一株产l-氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明阐述了一株产L-氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法及其应用，属于基因工程与酶学品领域，将重组产生的L-氨基酸氧化酶包涵体进行蛋白变性、复性和浓缩，使蛋白包涵体恢复活性;蛋白表达量最佳诱导条件为37℃，IPTG0.5mmol/L诱导5h；通过对重组酶的酶学性质研究，发现重组酶最适pH8.0，最适温度45℃，外源添加FAD对酶活力没有影响；结合酶学特征，将重组酶添加到含有10g/L的谷氨酸钠pH8.0的缓冲液中，45℃转化6h可以生成5.3g/L的α-酮戊二酸，转化率达到50％以上。
【专利说明】一株产L-氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程及酶学领域中一种生产L-氨基酸氧化酶的重组菌株及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]L-氨基酸氧化酶是一种黄素蛋白酶，能立体特异性氧化L-氨基酸脱氨，生成对应的α -酮酸、氨和过氧化氢，并伴随氧气的消耗。能被应用于L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸的拆分和α-酮酸的制备。近年来，有文献报道了 L-氨基酸氧化酶具有抗菌、杀虫、抗病毒等生物活性，还具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，其在生物医药领域具有广阔的应用前景。
[0003]研究发现L-氨基酸氧化酶广泛分布于蛇科动物中，后来发现在细菌Rhodococusopacus、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Bacillus carotarum 及一些海洋微生物中，不同物种来源的L-氨基酸氧化酶底物差异性较大，有些作用于几种甚至十几种氨基酸，有些只作用于一种氨基酸，等电点、稳定性等理化性质不尽相同，基因序列也有差异，生理及生物活性不一样，结构也不尽相同。
[0004]目前为止，只有很少的L-氨基酸氧化酶异源表达的报道，2003年，第一个L-氨基酸氧化酶细菌异源表达系统被报道，研究人员将浑浊红球菌L-氨基酸氧化酶基因序列克隆到大肠杆菌中，发现在大肠杆菌表达系统中获得了大量的包涵体。之后也有一些异源表达的报道，虽然L-氨基酸氧化酶的异源表达是一大挑战，不过还是有成功潜力的，利用生物信息学方法仪器突变技术，选择合适的表达载体与系统，有望极大的提高L-氨基酸氧化酶异源表达成功率。
[0005]L-氨基酸氧化酶催化L-氨基酸生成α -酮酸的开发是值得关注的，可以用L-氨基酸氧化酶的高选择性来生产有较高生物医药价值的α -酮酸，酶法转化法具有操作简单、条件温和、高选择性、高效、无毒、无污染等优点。目前关于利用L-氨基酸氧化酶催化谷氨酸生产α-酮戊二酸的方法国内外尚无报道，因此利用这种方法生产α-酮戊二酸对环境不会有太大影响，具有很高的市场应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种重组生产L-氨基酸氧化酶菌株的构建方法，及重组酶的性质和应用。
[0007]本发明的技术方案:
[0008]1.将来自于Rhodococus opacus DSM43250菌株的L-氛基酸氧化酶基因(NCBI序列号:AY053450.1)提取出来与表达载体pET28a(重组蛋白形成于胞内)连接，导入E.coliBL21中构建一株重组菌株。
[0009]重组菌株构建方法:1)将PCR得到的LAAO目的基因与载体pET28a用Nco I和HindIII酶切2h，然后连接10h，用转入大肠杆菌JM109中验证。2)将构建好的重组质粒转入表达菌株E.coli BL21中，得到重组菌株，转化方法包括化学转化法，电转法，冷冻法及结合转化法，并对构建好的菌株进行测序验证。
[0010]2.将构建好的重组菌株，0.4mM IPTG诱导表达4_6h，发现重组产生酶的是包涵体没有活性，蛋白大小为58KDa，蛋白经过复性，有30%的蛋白恢复了活性，蛋白电泳图谱如图1，蛋白复性过程如图2所示。
[0011]3.蛋白包涵体有易纯化、抵御胞内蛋白酶降解及减少杂质的优点，因此通过不同的诱导方法来提高诱导表达量，发现最佳培养温度37°C，0D_为0.5-0.6时添加0.4mmol/L的IPTG诱导培养5h，此时目的蛋白表达量达到最大。
[0012]4.对复性得到的L-氨基酸氧化酶进行生物化学特性研究，该酶最适Ph8.0，pH7-pH9之间活力保持在90%以上；最适温度45°C，在20-50°C下放置12h，酶活力在80%以上；重组酶底物特异性实验发现最适底物为L-鸟氨酸其次是L-半胱氨酸和L-丙氨酸，外源添加FAD对该重组酶活性没有影响。
