杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒。其中，该方法包括以下步骤：S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分型，构建种间个体的微卫星DNA指纹图谱；S2，采用多态性微卫星DNA引物对对待鉴定杨树进行基因型扩增，并根据微卫星DNA指纹图谱判断待鉴定杨树的亲缘关系；其中，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5。应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系。本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期。
【专利说明】杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学【技术领域】，具体而言，涉及一种杨属派间不同种亲缘关系 的鉴定方法及鉴定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 杨树（Populus )是北半球重要的森林树种，其种类丰富、分布广泛、速生高产，在工 业生产及环境保护等方面具有举足轻重的地位。我国处于世界杨树中心分布区域，据徐纬 英（1988)统计，我国独有的乡土杨树树种达53种之多，因此，丰富的遗传变异资源为杨树 遗传改良及群体进化遗传学研究等奠定了基础，同样也为我们对其更好的保护和利用提出 了挑战。然而，以无性繁殖为主要繁殖方式的杨树，目前同物异名、同名异物现象相当严重， 迫切需要建立一套准确、高效、稳定的种间鉴定技术。
[0003] DNA指纹图谱技术主要利用分子标记方法检测并比较种间个体基因组DNA水平的 遗传变异；不受组织、发育时期、季节环境限制，且遗传信息含量丰富、多态性高，适合于分 析杨树这样种类丰富、育种周期较长、应用价值高的植物群体。高质量的指纹图谱可为新品 种登记、注册和产权保护提供技术保障，也为实施杂交育种改良提供重要的理论依据。与表 型性状、染色体核型分析、同工酶分析等鉴定方法相比，借助于分子标记技术的DNA指纹图 谱技术为品种和无性系的鉴定提供了新的手段。
[0004] 目前，国内虽然已构建了部分杨树品种的AFLP指纹图谱(宋红竹，杨属AFLP遗传 多样性研究和杨树品种分子指纹图谱构建，2005)，但其供试材料数目较少，且AFLP技术操 作程序复杂，对DNA质量及其酶切条件要求较高，结果稳定性差。因此，限制了该技术构建 的指纹图谱广泛应用于种质鉴定。因此，在当今分子标记辅助选择育种策略逐渐被应用于 林木遗传改良的时代，建立一种高效、稳定、易操作的方法，显得十分迫切和必要。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒，以解决 现有技术中杨树种间个体鉴定方法复杂及稳定性差的技术问题。
[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种杨属派间不同种亲缘关 系的鉴定方法。该方法包括以下步骤：S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分 型，构建种间个体的微卫星DNA指纹图谱；S2,采用多态性微卫星DNA引物对对待鉴定杨树 进行基因型扩增，并根据微卫星DNA指纹图谱判断待鉴定杨树的亲缘关系；其中，多态性微 卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5，引物对1的碱基序 列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2 ;引物对2的碱基序列为SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4 ; 弓丨物对3的碱基序列为SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6;引物对4的碱基序列为SEQ ID NO: 7 和SEQ ID NO:8 ;引物对5的碱基序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10。
[0007] 进一步地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5'端采用荧光基团修饰，荧 光基团选自FAM、HEX或ROX中的一种。
[0008] 进一步地，步骤SI包括：提取各待鉴定杨树DNA，采用多态性微卫星DNA引物对分 别对各待鉴定杨树DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；将PCR扩增产物进行毛细电泳检 测，并将毛细电泳检测的结果进行聚类分析，构建微卫星DNA指纹图谱。
[0009] 进一步地，PCR扩增的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C 延伸lmin，35个循环，然后72°C延伸lOmin。
[0010] 进一步地，PCR扩增的体系为：多态性微卫星DNA引物对的浓度均为0. 3mol/ μ 1， 3·5μ 12 X PCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2·0μ I DNA 模板，无菌水补至10μ 1。 toon] 根据本发明的另一个方面，提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定试剂盒。该 试剂盒包括多态性微卫星DNA引物对，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、 引物对3、引物对4和引物对5,引物对1的碱基序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2 ;引物 对2的碱基序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 ;引物对3的碱基序列为SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6 ;引物对4的碱基序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 ;引物对5的碱基序列 为 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10。
[0012] 进一步地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5'端采用荧光基团修饰，荧 光基团选自FAM、HEX或ROX中的一种。
[0013] 进一步地，多态性微卫星DNA引物对进行PCR扩增的条件是：94°C预变性5min， 94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，35个循环，然后72°C延伸10min。
[0014] 进一步地，多态性微卫星DNA引物对进行PCR扩增的体系为：多态性微卫星DNA引 物对的浓度均为 〇· 3mol/μ 1，3· 5μ 12 XPCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2· 0μ 1 DNA模板，无菌水补至10 μ 1。
[0015] 应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA 引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲 缘关系。本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期，易于自动化，在杨树遗 传学研究、种质鉴定及品种保护等方面都有着广泛的应用前景，且部分引物扩增位点具有 杨树派的特异性(青杨派为218bp，黑杨派为179bp)，为林木进化遗传学研究以及杨树种间 鉴定提供了直接有力的技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0017] 图1示出了利用Multiplex Manager软件，根据片段长度设计出的引物组合；以及
[0018] 图2示出了扩增产物片段长度构建杨属派间不同种的微卫星DNA指纹图谱，引物 组的5对引物扩增片段大小从低到高依次对应图1中的Populus SSR PrimerOl-Populus SSR Primer05〇
【具体实施方式】
