法，对AhGa20oxl转基因烟草的鉴定；其中:1_10、AhGa20oxl转基因烟草植株，经PCR显示为阳性，为转基因植株；11:阴性对照；M =Marker DL2000 (购自TaKaRa公司)；图4、转AhGA20oxl基因烟草与野生型烟草生长20天照片；其中:1:转AhGA20oxl基因烟草；WT:野生型烟草。
具体实施方案下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源:烟草品种SRl购自山东鲁生生物科技有限公司；鲁花14花生种子购自山东种业集团有限公司；农杆菌EHA105购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。花生品种的种植:选取种仁饱满、没有病虫害及霉变的花生籽粒作为种子。首先温水浸种2 4h，然后种植于直径15cm，深IOcm的花盆中。将花盆置于光照培养箱中，白天光照时间为16h，温度(25±0.3)°C，湿度为80%;夜晚黑暗时间8h，温度(20±0.3) °C，湿度为80%。一周左右子叶即可出土，在相应时间段进行样品采集。以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。实施例1:花生AhGa20oxl基因全长的克隆通过分析花生果针和荚果发育早期转录组高通量测序的信息，共查找到9条AhGa20oxl的Unigene。将短片段拼接成较长的基因片段，序列3’端缺失大概IOObp的序列，5’端缺失大概20bp左右的序列。通过5’ RACE和3’ RACE进行巢式PCR扩增，最终得到AhGa20oxl全长开放读码框。该基因长度1125bp，编码一种花生GA20-氧化酶，其编码374个氨基酸残基。所推导的蛋白质氨基酸序列与大豆GmGA20ox蛋白(XP_003555361.1)、拟南芥 AtGA20ox2 蛋白(NP_199994.1)的同源性分别为 82.2% 和 66.2%。5’ RACE,3' RACE 反应分别使用的是 TaKaRa 公司的 5’-Full RACE KitCTaKaRa Code:D315)、3’-Full RACE CoreSet Ver.2.0 (TaKaRa Code:D314)试剂盒。具体步骤如下:1.1花生RNA的提取:
(I)参照CTAB-LiCl法，称取0.2g新鲜花生组织(鲁花14)，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。(2)将研好的组织迅速转移至预热(65°C)的含有600μ I CTAB提取液的Ep管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。(3 ) 65 °C水浴2_5min，期间剧烈涡旋振荡3_5次。(4)冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)涡旋振荡lmin，混匀，4°C，12000rpm 离心 15min。(5)将上清转移到另一新的Ep管中，加入2μ I的DNase I，37°C水浴15min。(6)再加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)涡旋振荡lmin，混匀，4°C，12, OOOrpm 离心 15min。(7)将上清转移到另一新的Ep管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4 °C过夜沉淀。(8) 4°C, 12, OOOrpm 离心 20min,弃上清。(9)分别用70%乙醇、无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50 μ I DEPC-H2O,溶解沉淀。1.25’ RACE 获得基因 5’ 端:步骤参照5’-Full RACE Kit (TaKaRa Code:D315)试剂盒说明书。通过已知片段序列，利用olige6.0软件在此片段上设计与5’ RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对的基因特异性引物:
AhGA20oxl-5’race-outer:5’-CCAGTTCCCAAGGCGAGGTCAGGTT-3’ (SEQ ID N0.3)AhGA20oxl-5’race-1nner:5’-GCTCATCCCTAGAAGCTCCATTATCCCC-3’ (SEQ IDN0.4)使用TaKaRa LA Taq (TaKaRa Code:DRR02)进行巢式 PCR 反应。PCR 反应结束后，取10μ I的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认5’ RACE PCR扩增产物，AhGA20oxl的5’端得到大约230bp的条带，记作AhGA20oxl-5’。1.33’ RACE 获得基因 3’ 端:步骤参照3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (TaKaRa Code:D314)试剂盒说明书。通过已知片段序列，利用olige6.0软件在此片段上设计与3’ RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对的基因特异性引物:AhGA20oxl-3’race-outer:5’-CCTGACCTCGCCTTGGGAACTGGA-3’ (SEQ ID N0.5)AhGA20oxl-3’race-1nner:5’-AACGGAAGGACGATAAGAT-3’ (SEQ ID N0.6)使用TaKaRa LA Taq (TaKaRa Code:DRR02)进行 PCR 反应。PCR 反应结束后，取10 μ I的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3’ RACE PCR扩增产物，AhGA20oxl的3’端得到大约210bp的条带，记作AhGA20oxl_3’。1.4RACE扩增产物的切胶回收:电泳后切胶回收使用的是TaKaRa公司的TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa Code:9762)试剂盒,步骤参照说明书,制得回收的DNA片段 I (5，RACE 产物)、DNA 片段 2 (3，RACE 产物)。1.5 将回收的 DNA 片段 1、DNA 片段 2 分别连接 pMD 18_T Vector (TaKaRaCode:6011)载体，构建成 pMD18-T-AhGA20oxl_5’、pMD18-T-AhGA20oxl_3’。
连接体系如下:
a、B收WDNA片段I或_收的DNA片段2 4.5 μ
b、pMD18-T||体0.5μ1
C、Solution I5 μ!
