一种生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法，所述发酵培养基主要由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、50mg/ml卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成，按照各组培养液组成要求在蒸馏水中溶解并用氢氧化钠调节pH值，最后在发酵罐中灭菌即得。本发明采用的发酵培养基减轻了现有工艺发酵中对菌体生长和蛋白表达的抑制作用，使瑞替普酶大肠杆菌表达水平高，稳定性好，提高了瑞替普酶的产率。
【专利说明】一种生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法，属于微生物发酵 工程领域。
【背景技术】
[0002] 现今心脑血管疾病已是人类健康的最大威胁之一，患病人数逐年上升，而且发病 年龄也越发年轻化，田文静等在"乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达"（中国生 化药物杂志，2011，32 (5))-文中指出全世界每年心血管疾病患者多达1300万。在中国， 每年需要进行脑梗塞、心肌梗塞等血栓类疾病治疗的人数就上百万，因此研制和生产高效 的溶栓药就显得十分必要。赵友春等在"第三代溶血栓药物研究进展"（药学进展，2004， 28(2) : 72-75)中介绍到，目前溶栓药物已发展到第三代，具有快速溶栓，治愈率高，半衰期 长，副作用小等优点，在临床上具有较强的竞争性，但价格也比较昂贵，所以，生产出低成本 的溶血栓药物具有显著的经济效益和重大的社会意义。另外，赵友春等在"提高溶栓新药瑞 替普酶生产得率的中试研究"（化工科技，2003，11(1): 15-17)-文中报道，目前多数是 对瑞替普酶菌株的构建和复性纯化研究，而鲜有报道实际生产中是如何进行菌株工业化发 酵生产。现有技术中，瑞替普酶的工业生产中主要采用大肠杆菌进行培养，采用更有效的培 养技术来提高菌体的发酵密度，能够提供产物的产率，而选择合适的发酵培养基，不仅可以 减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资，从而降低生产成 本，极大地提高产品的市场竞争力。
【发明内容】
[0003] 因此，本发明的目的是提供一种用于生产瑞替普酶的培养基。
[0004] 本发明的另一目的是提供上述用于生产瑞替普酶的培养基的制备方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0006] 一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基，主要由KH2P04、K2HP04 ? 2H20、（NH4)2S04、 FeS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ?H20、Na2Mo04 ? 2H20、20% 酪蛋 白、MgS04、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和4〇组成，其中培养基的主要组 成为：
[0007]A液：每升H20 中含KH2P04 2 5-40g、K2HP04 ? 2H20 57. 5-80g、（NH4)2S04 17. 5-25. 8g、FeS04 ? 7H20 0? 008-0. 015g;
[0008]B液：每升4〇 中含CaCl2 .2H20 0? 8-1. 6g、CoCl2 .6H20 1. 60-2. 93g、CuS04.5H20 1. 5-2. 5g、FeS04 ? 7H20 1. 80-2. 87g、MnS04 ?H20 1. 0-1. 93g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 60-2. 67g;
[0009]C液：每升H20 中含 20% 酪蛋白 25. 0-42. 0ml、1MMgS04 1 6 . 0-37 . 0ml、50mg/ml 卡那霉素l〇. 0-23. 5ml、70% 葡萄糖 772. 5-867. 5ml、40%(NH4)2S04 80-120ml、5% 柠檬酸 L5-5. 0ml〇
[0010] 优选地，上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其中培养基的主要组成为：
[0011]A液：每升H20 中含KH2P04 30-35g、K2HP04 ? 2H20 62. 5-75. 0g、（NH4)2S04 20-23. 33g、FeS04 ? 7H20 0? 010-0. 013g;
[0012] B液：每升H20 中含CaCl2 ? 2H20 1. 0-1. 4g、CoCl2 ? 6H20 2. 0-2. 53g、CuS04 ? 5H20 1. 8-2. 2g、FeS04 ? 7H20 2. 0-2. 67g、MnS04 ?H20 1. 20-1. 73g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 80-2. 47g;
[0013]C液：每升4〇 中含 20% 酪蛋白 30. 0-37. 0ml、lMMgS04 21. 5-32 . 0ml、50mg/ml卡 那霉素13.0-20.01111、70%葡萄糖797-8431111、40%(順4) 2504 90-1101111、5%柠檬酸2.5-4.01111。
[0014] 更加优选地，上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其中培养基的主要组成为 ：
[0015]A液：每升4〇 中含KH2P04 3 2 . 50g、K2HP04 ? 2H20 68. 75g、（NH4)2S04 21. 67g、 FeS04 ? 7H20 0. 012g；
