一种大豆tps类酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大豆TPS类酶及其编码基因与应用。本发明大豆TPS类酶GmGES，具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。该基因的开放阅读框具有SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列。本发明首次从大豆基因组中克隆得到一种大豆TPS类酶的编码基因GmGES。并验证了该基因的功能。利用植物表达载体，将本发明的GmGES基因导入植物细胞，可获得抗虫转基因植株。过量表达本发明GmGES基因的烟草与空载烟草相比，其抗虫性显著提高，说明GmGES基因在提高植物抗虫性方面起着重要作用。
【专利说明】—种大豆TPS类酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大豆TPS类酶及其编码基因与应用。
【背景技术】 [0002]在当今的农业生产中，虫害是严重制约农作物优质、高产高效的重要原因之一。虫害不单单影响作物的生长发育，甚至在作物收获存储运输过程当中，都会遭遇到不同害虫程度不同的伤害。大豆[Glycine max (L.)Merr.]作为一种重要的粮食及经济作物，多种害虫能够严重影响其产量和品质。传统防治方法就是使用化学药剂农药或者施用生物方面的杀虫剂，在杀死害虫的同时也会对有益动物以及害虫的天敌产生伤害，严重时也会杀死它们，一定程度上对生态平衡造成了破坏，同时对人、畜、禽等也会有毒害。
[0003]目前，提高作物抗虫性的重要方法之一是通过基因工程技术。研究表明挥发性的萜类化合物在植物与植食性昆虫之间的关系中起着相当重要的作用，多数萜类化合物对植食性昆虫具有驱避、拒食和毒杀作用(Schnee et al.2006)。職类合酶(terpene synthase,TPS)是萜类化合物合成途径中的关键酶，催化萜类化合物合成的最后一步反应。单萜合酶随后在拟南芥、水稻、番茄、金鱼草、烟草等植物中克隆出来。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种大豆TPS类酶。
[0005]本发明的另一目的是提供编码该大豆TPS类酶的基因。
[0006]本发明的又一目的是提供该TPS类酶的应用。
[0007]本发明的目的通过如下技术方案实现:
[0008]一种大豆TPS类酶GmGES，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0009]编码所述的大豆TPS类酶GmGES的基因GmGES。
[0010]该基因的开放阅读框具有SEQ ID N0.1所示的DNA序列。
[0011]含有所述的大豆TPS类酶GmGES编码基因GmGES的表达载体。
[0012]所述的表达载体优选将SEQ ID N0.1所示的大豆TPS类酶GmGES编码基因GmGES利用gateway技术插入植物表达载体pMDC83得到的植物过量表达载体pMDC83_GmGES。
[0013]使用GmGES构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进彳丁加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(⑶S基因、蛮光素酶基因等)或抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0014]含有所述大豆TPS类酶编码基因GmGES的工程菌。
[0015]所述的工程菌优选将所述的大豆TPS类酶编码基因GmGES转入根癌农杆菌EHA105所得。
[0016]扩增所述大豆TPS类酶编码基因GmGES的引物，正向引物序列为SEQ ID N0.3，反向引物序列为SEQ ID N0.4。
[0017]所述的大豆TPS类酶GmGES在培育抗虫植物中的应用。
[0018]所述的大豆TPS类酶编码基因GmGES在培育抗虫植物中的应用。
[0019]有益效果
[0020]本发明首次从大豆基因组中克隆得到一种大豆TPS类酶的编码基因GmGES。并验证了该基因的功能。利用植物表达载体，将本发明的GmGES基因导入植物细胞，可获得抗虫转基因植株。过量表达本发明GmGES基因的烟草与空载烟草相比，其抗虫性显著提高，说明GmGES基因在提高植物抗虫性方面起着重要作用。本发明的GmGES对培育抗虫农作物，减少虫害对农作物产量的影响特别是对大豆产量的影响具有重要意义。
[0021]携带有本发明GmGES的植物表达载体可通过使用Ri质粒、Ti质粒、植物病毒载体、显微注射、直接DNA转化、农杆菌介导、电导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物，也可以是烟草、大豆、苜蓿、黄瓜、番茄、杨树、草坪草等双子叶植物。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图lpMDC83的质粒图谱。
[0023]图2含有GmGES的植物表达载体的部分结构示意图。