总体积IOliI将上述a、b、c反应物混匀，16°C反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5a。1.6大肠杆菌感受态细胞的制备:(I)挑取E.coil DH5 a (购自天根生化科技有限公司)单菌落接种到约5ml的LB液体培养基，于37°C，250rpm震荡培养过夜。(2)次日将此菌液以lwt%的接种量转移至IOOml的LB液体培养基中，继续培养至吸光度OD6qq=0.4左右。(3)将此菌液冰浴lOmin，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4°C、5000rpm离心IOmin,收集菌体。(4)重悬于 IOml 预冷的 0.lmol/L 的 CaC12 中，冰浴 lOmin,4 °C、5000rpm 离心IOmin,收集菌体。(5)重悬于2ml (含15wt%甘油)的预冷的0.lmol/L的CaCl2中，分装成100 μ I/管，-70°C保存备用。1.7 转化:( I)从_70°C冰箱取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上溶解。(2)将10 μ I连接体系加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。(3) 42°C热激90s，在此过程中不要晃动离心管。(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min。(5)加入 600 μ I 的 LB 液体培养基，37°C，200rpm 孵育 lh。(6)将菌液涂布在氨苄霉素(Amp，50mg/L)抗性的LB固体平板上，37°C培养12h。(7)将平板放入4°C保存。1.8质粒的提取:(I)用灭菌的牙签挑取单克隆菌斑，放入添加氨苄霉素(Amp，50mg/L)的LB液体培养基中，于37°C，250rpm震荡培养过夜。(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体。(3)倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。(4)加入100 μ I预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液 I 配方为:50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.0)、10mmol/L EDTA (ρΗ8.0)。(5)加入200 μ I新鲜配制的溶液II，轻柔颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液 II 配方为:0.2mol/L NaOH、lwt%+二烷基硫酸钠(SDS)。
(6)加入150 μ I预冷的溶液III,轻柔地颠倒10次,冰浴5min, 4°C 12000rpm离心lOmin,其中所述溶液III配方为:5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H2028.5ml、ρΗ5.2ο(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(体积比为 25:24:1),反复混勻，4°C 12000rpm 离心 IOmin0(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(体积比为24:1),反复混勻，4°C 12000rpm 离心 IOmin0(9)将上清转移到干净的离心管中，加入等体积预冷(_20°C)的异丙醇，混匀后-20°C沉淀 Ih, 4。。12000rpm 离心 IOmin0(10)倒掉上清，加入500 μ 170%的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。(11)加入TE溶液和2 μ I RNaseA, 37°C消化0.5h，制得质粒。1.9质粒的酶切检测:(I)用pMD18-T载体两端的酶切位点BamH I ,Pst I对质粒进行双酶切酶切体系:
权利要求
1.一种花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.编码花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示的编码花生6々20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因。
4.一种重组细胞，含有权利要求2所述编码花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因或者权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求2所述编码花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因、权利要求3所述重组载体和/或权利要求4所述重组细胞在改良花生或其他经济作物品质中的应用。
全文摘要
本发明涉及花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用。一种花生GA20-氧化酶AhGA20ox1蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因与应用。本发明为阐明赤霉素影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术通过控制赤霉素创新作物新种质奠定了基础。
文档编号C12N5/10GK103255112SQ201310207109
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月29日 优先权日2013年5月29日
发明者王兴军, 王成祥, 侯蕾, 安静, 赵术珍, 夏晗, 赵传志, 李爱芹 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心