[0016]B液：每升H20 中含CaCl2 ? 2H20 1. 20g、CoCl2 ? 6H20 2. 27g、CuS04 ? 5H20 2. 0g、 FeS04 ? 7H20 2. 33g、MnS04 ?H20 1. 47g、Na2Mo04 ? 2H20 2. 13g;
[0017]C液：每升4〇 中含 20% 酪蛋白 33.33ml、lMMgS04 26 . 67ml、50mg/ml卡那霉素 16. 67ml、70% 葡萄糖 800ml、40% (NH4)2S04 1 00ml、5% 柠檬酸 3. 33ml。
[0018] 更加优选地，上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其中培养基的主要组成为 ：
[0019]A液：每升H20 中含KH2P04 33. 0g、K2HP04 ? 2H20 70. 0g、（NH4)2S04 22.Og, FeS04 ? 7H20 0.Ollg；
[0020] B液：每升H20 中含CaCl2 ? 2H20 1. 3g、CoCl2 ? 6H20 2. 3g、CuS04 ? 5H20 1. 9g、 FeS04 ? 7H20 2. 5g、MnS04 ?H20 1. 4g、Na2Mo04 ? 2H20 2.Og;
[0021] C液：每升4〇 中含 20% 酪蛋白 35ml、lMMgS04 28ml、50mg/ml卡那霉素 18ml、70% 葡萄糖 821ml、40%(NH4)2S04 95ml、5% 柠檬酸 3. 0ml。
[0022] 上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其中酵母提取物的浓度为12%-18%，每升 H20中含消泡剂为0. 3-0. 7ml。
[0023] 上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
[0024](1)A、B、C组分配制：
[0025]A液：1200ml，按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，在蒸馏水中溶解，用 氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml，即得；
[0026]B液：150ml，按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，在适量蒸馏水中溶解， 然后定容至150ml，即得；
[0027]C液：600ml，按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，其中70%葡萄糖加热 溶解后，单独在115°C下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外，充分混匀，然后在121°C下灭 菌20min，冷却后加入已灭菌的葡萄糖，混合均匀后，再加入卡那霉素，混匀，用蒸馏水补至 600ml，即得；
[0028] (2)酵母提取物配制：500ml，精确称取规定的重量份，在蒸馏水中溶解，配制成浓 度为12-18%的溶液，115°C下灭菌20min，即得；
[0029] (3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液，121°C下灭 菌20分钟，冷却至30°C时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml，混 匀，即得。
[0030]利用本发明的培养基，在重组大肠杆菌发酵过程中避免或减少了乙酸的生产，减 轻了现有工艺发酵中对菌体生长和蛋白表达的抑制作用，使瑞替普酶大肠杆菌表达水平 高，稳定性好，提高了瑞替普酶的单位产量，降低了生产成本，对大规模工业生产具有非常 重要的意义。
【具体实施方式】：
[0031] 下面结合实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0032] 制备实施例：
[0033] 下面制备实施例中制备各目的菌体的试剂所用的方法、仪器和操作方式均为本领 域常规的方法、仪器和操作方式，其中所用的各种试剂均为生化试剂、分析纯，购自普通试 剂公司，主要设备等来源如下表1所示：
[0034]表1
[0035]
【权利要求】
1. 一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其特征在于，由kh2po4、k 2hpo4 *2H20、 (NH4)2S04、FeS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ? H20、Na2Mo04 ? 2H20、 20%酪蛋白、MgS04、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和托0组成，其中主要组 成为： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 2 5-40g、K2HP04 ? 2H20 57. 5-80g、（NH4)2S04 1 7 . 5-25 . 8g、 FeS04 ? 7H20 0? 008-0. 015g ; B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 0? 8-1. 6g、CoCl2 ? 6H20 1. 60-2. 93g、CuS04 ? 5H20 1. 5-2. 5g、FeS04 ? 7H20 1. 80-2. 87g、MnS04 ? H20 1. 0-1. 93g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 60-2. 67g ; C 液：每升 H20 中含 20% 酪蛋白 25. 0-42. 0ml、lM MgS04 1 6 . 0-37 . 0ml、50mg/ml 卡那霉 素10.0-23.51111、70%葡萄糖772.5-867.51111、40%(順4)250 4 80-1201111、5%柠檬酸1.5-5.01111。