[0013]5.将纯化获得的有活性的L-氨基酸氧化酶进行转化实验，以10g/L谷氨酸钠为转化底物，PH8.0磷酸盐缓冲液中45°C转化6h，可以得到α -酮戊二酸5.3g/L。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1诱导表达的重组谷氨酸氧化酶蛋白电泳图谱。
[0015]图2蛋白复性流程 图。
[0016]图3重组酶最适pH测定结果。
[0017]图4重组酶最适温度测定结果。
[0018]图5重组酶温度稳定性测定结果。
[0019]图6不同底物浓度对重组酶转化测定结果。
【具体实施方式】:
[0020]1.重组菌株的构建:
[0021]I)用引物 1:5 ' CATGCCATGGCATTGGCATTCACACGTAGATCTTT3 '和引物 2:5' CCCAAGCTTGGGCTTCCTGGGCCACGC3'将来自于Rhodococus opacus DSM43250 的基因组进行PCR扩增:体系中加入EX taq酶，95°C预处理3min，95°C解链30s，60°C退火30s，72°C延伸1.8min，30个循环;
[0022]2)用限制性内切酶Nco I和HindIII将目的基因和表达载体pET28a37°C酶切2h ；
[0023]3)用T4连接酶将酶切后的目的基因和质粒pET28al6°C连接IOh用化学转化法转入表达菌株E.coli BL21中，并涂布于含卡纳青霉素的LB平板中培养12h ；
[0024]4)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的一株菌株；将菌株接种于含有相应抗生素的LB培养基中37°C诱导5h，进行蛋白电泳，发现目的条带大小在58KDa如图1所示，并形成的是包涵体，没有活性。
[0025]2.包涵体的复性:
[0026]将构建好的重组菌株接种于LB培养基中，0D_为0.5-0.6之间时，加入0.4mmol/L IPTG37°C诱导5h，收集菌体超声破碎30min ;破碎后的细胞8000rpm离心30min，沉淀用缓冲液 20mM Tris-HCl, 2M urea, 2mM EDTA, ρΗ8.0 洗漆两次,8000rpm 离心 30min 倒掉上清液；沉淀用缓冲液20mM Tris-HCl,8M urea, IOuM FAD,50mM DTT溶解，4°C放置 15h ；8000rpm离心30min取上清液用缓冲液20mM Tris-HCl, 8M urea, IOuM FAD，50mMDTT稀释至蛋白浓度小于0.lmg/mL后，取20mL加入透析袋中，用缓冲液20mM Tris-HCl, IM NaCl于4°C流速
0.4mL/min逐步稀释40h ;将复性好的蛋白用超滤管浓缩至1_1.5mL，得到有活性的重组氨基酸氧化酶。
[0027]3.蛋白表达量实验
[0028]通过对诱导时间、诱导温度和IPTG添加量进行优化，发现最佳诱导条件为:IPTG0.5mmol/L、温度37°C诱导5h，目的蛋白表达量为1.36mg/mL，占到菌体总蛋白23%。
【权利要求】
1.一株产L-氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法，其特征如下: 1)将L-氨基酸氧化酶基因与质粒pET28a重组构建重组质粒，表达于E.coli BL21中构建一株重组菌株，具有产生L-谷氨酸氧化酶能力； 2)该菌株蛋白表达量经过优化最佳条件为温度30-37°C，添加IPTG0.3-0.5mmol/L诱导4-6h，目的蛋白含量达到总蛋白20%以上； 3)该菌株生产的L-氨基酸氧化酶是包涵体，没有活性。
2.根据权利要求1所述重组菌株产生的L-氨基酸氧化酶包涵体，经过蛋白变性，复性，浓缩，使30%以上的蛋白包涵体恢复活性。
3.根据权利要求2得到的具有活性的L-氨基酸氧化酶，其酶学性质如下: 1)最适pH范围为7.0-9.0 ； 2)最适温度为35-45°C，重组酶在20-50°C放置12h，酶的比活力保持在70%以上； 3)重组酶底最适底物为L-鸟氨酸其次是L-赖氨酸、L-丙氨酸,该重组酶底物范围较广； 4)外源添加FAD对重组酶的活力没有影响。
4.根据权利要求1和2得到的有活性的重组酶可以将L-谷氨酸和谷氨酸钠转化生成α -酮戊二酸，转化率大于50%，转化 条件:底物谷氨酸钠浓度为7.5-12.5g/L，pH7.0-9.0，35-45 °C 转化 6-8h。
【文档编号】C12P7/50GK103555642SQ201310309931
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】刘立明, 牛盼清, 董晓翔 申请人:江南大学