[0024]图3转基因烟草PCR鉴定电泳图。泳道1:CK，以转入空载的烟草DNA为模板(阴性对照)；泳道2:P,以植物表达载体pMDC83-GmGES质粒为模板(阳性对照)；泳道3_16:1_14，以各个转基因植株DNA为模板。
[0025]图4转基因烟草RT-PCR鉴定电泳图。泳道1:CK，以转入空载的烟草RNA为模板(阴性对照)；泳道2:P,以植物表达载体pMDC83-GmGES质粒为模板(阳性对照)；泳道3_10:1-8，以各个转基因植株RNA为模板。
[0026]图5转GmGES烟草株系与空载烟草的叶片对斜纹夜蛾进行双向选择饲喂，12小时后评价其偏向性因子。A:双向选择饲喂12小时后的的叶面情况；B:斜纹夜蛾对转GmGES烟草株系与空载烟草叶片的偏向性因子计算结果示意图，*，P < 0.05 ;**，P < 0.01。
[0027]图6转GmGES烟草株系与空载烟草的叶片对斜纹夜蛾进行强迫饲喂试验，24小时后计算其相对生长率。A:转GmGES烟草株系与空载烟草喂养虫子24小时之后的叶面情况；B --转GmGES烟草株系与空载烟草的叶片分别饲喂24小时后斜纹夜蛾的相对生长率结果示意图，*，P ≤ 0.05 ;**，P ≤ 0.01。
【具体实施方式】
[0028]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0029]下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0030]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
[0031]下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。[0032]实施例1大豆GmGES及其编码基因GmGES的cDNA克隆与鉴定
[0033]实验材料为栽培大豆品种“南农99-10”，由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供，材料种植于网室，常规田间管理。
[0034]参照苜蓿单萜合酶基因(GeneBank数据库中的登录号为AY766248)的序列信息和大豆基因组数据库(http: //www.phytozome.net/soybean ),利用生物信息学的方法进行分析，设计引物，进行大豆单萜合酶基因GmGES的克隆，。具体方法如下:
[0035]GmGES 基因 ORF 正向引物 P1: ‘ 5-CAAGAAGCTGCTAGAGGAAGT-3 ’ (SEQ ID N0.3)
[0036]GmGES 基因 ORF 反向引物 P2: ‘5-ATAGTTCAAATGCCTAGTCTC-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0037]取大豆材料“南农99-10”嫩叶片，置于液氮中研碎，RNA提取依据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction kit DP417进行。cDNA第一链合成依据TaKaRa试剂公司 cDNA 第一链合成试剂盒 TaKaR a PrimeScript?lst strand cDNA Synthesis KitD6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，用上述引物对进行PCR扩增反应。20 μ I PCR 反应体系为:0.8μ I cDNA第一链(0.05μ g)、L 6μ I 引物(SEQ ID N0.3 和 SEQID N0.4，5μ Μ)、2μ 110XPCR 缓冲液、1.6μ I Mg2\l.6 μ I dNTP 和 0.5U ExTaq DNA 聚合酶，用超纯水补足20 μ I。反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，其程序为95°C变性5min;再 94°C 30sec,53°C 40sec,72°C 2min，共 30 个循环；然后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存。PCR产物回收后经连接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5 α、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析结果表明PCR产物具有SEQ ID N0.1所示的0RF，命名为GmGES，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038]实施例2转GmGES基因烟草的获得
[0039]利用Invitrogen 公司的Gateway? Technology with Clonase?II 试剂盒，将实施例I克隆的GmGES正向插入到表达载体pMDC83(图1)中，转化大肠杆菌DH5 α，转化液涂布于含50mg/L潮霉素+50mg/L卡那霉素`的LB固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后，提取质粒，得到pMDC83-GmGES植物过量表达载体(图2)。用冻融法分别将pMDC83_GmMGES和空载质粒PMDC83转入根癌农杆菌菌株EHA105 (Biovector C0.,LTD)中。pMDC83_GmGES和pMDC83分别通过农杆菌EHA105介导转化烟草，提取转基因烟草的基因组DNA作为模板，以空载作为阴性对照，pMDC83-GmGES质粒作为阳性对照，用目的基因内部引物进行PCR初步鉴定阳性转基因烟草，方法如下:
[0040]设计目的基因内部引物P3:SEQ ID N0.5和P4:SEQ ID N0.6进行PCR扩增，10 μ IPCR反应体系为:5yL mix，上、下游引物(5pmol)各lyL，模板2yL (大约含0.03yg)，加CldH2Ol μ L0 其程序为 95°C变性 4min;再 94°C 40sec,56°C lmin,72°C lmin，共 30 个循环；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR鉴定结果见图3。
[0041]用目的基因内部引物上游引物+GFP下游引物进行RT-PCR对阳性转基因烟草二次鉴定，方法如下:
[0042]用目的基因内部引物上游引物P3:SEQ ID N0.5和GFP下游引物P5:SEQ IDN0.7，以转基因烟草RNA为模板进行RT-PCR扩增，10 μ I PCR反应体系为:5 μ L mix，引物(5pmol)各I μ L，模板2μ L(大约含0.03 μ g),加ddH201 μ L。其程序为95°C变性5min;再94°C 50sec,56°C 90sec,72°C lmin，共 30 个循环；然后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存。RT-PCR鉴定结果见图4。[0043]实施例3GmGES基因的功能验证
[0044]剪取同一生长时期的转基因和空载对照烟草植株的叶片，测定其面积后分别放于瓷盘两端，然后将10头斜纹夜蛾(购于江苏省农科院)置于瓷盘中间区域，让其自由选择取食，12小时后，分别测对照和转基因烟草叶片剩余面积并记录虫子的分布情况。计算对照叶片损失面积(C)和转基因叶片损失面积(T)及偏向性因子(Preference indece, PI),PI=2T/ (T+C)。当PI=I时，虫子对对照叶片和转基因叶片的选择无偏向性；当PI>1时，虫子偏向于啃食转基因叶片；iPI〈l时，虫子偏向于啃食对照叶片，此时说明转基因叶片与对照相比有较高抗性。图5A显示自由取食12小时后转基因烟草和对照烟草的叶片损失情况；图5B显示不同实验组中斜纹夜蛾的偏向性因子。
[0045]用阳性转GmGES基因烟草株系和转pMDC83的空载烟草的叶片同时饲喂斜纹夜蛾，将不同转基因烟草株系叶片和转空载的烟草叶片分别放在各个培养皿中，每个培养皿放5头虫子，喂养前称取5头虫子的总重量为Wl, 24小时之后,再称取5头虫子的重量为W2.计算虫子的相对生长率RGR(Relative growth rate) = (W2_Wl)/Wl,结果见图6B。转GmGES烟草株系与空载烟草的叶片同时饲喂斜纹夜蛾24小时后叶片情况见图6A。
[0046]结果可见: 转基因烟草对斜纹夜蛾有明显的趋避作用，用转基因烟草叶片饲养的斜纹夜蛾生长率显著低于用空载烟草叶片饲养斜纹夜蛾生长率，说明转基因株系与空载烟草相比抗虫性显著提高，过量表达GmGES基因能提高转基因烟草的抗虫性。
【权利要求】
1.一种大豆TPS类酶GmGES，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述的大豆TPS类酶的基因GmGES。
3.根据权利要求2所述的基因GmGES，其特征在于该基因具有SEQID N0.1所示的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述基因GmGES的表达载体。
5.根据权利要求4所述的含有基因GmGES的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将SEQ ID N0.1所示的大豆TPS类酶编码基因GmGES开放阅读框利用gateway技术插入植物表达载体PMDC83得到的植物过量表达载体pMDC83-GmGES。
6.含有权利要求2或3所述大豆TPS类酶GmGES编码基因GmGES的工程菌。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于所述的工程菌是将权利要求2或3所述的大豆TPS类酶GmGES编码基因GmGES转入根癌农杆菌EHA105所得。
8.扩增权利要求3所述基因的引物，其特征在于正向引物序列为SEQID N0.3，反向引物序列为SEQ ID N0.4。
9.权利要求1所述的大豆TPS类酶GmGES在培育抗虫植物中的应用。
10.权利要求2或3所述的基因GmGES在培育抗虫植物中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103667229SQ201310307108
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】喻德跃, 刘建雨, 王慧 申请人:南京农业大学