以杨树纤维素合酶基因为靶基因的五个microRNA基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了以杨树纤维素合酶基因为靶基因的五个microRNA基因及应用。本发明的miRNA为具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5所示序列的miRNA；miRNA在植物中具有特定的表达部位，影响植物特定部位的纤维素合成；将miRNA的前体基因或者成熟miRNA直接放入表达载体中，转化至植物后可在植物体内形成有颈环结构的前体，然后被加工修饰形成成熟miRNAs，进而抑制或影响基因的表达，达到对基因进行修饰的目标。
【专利说明】以杨树纤维素合酶基因为靶基因的五个microRNA基因及 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体而言，涉及以杨树纤维素合酶基因为靶基因的五 个microRNA基因及应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNAs (miRNAs)是近年来在真核生物中发现的一类内源性的具有调控作用 的非编码RNA，其核苷酸大小长约20?25。miRNA在细胞内具有多种重要的调节作用，是 一类重要的基因表达调控因子，通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合，从而 抑制蛋白质的翻译；在植物中，其还可以降解mRNA，对靶基因转录后起反向调控作用。随着 miRNA调控基因表达研究的逐步深入，有助于理解1?等真核生物基因组的复杂性和复杂的 基因表达调控网络。
[0003] 木材是自然界最为重要的可再生资源，通过生物转化成乙醇，可替代石油做液体 燃料，同时也是纸浆造纸的重要原料。并且具有重要的生态价值，它是大气碳元素长期的 沉淀池，是实现生物圈各种物质循环的关键环节。木材形成是一个关键的发育过程，具有 重要的科学研究意义与应用价值。随着各种新的基因组技术在林木研究中的应用，以及模 式植物的基因组序列公布后，对木材形成的分子和遗传调控机理已有了较广泛的认识。近 年来，一系列与木材形成相关基因被发现，同时部分功能也得到揭示。研究人员通过直接 克隆鉴定、miRNA芯片分析和测序技术等方法发现和次生细胞壁形成、木材形成过程及组 织特异性表达的 miRNAs。Lu 等（Lu S，Sun YH，Shi R，Clark C，Li L，Chiang VL(2005a) Novel and mechanical stress-responsive MicroRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis.Plant Celll7:2186_2203)通过应力木系统发现了与木 材形成相关的多个miRNAs，其中miR160、miR167和miR408在应力木木材形成过程中发 挥重要作用，证实了 miRNA在木材形成过程中起着重要作用。并且还有研究发现miR159 可通过靶向调节与赤霉素转录调节有关的GAMYB5家族的MYB33和MYB65在内的多个靶 基因调节赤霉素通路（Achard P，Herr A，Baulcombe DC，Harberd NP(2004)Modulation of floral development by a gibbere11 in-regulated microRNA. Development131:335 7-3365;Jover-Gil SjCandela HjPonce MR(2005)Plant microRNAs and development. The International journal of developmental biology49:733-744)，而赤霉素在植物 茎的伸长和木材形成过程中起重要作用，这样miR159是否通过赤霉素及其相关基因调节 木材形成过程值得深入研究。而miR408在应拉木形成过程中显著差异表达，可能抑制木 质素的分布继而影响应力木的形成。miR166已经被证明通过抑制调节HD-ZIP III转录 因子在木材形成过程中起调节作用（Ko JH，Prassinos C，Han KH(2006)Developmental and seasonal expression of PtaHBlj a Populus gene encoding a class III HD-Zip protein, is closely associated with secondary growth and inversely correlated with the level of microRNA(miR166). The New phytologistl69:469-478;Lu SjSun YH, Shi R, Clark C, Li L,Chiang VL(2005a)Novel and mechanical stress-responsive MicroRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis. Plant Celll7: 2186-2203)，同时研究发现Ptr-miR397a能够负调控漆酶来调控杨树木质素生物合成 (Lu S, Li Q, Wei H, et al.Ptr-miR397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2013)〇
[0004] 多项研究表明miRNAs在木材形成过程中起着重要调节作用，虽然在杨树中多个 miRNA陆续被发现和鉴定，但其确切功能和调控机制还未被阐释清楚，仍然值得深入研究。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供以杨树纤维素合酶基因为靶基因的五个microRNA基因及应用， 明确了纤维素生物合成过程中miRNA调控机制。
[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种分离的miRNA，该miRNA 选自：
[0007] ⑴miRNA是：SEQIDN0:l所示序列的miRNA;SEQIDN0:2所示序列的miRNA ;SEQ ID N0:3所示序列的miRNA;SEQ ID N0:4所示序列的miRNA;或者SEQ ID N0:5所示序列的 miRNA ；
[0008] (ii)与⑴限定的任一序列互补的miRNA ;或
[0009] (iii)与（i)或（ii)限定的任一序列有0?5个碱基差异的miRNA。
[0010] 进一步地，上述miRNA分离自杨柳科植物。
[0011] 进一步地,上述杨柳科植物是毛白杨。