2. 根据权利要求1所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其特征在于：其中主要组 成为： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 30-35g、K2HP04 .2H20 62. 5-75. 0g、（NH4)2S04 20-23 . 33g、 FeS04 ? 7H20 0? 010-0. 013g ; B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 1. 0-1. 4g、CoCl2 ? 6H20 2. 0-2. 53g、CuS04 ? 5H20 1. 8-2. 2g、FeS04 ? 7H20 2. 0-2. 67g、MnS04 ? H20 1. 20-1. 73g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 80-2. 47g ; 〇液：每升1120中含20%酪蛋白 30.0-37.01111、1]\11%504 21.5-32 . 01111、5011^/1111卡那霉 素 13. 0-20. 0ml、70% 葡萄糖 797-843ml、40%(NH4)2S04 90-110ml、5% 柠檬酸 2. 5-4. 0ml。
3. 根据权利要求1或2所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其特征在于：其中主 要组成为： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 3 2 . 50g、K2HP04 ? 2H20 68. 75g、（NH4)2S04 21. 67g、 FeS04 ? 7H20 0. 012g ； B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 1. 20g、CoCl2 ? 6H20 2. 27g、CuS04 ? 5H20 2. 0g、 FeS04 ? 7H20 2. 33g、MnS04 ? H20 1. 47g、Na2Mo04 ? 2H20 2. 13g ; C液：每升1120 中含 20%酪蛋白 33. 33ml、lM MgS04 26 . 67ml、50mg/ml 卡那霉素 16. 67ml、 70% 葡萄糖 800ml、40%(NH4)2S04 1 00ml、5% 柠檬酸 3. 33ml。
4. 根据权利要求1或2所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其特征在于：其中各 组成为： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 33. 0g、K2HP04 .2H20 70. 0g、（NH4)2S04 22. 0g、FeS04.7H20 0. Ollg ； B 液：每升1120 中含 CaCl2 .2H20 1. 3g、CoCl2 .6H20 2. 3g、CuS04.5H20 1. 9g、FeS04.7H20 2. 5g、MnS04 ? H20 1. 4g、Na2Mo04 ? 2H20 2. Og ; C液：每升1120中含20%酪蛋白35ml、lM MgS04 28ml、50mg/ml卡那霉素18ml、70%葡萄 糖 82 lml、40% (NH4) 2S04 95ml、5% 柠檬酸 3. 0ml。
5. 根据权利要求1所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基，其特征在于：酵母提取物 浓度为12%_18%，每升H20中含消泡剂为0. 3-0. 7ml。
6. 权利要求1-5任一所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法，其特征在 于：具体制备步骤如下： (1)A、B、C组分配制： A液：1200ml，按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，在蒸馏水中溶解，用氢氧 化钠调节pH为7. 0,然后定容至1200ml，即得； B液：150ml，按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，在适量蒸馏水中溶解，然后 定容至150ml，即得； C液：600ml，按上述各组分的配比精确称取规定的重量份，其中70%葡萄糖加热溶 解后，单独在115°C下灭菌20min ;其余组分除卡那霉素外，充分混匀，然后在121°C下灭 菌20min，冷却后加入已灭菌的葡萄糖，混合均匀后，再加入卡那霉素，混匀，用蒸馏水补至 600ml，即得； (2) 酵母提取物配制：500ml，精确称取规定的重量份，在蒸馏水中溶解，配制成浓度为 12-18%的溶液，115°C下灭菌20min，即得； (3) 在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液，121°C下灭菌20 分钟，冷却至30°C时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml，混匀，即 得。
7.根据权利要求1所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法，其特征在于： 所述步骤中发酵罐容积为19L。
【文档编号】C12N9/48GK104342421SQ201310323514
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】窦啟玲 申请人:贵州益佰制药股份有限公司