[0019] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0020] 本发明针对应用传统类型的指纹图谱进行种质鉴定稳定性差、实验操作复杂的不 足，提供了一种高效、便捷的对我国常见杨树种质进行亲缘关系鉴定的引物和方法，并构建 了杨树不同种的微卫星DNA指纹图谱，为后续的杨树种质鉴定及分子标记辅助育种提供了 重要的技术支持。
[0021] 微卫星DNA标记，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeat, SSR)是近些年 来发展良好，建立在聚合酶链式反应（PCR)扩增基础上的理想分子标记类型，其具有可靠性 强、实验重复性高、多态性丰富、种间转移性高及共显性等优点。特别是近几年借助高通量 测序技术，在植物中开发出多种不同类型的微卫星DNA标记，使利用微卫星DNA标记进行属 内近缘种的遗传多样性分析、指纹图谱构建、及亲缘关系鉴定等方面具有重要的发展潜力。 本发明的杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法和鉴定试剂盒正是基于此研发出来的。另 夕卜，本发明中引物的开发还参考了文献（Du等，DNA Research (2013) 20, 31-44)和公共数据 库（http://www. ornl. gov/sci/ipgc/ssr_resource. htm)〇
[0022] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方 法。该鉴定方法包括以下步骤：S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分型，构 建种间个体的微卫星DNA指纹图谱；S2,采用所述态性微卫星DNA引物对待鉴定杨树进行 基因扩增，并根据微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系；其中，多态性微卫星 DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5，引物对1的碱基序列 为 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ;引物对 2 的碱基序列为 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ;弓I 物对3的碱基序列为SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6;引物对4的碱基序列为SEQ ID NO: 7和 SEQ ID N0:8;引物对5的碱基序列为SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10,具体序列及扩增片段 大小如表1所示。
[0023] 应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA 引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲 缘关系。本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期，易于自动化，在杨树遗 传学研究、种质鉴定及品种保护等方面都有着广泛的应用前景。
[0024] 优选地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5'端采用荧光基团修饰，荧光 基团为选自FAM、HEX或ROX中的一种，在氩激光照射下FAM、HEX或ROX分别会显示蓝色、绿 色、和红色，用于区分不同的PCR产物，这样可以得到带有不同荧光标记的扩增结果，有利 于对电泳结果分析。在本发明的一种实施方式中，上述5对引物的修饰如表1中所示。
[0025] 表 1
[0026]
【权利要求】
1. 一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分型，构建种间个体的微卫星DNA指 纹图谱； S2,采用所述多态性微卫星DNA引物对对待鉴定杨树进行基因型扩增，并根据所述微 卫星DNA指纹图谱判断所述待鉴定杨树的亲缘关系； 其中，所述多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和 引物对5,所述引物对1的碱基序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;所述引物对2的碱基 序列为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4 ;所述引物对3的碱基序列为SEQ ID N0:5和SEQ ID NO: 6 ;所述引物对4的碱基序列为SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8 ;所述引物对5的碱基序列 为 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10。
2. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述多态性微卫星DNA引物对中的正 向引物的5'端采用荧光基团修饰，所述荧光基团选自FAM、HEX或R0X中的一种。
3. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括： 提取各待鉴定杨树DNA， 采用所述多态性微卫星DNA引物对分别对各所述待鉴定杨树DNA进行PCR扩增，得PCR 扩增产物； 将所述PCR扩增产物进行毛细电泳检测，并将所述毛细电泳检测的结果进行聚类分 析，构建所述微卫星DNA指纹图谱。
4. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件是：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35 个循环，然后 72°C延伸 lOmin。
5. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：所述多态性 微卫星 DNA 引物对的浓度均为 0· 3πιο1/μ 1，3· 5μ 12XPCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix, 2· 0 μ 1 DNA模板，无菌水补至10 μ 1。
6. -种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定试剂盒，其特征在于，包括多态性微卫星DNA 引物对，所述多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物 对5,所述引物对1的碱基序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;所述引物对2的碱基序列 为SEQIDN0:3和SEQIDN0:4;所述引物对3的碱基序列为SEQIDN0:5和SEQIDN0:6 ; 所述引物对4的碱基序列为SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8 ;所述引物对5的碱基序列为SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10。
7. 根据权利要求6所述的鉴定试剂盒，其特征在于，所述多态性微卫星DNA引物对中的 正向引物的5'端采用荧光基团修饰，所述荧光基团选自FAM、HEX或R0X中的一种。
8. 根据权利要求6所述的鉴定试剂盒，其特征在于，所述多态性微卫星DNA引物对进行 PCR扩增的条件是：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，35个循 环，然后72°C延伸10min。
9. 根据权利要求6所述的鉴定试剂盒，其特征在于，所述多态性微卫星DNA引物 对进行PCR扩增的体系为：所述多态性微卫星DNA引物对的浓度均为0. 3mo 1 / μ 1， 3·5μ 12 XPCRQIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2·0μ 1 DNA模板，无菌水补至 10μ 1。
【文档编号】C12Q1/68GK104293887SQ201310298553
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 杜庆章, 潘炜 申请人:北京林业大学