[0012] 根据本发明的另一方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，该前体 miRNA能在植物细胞内剪切并表达成上述的miRNA;表达成SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA 的前体miRNA具有SEQ ID N0:6所示序列；表达成SEQ ID N0:2所示序列的miRNA的前体 miRNA具有SEQ ID NO: 7所示序列；表达成SEQ ID NO: 3所示序列的miRNA的前体miRNA具 有SEQ ID N0:8所示序列；表达成SEQ ID N0:4所示序列的miRNA的前体miRNA具有SEQ ID N0:9所示序列；表达成SEQ ID N0:5所示序列的miRNA的前体miRNA具有SEQ ID N0:10 所示序列。
[0013] 根据本发明的又一方面，提供了一种分离的纤维素合酶基因，该纤维素合酶基因 是上述miRNA的靶基因，其中，对应于SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的 序列为SEQ ID NO: 11;对应于SEQ ID N0:2所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为 SEQ ID NO: 12;对应于SEQ ID N0:3所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO: 13;对应于SEQ ID N0:4所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO: 12; 对应于SEQ ID N0:5所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:15。
[0014] 根据本发明的又一方面，提供了一种分离的或人工构建的多核苷酸，该多核苷酸 的序列是上述前体miRNA序列的DNA序列。
[0015] 进一步地，上述多核苷酸的结构如式I所示：Seqirt-X-Seqi^S I，其中，Seq1向为 在植物细胞中表达成权利要求1的miRNA的核苷酸序列，Seq &@为与Seq正向基本上互补 的核苷酸序列；或者Seq&@为在植物细胞中表达成权利要求1的miRNA的核苷酸序列，Seq I向为与基本上互补的核苷酸序列；X为位于间的间隔序列，并且 间隔序列与Seq1^1和S eq&@不互补；且式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示 的二级结构：
【权利要求】
1. 一种分离的miRNA，其特征在于，所述miRNA是： SEQ ID N0:1所示序列的miRNA ; SEQ ID N0:2所示序列的miRNA; SEQ ID N0:3所示序列的miRNA; SEQ ID N0:4所示序列的miRNA;或者 SEQ ID N0:5所示序列的miRNA。
2. 根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA分离自杨柳科植物。
3. 根据权利要求2所述的miRNA，其特征在于，所述杨柳科植物是毛白杨。
4. 一种分离的或人工构建的前体miRNA，其特征在于，所述前体miRNA能在植物细胞内 剪切并表达成权利要求1所述的miRNA ; 表达成所述SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA的所述前体miRNA具有SEQ ID NO:6所示 序列； 表达成所述SEQ ID NO: 2所示序列的miRNA的所述前体miRNA具有SEQ ID NO: 7所示 序列； 表达成所述SEQ ID NO: 3所示序列的miRNA的所述前体miRNA具有SEQ ID NO: 8所示 序列； 表达成所述SEQ ID NO: 4所示序列的miRNA的所述前体miRNA具有SEQ ID NO: 9所示 序列； 表达成所述SEQ ID NO: 5所示序列的miRNA的所述前体miRNA具有SEQ ID NO: 10所 示序列。
5. -种分离的纤维素合酶基因，其特征在于，所述纤维素合酶基因是权利要求1所述 的miRNA的靶基因，其中， 对应于所述SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO:11 ； 对应于所述SEQ ID N0:2所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO:12 ； 对应于所述SEQ ID N0:3所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO:13 ； 对应于所述SEQ ID N0:4所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO:12 ； 对应于所述SEQ ID N0:5所示序列的miRNA的纤维素合酶基因的序列为SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO:15。
6. -种分离的或人工构建的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列是权利要求 4所述的前体miRNA序列的DNA序列。
7. 如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的结构如式I所示： Seq正向-X-Seq反向式I，其中， 所述Seqj^为在植物细胞中表达成权利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，所述Seq& @为与所述Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者 所述Seq&@为在植物细胞中表达成权利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，所述SeqE @为所述与seq&@基本上互补的核苷酸序列； X为位于所述Seqtt和所述5叫_之间的间隔序列，并且所述间隔序列与所述Seqtt 和所述Seq&@F互补；且 所述式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式Π所示的二级结构：
Seq^fispSeq^iii]和X的定义如上述，| |表不在Seq^fji]和Seq&t；i)之间的基本互补的关系。
8. -种抑制目的基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括步骤： 将权利要求6所述的多核苷酸导入到植物细胞中； 通过剪切目的基因或者抑制基因翻译的方式来抑制所述目的基因的表达。
9. 一种用于制备抑制或者调节目的基因表达的组合物，其特征在于，所述组合物包括 权利要求1所述的miRNA。
10. -种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1所述的miRNA或权利要求6所述 的多核苷酸。
【文档编号】C12N15/63GK104293784SQ201310298637
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 陈金辉, 王博文 申请人:北京林业大学